四神片指紋圖譜的建立方法
【專利摘要】四神片制劑指紋圖譜的建立方法，包括制備成每ml含補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲10-100mg的對照品溶液和采用四神片去包衣后稱取0.1-10g，用甲醇超聲提取。過濾后得到的供試品溶液。然后精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀中，按照液相色譜法測定，得指紋圖譜。色譜條件為：色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，流動相由乙腈和水組成的梯度洗脫液，檢測波長220-360nm，柱溫20-50℃，流速0.5-1.5ml/min，時間30-90min。本發(fā)明方法簡單、穩(wěn)定、精度高、重現(xiàn)性好，能快速而準確地鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣。
【專利說明】四神片指紋圖譜的建立方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及四神片的質(zhì)量控制方法，具體涉及四神片高效液相指紋圖譜的構(gòu)建方法和指紋圖譜，屬于中醫(yī)藥學【技術領域】。

【背景技術】
[0002]中藥指紋圖譜是指運用現(xiàn)代分析技術，對中藥化學信息以圖形的方式進行表征并加以描述，是某種或某幾種中藥材中所共有的，具有特征性的某幾類成分的色譜或光譜的圖譜。當前，中藥指紋圖譜質(zhì)量控制技術作為控制中藥質(zhì)量穩(wěn)定性和均一性的檢測手段，是中藥現(xiàn)代化的關鍵技術之一，這對有效地控制中藥的質(zhì)量有重要意義。色譜指紋圖譜質(zhì)量控制技術是當前中藥質(zhì)量研究的亮點。對于成分復雜的中藥，過去那種單一有效成分作為質(zhì)量控制指標的做法是不全面的，而色譜指紋圖譜控制模式則以色譜分析為手段，從中獲取反應中藥內(nèi)在質(zhì)量的信息，通過對指紋特征的分析比較，評價中藥內(nèi)在質(zhì)量的真實性、一致性和穩(wěn)定性，這是現(xiàn)階段綜合評價中藥質(zhì)量的最優(yōu)技術。據(jù)報道，日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)于20世紀80年代就已經(jīng)在企業(yè)內(nèi)部采用液相指紋圖譜控制質(zhì)量，美國、德國、法國等國家也對植物草藥采用指紋圖譜質(zhì)量控制技術。隨著中醫(yī)中藥的推廣應用，人們發(fā)現(xiàn)，作為中醫(yī)理論的時間產(chǎn)物，中藥尤其是復方中藥，其中所含的任一種成分都不能代表其整體療效。人們逐漸認識到，現(xiàn)行的參照西藥質(zhì)量控制模式的質(zhì)量標準不能恰當?shù)姆磻兴巸?nèi)在的質(zhì)量，指紋圖譜作為中草藥及其提取物質(zhì)量控制方法，目前已為國際所共識。
[0003]四神片由肉豆蘧(制)、吳茱萸、補骨脂、五味子、干姜、大棗等六味藥組成，具有助腎散寒，止瀉消脹的功效。臨床用于治療腎虛受寒，腸鳴肚脹，五更溏瀉，食物不化，久瀉不止，面黃體弱。
目前，國家和企業(yè)對四神片的質(zhì)量控制是采用薄層色譜法對吳茱萸、五味子中的五味子醇甲和補骨脂中的補骨脂素、異補骨脂素進行鑒別。訾慧、方曉明等，在“中國中藥雜志”2006，第6期采用HPLC法測定四神片中補骨脂素和異補骨脂素的含量；慶俊等在“吉林醫(yī)藥學院學報”2008，29 (6)中采用RP-HPLC法測定四神片中補骨脂素和異補骨脂素的含量。
[0004]以上均是對個別成分進行的鑒別或含量測定，無法全面表征四神片的化學特征，指紋圖譜作為中草藥及成方制劑的質(zhì)量控制方法，能夠從整體上更為有效地表征中藥的質(zhì)量。目前，有關四神片的指紋圖譜方法尚未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的，是提供一種四神片制劑指紋圖譜的構(gòu)建方法。即為四神片的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供一種新的方法，并由此方法得到四神片的標準指紋圖譜。
[0006]本發(fā)明建立的指紋圖譜方法具有良好的精密度、重復性和穩(wěn)定性，能夠用于四神片的質(zhì)量控制。通過此方法可以保證四神片的質(zhì)量穩(wěn)定性、一致性和可控性，從而確保四神片的安全性和有效性。
[0007]本發(fā)明中所述的四神片由肉豆蘧189g，吳茱萸94g，補骨脂377g，五味子189g，干姜94g，大棗189g制備而成。具體制備方法為:以上六味，大棗加水煎煮二次，每次加水8倍量，煎煮I小時，合并煎液，減壓濃縮成稠膏；肉豆蘧、吳茱萸、補骨脂、五味子粉碎成最粗粉，用60%乙醇作溶劑，進行滲漉。干姜藥材粉碎成最粗粉，用乙醇作溶劑，進行滲漉。合并乙醇滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮成稠膏。水、醇稠膏合并，加入輔料適量，混勻，減壓干燥，粉碎，加入適量輔料，按照常規(guī)方法制成相應的四神片制劑。
[0008]因此本發(fā)明的第一個目的是提供一種四神片HPLC指紋圖譜的建立方法，所述方法包括以下步驟:
(I)對照品溶液的制備:分別精密稱取補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲對照品適量，用甲醇配制成每ml含補骨脂素、異補骨脂素和五味子醇甲10-100 μ g的溶液，即得對照品溶劑，備用。
[0009](2)供試品溶液的制備:四神片去包衣后精密稱取0.1~10g，用甲醇超聲提取10~60min，提取液用微孔濾膜濾過，即得供試品溶液； (3)采用液相色譜法測定指紋圖譜:精密吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，按照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
[0010](4)采用液相色譜法測定指紋圖譜的色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相由流動相A和流動相B組成的梯度洗脫液，流動相A為乙腈，流動相B為水；檢測波長220nm~360nm ;柱溫20~50°C ;流速0.5~1.5mL/min ;時間30~90min。
[0011]上述步驟(2)供試品溶液的制備是:四神片去包衣后精密稱取0.l-10g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇lO-lOOml，密塞，稱定重量，浸泡，超聲處理后，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。
[0012]上述步驟(3)測定指紋圖譜是:精密吸取供試品溶液5~25 μ I注入高效液相色譜儀，按照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
[0013]上述步驟(4)所述色譜條件是:流動相為水與乙腈組成的梯度洗脫液，水95-20%:乙腈5-80%，柱溫35°C，檢測波長為246nm，流速為1.0ml/min，分析時間為70min。
[0014]上述步驟(1)所述對照品溶液的制備是:精密稱取補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲對照品適量至于容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，配制成每1ml含補骨脂素30 μ g、異補骨脂素30 μ g、五味子醇甲50 μ g的溶液,作為對照品溶液；
上述步驟(2)所述供試品溶液的制備是:四神片除去包衣后精密稱取0.5g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，浸泡，超聲處理45分鐘(50kHz，室溫)，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；
上述步驟(3)所述色譜條件為:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相為乙腈與水組成的梯度洗脫液；柱溫:35°C;檢測波長246nm ;流速:1.0ml/min ；分析時間:90min
上述步驟(4)所述的梯度洗脫，優(yōu)選梯度洗脫程序以如下體積濃度配比進行。流動相A為乙腈，流動相B為水。
[0015]表1.四神片指紋圖譜優(yōu)選梯度洗脫程序

【權(quán)利要求】
1.一種四神片制劑指紋圖譜的建立方法，采用液相色譜法，其特征在于:包括以下步驟: (1)對照品溶液的制備:分別精密稱取補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲對照品適量，用甲醇配制成10?100 μ g/mL的溶液,作為對照品溶液； (2)供試品溶液的制備:四神片去包衣后精密稱取0.1?10g，用甲醇超聲提取，提取液用微孔濾膜濾過，即得供試品溶液； (3)采用液相色譜法測定指紋圖譜:精密吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，按照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜； (4)采用液相色譜法測定指紋圖譜的色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相由流動相A和流動相B組成的梯度洗脫液，流動相A為乙腈，流動相B為水；檢測波長 220nm ?360nm ;柱溫 20 ?50°C ;流速 0.5 ?L 5mL/min ;時間 30 ?90min。
2.如權(quán)利要求1所述的四神片制劑指紋圖譜的建立方法，其特征在于:所述步驟(2)供試品溶液的制備是:四神片去包衣后精密稱取0.1?10g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10?100ml,密塞,稱定重量,浸泡,超聲處理后,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液； 所述步驟(3)采用液相色譜法測定指紋圖譜是:精密吸取供試品溶液5?25 μ L注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，即得指紋圖譜。
3.如權(quán)利要求1所述的四神片制劑指紋圖譜的建立方法，其特征在于: 所述步驟(2)供試品溶液的制備是:四神片除去包衣后精密稱取0.5g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，浸泡，超聲處理45分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液； 所述步驟(4)色譜條件為:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相為水與乙腈組成的梯度洗脫液，水(％)95?20:乙腈(％)5?80 ;柱溫:35°C;檢測波長.246nm ;流速:1.0ml/min ;分析時間:70min。
4.如權(quán)利要求1所述的四神片制劑指紋圖譜的建立方法，其特征在于:步驟(4)中所述的梯度洗脫，梯度洗脫以如下體積濃度配置進行: . O分鐘時，流動相A為5%，流動相B為95% ； . 20分鐘時，流動相A為30%,流動相B為70% ； . 25分鐘時，流動相A為40%,流動相B為60% ； .60分鐘時，流動相A為80%,流動相B為20% ； . 70分鐘時，流動相A為80%，流動相B為20%。
5.如權(quán)利要求1所述四神片制劑指紋圖譜的建立方法，其特征在于制得到的四神片制劑HPLC指紋圖譜有15個共有峰，峰號為I?15，以其中特征峰(4)補骨脂素峰為參照峰，峰號；相對保留時間分別為:1 (0.11),2 (0.37),3 (0.38),4 (1.00),5 (1.03),6 (1.27)、.7 (1.28),8 (1.31),9 (1.40),10 (1.45),11 (1.53),12 (1.55),13 (1.60),14 (1.65),.15 (1.96)。
【文檔編號】G01N30/88GK104198634SQ201410389089
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】馬占芝, 生可心, 王學東, 姜峰, 王淞林 申請人:沈陽雙鼎制藥有限公司