一種光電化學(xué)三維紙芯片的制備及其在腫瘤檢測中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種光電化學(xué)三維紙芯片的制備方法及所述的光電化學(xué)傳感器測定樣品中六種腫瘤標(biāo)記物的方法。利用蠟打印技術(shù)在紙上制備疏水區(qū)域及親水區(qū)域，通過配置合適的油墨，在紙上印制相應(yīng)的參比電極和工作電極，再對工作區(qū)域進(jìn)行功能化，抗原識別；將制備好的紙芯片進(jìn)行折疊，構(gòu)成三電極體系，在反應(yīng)區(qū)域滴加含有抗壞血酸的緩沖溶液，在紫外燈的照射下，實(shí)現(xiàn)了待測物的高靈敏檢測。
【專利說明】-種光電化學(xué)三維紙芯片的制備及其在腫瘤檢測中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種光電化學(xué)分析檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地說是一種以適合于光電化 學(xué)分析的微流控紙芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)平臺的構(gòu)建。

【背景技術(shù)】
[0002] 近幾年來國民癌癥發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)逐步走高的趨勢，因此尋找快速、定量、靈 敏的檢測腫瘤標(biāo)記物的方法在早期檢測和治療監(jiān)控中非常重要。常見的臨床診斷途徑主要 有以下兩種：通過醫(yī)院中比較昂貴的大型的儀器分析設(shè)備進(jìn)行檢測；是通過掌上小型簡易 設(shè)備，實(shí)現(xiàn)快速靈敏的現(xiàn)場分析診斷。然而，在臨床檢測中單種腫瘤標(biāo)記物的檢測往往導(dǎo)致 檢測結(jié)果的假陽性，而多腫瘤標(biāo)記物的聯(lián)合檢測則可以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性， 因此我們所構(gòu)建的體系中也采用了多腫瘤標(biāo)記物的聯(lián)合檢測。
[0003] 隨著科技的快速發(fā)展，各種免疫傳感設(shè)備朝著簡單化、小型化、集成化的方向發(fā) 展，因此微流控紙質(zhì)分析設(shè)備越來越多的受到大家的關(guān)注。紙，作為這種分析設(shè)備的支撐， 具有廉價(jià)、儲量豐富、可折疊、可任意處置、放置時(shí)間長、易于儲藏等特點(diǎn)，因而常被使用作 為現(xiàn)場即時(shí)檢測的平臺。這種微流控紙芯片分析器件的工作原理如下：在紙芯片上繪制疏 水的蠟打印圖案，未繪制疏水圖案的部分借助于紙的毛細(xì)驅(qū)動力而構(gòu)成親水通道?；诖?原理可以在不使用額外的流動運(yùn)輸裝置下將生物、化學(xué)分析檢測過程引用到紙芯片上，實(shí) 現(xiàn)檢測的微型化及簡單化。此外，紙上光電化學(xué)免疫傳感器以其儀器設(shè)備簡單，電子檢測成 本低、靈敏度高、可批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)逐漸引起大家的關(guān)注。
[0004] 為了解決腫瘤標(biāo)記物在低濃度下便能進(jìn)行檢測的問題，信號放大策略變的尤為重 要。然而，單獨(dú)的紙芯片導(dǎo)電性非常差，且不具有信號放大的功效，如果在紙纖維上連接上 比表面積大、導(dǎo)電性及生物相容性好的金、銀、鉬等貴金屬納米粒子以及感光性納米材料如 氧化鋅、硫化鎘量子點(diǎn)等，那么我們所獲得的功能化的高通量微流控紙芯片分析器件便能 夠很好的實(shí)現(xiàn)信號放大，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)腫瘤標(biāo)記物的低含量檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是在微流控紙芯片上建立光電化學(xué)發(fā)光分析檢測方法。 進(jìn)一步構(gòu)建高通量的三維微流控紙芯片，并用于血清試樣中6種抗原含量的同時(shí)檢測。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過構(gòu)建一種新型的光電化學(xué)三維微流控紙芯 片來實(shí)現(xiàn)的，該光電化學(xué)三維微流控紙芯片的制備方法為： (1) 在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)如附圖1所示的光電化學(xué)三維微流控紙芯片的疏水蠟批量打印 圖案，放大后的樣式如附圖2所示； (2) 將紙片剪裁成常用A4大小的紙，將步驟（1)中設(shè)計(jì)的疏水蠟批量打印圖案打印到 A4紙上，隨后將帶有蠟圖案的A4紙放置到平板加熱器或烘箱中，在150 °C加熱2 min;使 蠟融化并浸透整個(gè)紙的厚度，形成疏水墻； (3) 采用絲網(wǎng)印刷的方法，將陣列工作電極、參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步 驟（2)中得到的紙上，最后所得的樣式如附圖3所示，其中左側(cè)為工作區(qū)，上面印刷有6個(gè) 工作電極，右側(cè)為參比區(qū)，上面印有參比電極和對電極； (4) 對（3)中親水區(qū)域功能化，將抗體固定在親水區(qū)域，隨后用牛血清白蛋白封鎖活 性位點(diǎn)； (5) 將目標(biāo)物或血清試樣在固定抗體的反應(yīng)區(qū)域孵育； (6) 將經(jīng)（5)處理后的紙芯片折疊，將含有抗壞血酸的磷酸緩沖液滴加到印有參比電 極對電極的紙層上，在紫外燈的照射下，連接電化學(xué)設(shè)備進(jìn)行測試； 一種光電化學(xué)三維微流控紙芯片的制備及在多種腫瘤檢測中的應(yīng)用，其特征在于該方 法的具體步驟為： (1) 在計(jì)算機(jī)上利用Adobe illustrator CS4設(shè)計(jì)光電化學(xué)三維微流控紙芯片的疏水 蠟批量打印圖案； (2) 將紙剪裁成常用A4大小的紙，利用蠟打印技術(shù)在紙上打印蠟疏水圖案，將打印蠟 的圖案在恒溫150 °C下2 min，使蠟融化并浸透整個(gè)紙的厚度，形成疏水墻，沒有打印蠟的 部分為親水區(qū)即為工作區(qū)； (3) 采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)進(jìn)行電極印刷。以石墨為原料，取等體積的丙酮和環(huán)己酮溶液， 再加入對應(yīng)量的乙酸纖維素，使用超聲波超聲使乙酸纖維素充分的溶解在丙酮和環(huán)己酮的 混合溶劑中，最后加入一定量的石墨粉，用玻璃棒充分混勻，得到碳墨以作為工作電極的原 料，在紙上印制6個(gè)工作電極，一個(gè)碳對電極和Ag/AgCl參比電極； (4) 將（3)所得的紙進(jìn)行功能化，制備工作區(qū) 制備Pt納米粒子：稱取170 mg的聚乙烯吡咯烷酮加入到5 mL 1 mM H2PtCl6中，將此 溶液用去離子水稀釋到58 mL，在磁力攪拌下加入新配置的2 mL 1%的NaBH4,繼續(xù)磁力攪拌 3 h;在紙上生長納米多孔Pt粒子：量取15 μ?制備的Pt納米粒子，滴加到（2)上印有工作 電極的反面工作區(qū)上，室溫下孵育1 h，目的是使Pt納米粒子牢固的吸附在紙纖維上，去離 子水沖洗3次以移除未成功附著的Pt納米粒子，將長有Pt種子的紙片放于燒杯中，隨后將 10 mL的多孔Pt的生長溶液，此生長溶液包含0. 5禮的％?比16和0.01 mM的抗壞血酸，力口 入到燒杯中，60 °C水浴加熱20 min，取出紙芯片，室溫下自然干燥；在生長有納米多孔Pt 粒子的紙芯片上水熱法生長ZnO納米棒：將長有納米多孔Pt粒子的紙芯片放于勻膠機(jī)上， 向此紙芯片上滴加40 mM的Zn(CH3C00)2 · 2H20,以1000 rpm的速度旋涂60 s，取出紙片放 于恒溫干燥箱中150 °C干燥10 min，將旋涂和加熱干燥的步驟重復(fù)6次，即可獲得附著有 ZnO種子且生長有納米多孔Pt粒子的紙芯片，隨后將此紙芯片放于25 mM Ζη(Ν03)2·6Η20 與25 mM六次甲基四胺的水溶液中，90 °C加熱6 h即可；在ZnO納米棒上生長CdS量子點(diǎn)： 將上述生長有ZnO納米棒的紙芯片放于10 mM的Cd(N03)2和10 mM硫代乙酰胺中，室溫下 反應(yīng)60 min，取出紙芯片，去離子水沖洗4次后干燥；將5 μ?抗體固定在經(jīng)上述功能化的 紙芯片上的親水區(qū)域，室溫下干燥，隨后用5 μ? 1%的牛血清白蛋白掩蔽活性位點(diǎn)，室溫下 孵育50 min ; (5) 將目標(biāo)抗原或血清樣品滴加到反應(yīng)區(qū)，室溫下孵育50 min; (6) 將紙芯片折疊，將40 μ?含有抗壞血酸的、pH等于7. 4的磷酸緩沖液，滴加到印有 參比電極對電極的紙層上，在紫外燈的照射下，連接電化學(xué)設(shè)備進(jìn)行測試，其中抗壞血酸和 磷酸緩沖液的濃度均為〇· 1 mol · I71 ; 本發(fā)明所述紙材料為一級色譜紙。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007] 圖1:疏水蠟打印圖案； 圖2 :疏水蠟打印圖案的放大圖，其中右側(cè)為參比區(qū)，左側(cè)為工作區(qū)； 圖3 :疏水蠟打印圖案上絲網(wǎng)印刷上6個(gè)工作電極，1個(gè)參比電極及對電極后的圖，其 中，1為參比電極，2為對電極，3為工作電極。

【具體實(shí)施方式】
[0008] 實(shí)施案例1 一種光電化學(xué)三維紙芯片的制備及其在腫瘤檢測中的應(yīng)用 (1) 在計(jì)算機(jī)上用Adobe illustrator CS4設(shè)計(jì)光電化學(xué)三維微流控紙芯片的疏水錯(cuò) 批量打印圖案； (2) 將紙剪裁成常用A4大小的紙，利用蠟打印技術(shù)在紙上打印蠟疏水圖案，將打印蠟 的圖案在恒溫150 °C下2 min，使蠟融化并浸透整個(gè)紙的厚度，形成疏水墻，沒有打印蠟的 部分為親水區(qū)即為工作區(qū)； (3) 采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)進(jìn)行電極印刷。以石墨為原料，取等體積的丙酮和環(huán)己酮溶液， 再加入對應(yīng)量的乙酸纖維素，使用超聲波超聲使乙酸纖維素充分的溶解在丙酮和環(huán)己酮的 混合溶劑中，最后加入一定量的石墨粉，用玻璃棒充分混勻，得到碳墨以作為工作電極的原 料，在紙上印制6個(gè)工作電極，一個(gè)碳對電極和Ag/AgCl參比電極； (4) 將（3)所得的紙進(jìn)行功能化，制備工作區(qū) 制備Pt納米粒子：稱取170 mg的聚乙烯吡咯烷酮加入到5 mL 1 mM H2PtCl6，將此溶 液用去離子水稀釋到58 mL，在磁力攪拌下加入新配置的2 mL 1%的NaBH4,繼續(xù)磁力攪拌3 h ;在紙上生長納米多孔Pt粒子：量取15 μ?制備的Pt納米粒子，滴加到（2)上印有工作電 極的反面工作區(qū)上，室溫下孵育1 h，目的是使Pt納米粒子牢固的吸附在紙纖維上，去離子 水沖洗3次以移除未成功附著的Pt納米粒子，將長有Pt種子的紙片放于燒杯中，隨后將10 mL的多孔Pt的生長溶液，此生長溶液包含0. 5 mM的H2PtCl6和0. 01 mM的抗壞血酸，加入 到燒杯中，60 °C水浴加熱20 min，取出紙芯片，室溫下自然干燥；在生長有納米多孔Pt粒 子的紙芯片上水熱法生長ZnO納米棒：將長有納米多孔Pt粒子的紙芯片放于勻膠機(jī)上，向 此紙芯片上滴加40 mM的Zn(CH3C00)2 · 2H20,以1000 rpm的速度旋涂60 s，取出紙片放于 恒溫干燥箱中150 °C干燥10 min，將旋涂和加熱干燥的步驟重復(fù)6次，即可獲得附著有ZnO 種子且生長有納米多孔Pt粒子的紙芯片，隨后將此紙芯片放于25 mM Ζη(Ν03)2·6Η20與25 mM六次甲基四胺的水溶液中，90 °C加熱6 h即可；在ZnO納米棒上生長CdS量子點(diǎn)：將上 述生長有ZnO納米棒的紙芯片放于10 mM的Cd(N03)2和10 mM硫代乙酰胺中，室溫下反應(yīng) 60 min，取出紙芯片，去離子水沖洗4次后干燥；將5 μ?的6種目標(biāo)抗原的相應(yīng)抗體固定在 上述功能化的紙芯片上的親水區(qū)域，室溫下干燥，隨后用5 μ? 1%的牛血清白蛋白封鎖活性 位點(diǎn)，室溫下孵化50 min ; (5) 將5 μ?不同濃度的6種目標(biāo)抗原即：AFP，CEA，Ρ0Α，CA199，CA125，CA15-3滴 加到相應(yīng)工作區(qū)，室溫下孵化50 min; (6)將紙芯片折疊，將40 μ?含有抗壞血酸的、pH等于7. 4的磷酸緩沖液，滴加到印有 參比電極對電極的紙層上，在紫外燈的照射下，連接電化學(xué)設(shè)備進(jìn)行測試，其中抗壞血酸和 磷酸緩沖液的濃度均為〇. 1 mol · Γ1，六種抗原檢測所得結(jié)果列于表1中。
[0009] 表1本發(fā)明測定六種腫瘤標(biāo)記物的性能

【權(quán)利要求】
1. 一種光電化學(xué)三維紙芯片的制備及其在腫瘤檢測中的應(yīng)用，其特征是包括以下步 驟： 1. 1在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)如附圖1所示的光電化學(xué)三維微流控紙芯片的疏水蠟批量打印 圖案，放大后的樣式如附圖2所示； 1. 2將紙剪裁成常用A4大小的紙，將步驟（1. 1)中設(shè)計(jì)的疏水蠟批量打印圖案打印到 A4紙上，隨后將帶有蠟圖案的A4紙放置到平板加熱器或烘箱中，在150 °C加熱2 min ;使 蠟融化并浸透整個(gè)紙的厚度，形成疏水墻； 1. 3采用絲網(wǎng)印刷的方法，將陣列工作電極、參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步 驟（1.2)中得到的紙上，最后所得的樣式如附圖3所示，其中左側(cè)為工作區(qū)，上面印刷有6個(gè) 工作電極，右側(cè)為參比區(qū)，上面印有參比電極和對電極； 1.4對（1.3)中親水區(qū)域功能化，將抗體固定在親水區(qū)域，隨后用牛血清白蛋白封鎖活 性位點(diǎn)； 1. 5將目標(biāo)物或血清試樣在固定抗體的反應(yīng)區(qū)域孵育； 1. 6將經(jīng)（1. 5)處理后的紙芯片折疊，將含有抗壞血酸的磷酸緩沖液滴加到印有參比 電極對電極的紙層上，在紫外燈的照射下，連接電化學(xué)設(shè)備進(jìn)行測試。
2. 根據(jù)權(quán)利要求書所述光電化學(xué)三維微流控紙芯片的制備及其在多腫瘤標(biāo)記物現(xiàn)場 即時(shí)檢測中的應(yīng)用，其特征在于該方法的具體步驟為： 2.1在計(jì)算機(jī)上用Adobe illustrator CS4設(shè)計(jì)光電化學(xué)三維微流控紙芯片的疏水錯(cuò) 批量打印圖案； 2. 2將紙剪裁成常用A4大小的紙，利用蠟打印技術(shù)在紙上打印蠟疏水圖案，將打印蠟 的圖案在恒溫150 °C下2 min，使蠟融化并浸透整個(gè)紙的厚度，形成疏水墻沒有打印蠟的部 分為親水區(qū)即為工作區(qū)； 2. 3采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)、石墨為原料，取等體積的丙酮和環(huán)己酮溶液，再加入對應(yīng)量 的乙酸纖維素，使用超聲波超聲使乙酸纖維素充分的溶解在丙酮和環(huán)己酮的混合溶劑中， 最后加入一定量的石墨粉，用玻璃棒充分混勻，在紙上印制6個(gè)工作電極，一個(gè)碳對電極和 Ag/AgCl參比電極； 2.4將（2. 3)所得的紙進(jìn)行功能化，制備工作區(qū) 制備Pt納米粒子：稱取170 mg的聚乙烯吡咯烷酮加入到5 mL ImM H2PtCl6，將此溶液 用去離子水稀釋到58 mL，在磁力攪拌下加入新配置的2 mL 1%的NaBH4,繼續(xù)磁力攪拌3 h; 在紙上生長納米多孔Pt粒子：量取15 μ?制備的Pt納米粒子，滴加到（2)上印有工作電極 的反面工作區(qū)上，室溫下孵育1 h，目的是使Pt納米粒子牢固的吸附在紙纖維上，去離子水 沖洗3次以移除未成功附著的Pt納米粒子，將長有Pt種子的紙片放于燒杯中，隨后將10 mL的多孔Pt的生長溶液，此生長溶液包含0. 5 mM的H2PtCl6和0. 01 mM的抗壞血酸，加入 到燒杯中，60 °C水浴加熱20 min，取出紙芯片，室溫下自然干燥；在生長有納米多孔Pt粒 子的紙芯片上水熱法生長ZnO納米棒：將長有納米多孔Pt粒子的紙芯片放于勻膠機(jī)上，向 此紙芯片上滴加40 mM的Zn(CH3C00)2 · 2H20,以1000 rpm的速度旋涂60 s，取出紙片放于 恒溫干燥箱中干燥150 °C干燥10 min，將旋涂和加熱干燥的步驟重復(fù)6次，即可獲得附著 有ZnO種子且生長有納米多孔Pt粒子的紙芯片；隨后將此紙芯片放于25 mM Ζη(Ν03)2·6Η20 與25 mM六次甲基四胺的水溶液中，90 °C加熱6 h即可；在ZnO納米棒上生長CdS量子點(diǎn)： 將上述生長有ZnO納米棒的紙芯片放于10 mM的Cd(N03)2和10 mM硫代乙酰胺中，室溫下 反應(yīng)60 min，取出紙芯片，去離子水沖洗4次后干燥；將5 μ?抗體固定在經(jīng)上述功能化的 紙芯片上的親水區(qū)域，室溫下干燥，隨后用5 μ? 1%的牛血清白蛋白掩蔽活性位點(diǎn)，室溫下 孵育50 min ; 2. 5將目標(biāo)抗原或血清樣品滴加到反應(yīng)區(qū)，室溫下孵化50 min ; 2. 6將紙芯片折疊，將40 μ?含有抗壞血酸的、pH等于7. 4的磷酸緩沖液，滴加到印有 參比電極對電極的紙層上，在紫外燈的照射下，連接電化學(xué)設(shè)備進(jìn)行測試，其中抗壞血酸和 磷酸緩沖液的濃度均為〇· lmol · L'
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述絲網(wǎng)印刷電極所用的紙材料為一級色譜紙。
【文檔編號】G01N27/26GK104122393SQ201410372677
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】于京華, 李麗, 顏梅, 葛慎光, 張彥, 吳魯?shù)? 孫國強(qiáng), 吳開慶 申請人:濟(jì)南大學(xué)