一種觀察動(dòng)物肝臟組織中細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種觀察動(dòng)物肝臟組織中細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu)的方法，它包括如下步驟：(1)將動(dòng)物肝臟組織，經(jīng)PBS清洗，4v/v％多聚甲醛水溶液固定8～12h，石蠟包埋，連續(xù)切片；(2)對(duì)步驟(1)得到的石蠟切片進(jìn)行脫蠟，抗原修復(fù)，封閉，熒光標(biāo)記抗體孵育；(3)對(duì)于甘油封片后的標(biāo)本，在24h內(nèi)使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，488和4',6-二脒基-2-苯基吲哚分別在488nm和405nm下激發(fā)，室溫、暗室環(huán)境下立即觀察，拍片。本發(fā)明方法具有快速、簡單；直觀、準(zhǔn)確；較強(qiáng)的實(shí)用性和擴(kuò)展性；可研究污染物脅迫下細(xì)胞骨架的劑量-效應(yīng)變化關(guān)系等優(yōu)勢。
【專利說明】一種觀察動(dòng)物肝臟組織中細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀測動(dòng)物肝臟組織細(xì)胞骨架系統(tǒng)變化方法，更具體的說是一種應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀測魚類肝臟組織切片中微管蛋白(β -tubulin)表達(dá)和分布的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞骨架(cytoskeleton)是指真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),真核細(xì)胞借其才得以維持基本形態(tài)，因此這一重要結(jié)構(gòu)被形象地稱為細(xì)胞骨架，它通常也被認(rèn)為是廣義上細(xì)胞器的一種。細(xì)胞骨架不僅在維持細(xì)胞形態(tài)，承受外力、保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性方面起重要作用，而且還參與許多重要的生命活動(dòng)，如:在細(xì)胞分裂中細(xì)胞骨架牽引染色體分離，在細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸中，各類小泡和細(xì)胞器可沿著細(xì)胞骨架定向轉(zhuǎn)運(yùn)；在肌肉細(xì)胞中，細(xì)胞骨架和它的結(jié)合蛋白組成動(dòng)力系統(tǒng)；在白細(xì)胞(白血球)的遷移、精子的游動(dòng)、神經(jīng)細(xì)胞軸突和樹突的伸展等方面都與細(xì)胞骨架有關(guān)。另外，在植物細(xì)胞中細(xì)胞骨架指導(dǎo)細(xì)胞壁的合成。肝臟是大多數(shù)污染物重要的蓄積器官和解毒器官，某些污染物脅迫下肝臟細(xì)胞骨架系統(tǒng)可能會(huì)發(fā)生重組甚至破壞，由于細(xì)胞骨架對(duì)于維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性，以及在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、能力轉(zhuǎn)換、信息傳遞和細(xì)胞分化等一系列方面起重要作用，因此準(zhǔn)確觀察動(dòng)物肝臟細(xì)胞骨架發(fā)生的變化對(duì)闡明污染物致毒機(jī)理具有十分重要的意義。
[0003]細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)以蛋白質(zhì)纖維為主要成分的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由主要的三類蛋白纖絲(filament)構(gòu)成，包括微管、微絲(肌動(dòng)蛋白纖維)和中間纖維。微管主要分布在核周圍，并呈放射狀向胞質(zhì)四周擴(kuò)散；微絲主要分布在細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)；而中間絲則分布在整個(gè)細(xì)胞中。微管(mic1tubule)可在所有哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中存在，直徑大于12nm，除了紅細(xì)胞(紅血球)外，所有微管均由約55kD的α及β微管蛋白(tubulin)組成。它們正常時(shí)以β二聚體形式存在，并以頭尾相連的方式聚合，形成微管蛋白原纖維(protofilament), 一般由13根這樣的原纖維構(gòu)成一個(gè)中空的微管，直徑22?25nm。少數(shù)變異的微管如線蟲等所有的則有其他數(shù)目的原纖維。到目前為止，已有多種技術(shù)研究細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的含量和分布，如應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)技術(shù)研究目標(biāo)骨架蛋白在組織蛋白提取液中的表達(dá)，但該技術(shù)只能研究目標(biāo)骨架蛋白在組織中的豐度，不能研究細(xì)胞骨架系統(tǒng)整體的形態(tài)變化；應(yīng)用熒光抗體標(biāo)記的細(xì)胞骨架蛋白，可用熒光顯微鏡研究(活)細(xì)胞的細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)，包括組裝、去組裝和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)龋@一技術(shù)經(jīng)常被用來研究細(xì)胞試驗(yàn)中離體細(xì)胞的細(xì)胞骨架的形態(tài)，應(yīng)用范圍有限，而大多數(shù)毒理試驗(yàn)是用試驗(yàn)動(dòng)物開展污染物暴露試驗(yàn)，因此這一技術(shù)并不能有效衡量動(dòng)物試驗(yàn)中受污染物暴露的動(dòng)物肝臟組織的肝細(xì)胞骨架的受損狀況。
[0004]細(xì)胞骨架是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的組織者，其在保持細(xì)胞內(nèi)一些細(xì)胞器和生物大分子的正常生理活動(dòng)(如分泌蛋白的合成)和信號(hào)傳遞上有著重要作用，因此近年來成為污染物致毒機(jī)理相關(guān)研究中的熱點(diǎn)之一。Tubulin(微管蛋白)是細(xì)胞骨架的重要組成部分，廣泛存在于各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，主要由a-tubulin和β-tubulin組成。其中β-tubulin蛋白表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，常被用于免疫染色觀察細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)中的目標(biāo)蛋白。本發(fā)明專利即圍繞著用熒光探針標(biāo)記β -tubulin抗體來標(biāo)記肝臟組織切片中細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的微管蛋白，進(jìn)而使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架微管結(jié)構(gòu)。激光掃描共聚焦顯微鏡是利用激光點(diǎn)作為熒光的激發(fā)光并通過掃描裝置對(duì)標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)掃描，并通過空間共軛光闌(針孔)阻擋離焦平面光線而成像的一種顯微鏡，是當(dāng)今世界最先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器。用其來觀察組織切片中的細(xì)胞骨架，可避免因切片厚度帶來的視野不清晰的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)現(xiàn)有細(xì)胞骨架系統(tǒng)觀測方法的不足，提供了一種觀察動(dòng)物肝臟組織中細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu)的方法，采用β-Tubul in (9F3)Rabbit (Alexa Fluor? 488Conjugate)單克隆抗體(Sigma)作為一抗,結(jié)合動(dòng)物肝臟切片中細(xì)胞骨架中的微管蛋白，應(yīng)用激光掃描共聚焦技術(shù)觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、直觀的細(xì)胞骨架系統(tǒng)觀察，并為污染物脅迫導(dǎo)致動(dòng)物肝臟組織細(xì)胞骨架系統(tǒng)發(fā)生重組變化提供直接證據(jù)。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]—種觀察動(dòng)物肝臟組織中細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu)的方法，它包括如下步驟:
[0008](I)將動(dòng)物肝臟組織，經(jīng)PBS清洗，4v/v%多聚甲醛水溶液固定8?12h，石蠟包埋，連續(xù)切片；
[0009](2)對(duì)步驟(I)得到的石蠟切片進(jìn)行脫蠟，抗原修復(fù)，封閉，熒光標(biāo)記抗體孵育；
[0010]其中，所述的脫蠟，將石蠟切片貼附于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60°C烘片2?6小時(shí)，置于二甲苯中脫蠟30分鐘，取出，再放入新鮮的二甲苯中再次脫蠟10分鐘；之后，進(jìn)行梯度酒精復(fù)水；
[0011]其中，所述的抗原修復(fù)，室溫下將脫蠟后的切片置于10mM、pH 6.0的枸櫞酸緩沖液修復(fù)液中，用微波爐100%火力處理3min至微微沸騰，再用50%火力維持7min，停止加熱后自然冷卻20?30min ;去離子水清洗3次,每次5min ;再用PBS清洗5min,用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS ；
[0012]其中，所述的封閉，是用封閉液室溫下孵育封閉lh，傾去封閉液；所述的封閉液用含0.3v/v% TritonX-1OO的PBS將山羊血清稀釋至5?10v/v% ；
[0013]其中，所述的突光標(biāo)記抗體孵育，是用Alexa Fluor? 488Conjugate的β -Tubulin(9F3)Rabbit單克隆抗體稀釋液4°C濕盒孵育標(biāo)本過夜；之后，用PBS 3minX5次洗去一抗，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS ;滴加4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma)避光孵育2?5min，對(duì)標(biāo)本細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記，用PBS IminX 3次洗去4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS，最后用甘油封片；
[0014](3)對(duì)于甘油封片后的標(biāo)本，在24h內(nèi)使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，F(xiàn)luor?488和4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚分別在488nm和405nm下激發(fā)，室溫、暗室環(huán)境下立即觀察，拍片。
[0015]步驟(I)中，切片厚度為4?5μπι。
[0016]步驟(I)或(2)中，所述的PBS為0.01Μ, pH 7.2的磷酸緩沖液。
[0017]步驟(2)中，所述的梯度酒精復(fù)水，使用以下溶劑依次浸泡:100V/V%酒精3min，100v/v%酒精3min，95v/v%酒精水溶液3min，85v/v%酒精水溶液3min，75￥八％酒精水溶液 3min, 50ν/ν%酒精水溶液 3min,去離子水 3min,去離子水 3min, 0.01M、pH 7.2PBS 5min。
[0018]步驟(2)中，熒光標(biāo)記抗體孵育過程中，單克隆抗體稀釋液配制方法如下:用含
0.3v/v% TritonX-1OO和lm/v1^ (m/v為溶質(zhì)質(zhì)量mg與溶劑體積mL之比，以下相同)牛血清白蛋白的PBS稀釋單克隆抗體，單克隆抗體的與PBS的體積比為1:500?1:800。
[0019]步驟(3)中，激光掃描共聚焦顯微鏡為Zeiss公司的LSM 710激光掃描共聚焦顯微鏡。
[0020]有益效果:
[0021]本發(fā)明采用免疫熒光結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢技術(shù)，公開了一種觀測動(dòng)物肝臟組織細(xì)胞骨架系統(tǒng)變化的方法，與以往的技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0022](I)快速、簡單。本發(fā)明大部分操作建立在傳統(tǒng)的石蠟切片免疫組化技術(shù)基礎(chǔ)之上，較為簡單，容易掌握，選用合適的細(xì)胞骨架抗體，能在較短的時(shí)間內(nèi)直接觀察到動(dòng)物組織細(xì)胞骨架系統(tǒng)，并通過激光掃描共聚焦顯微鏡成像。
[0023](2)直觀、準(zhǔn)確。根據(jù)商業(yè)化的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的帶熒光探針的抗體，結(jié)合合適的前處理技術(shù)，可直接、高效、準(zhǔn)確地定位細(xì)胞骨架，觀測其發(fā)生的變化，若輔以合適的計(jì)算機(jī)軟件，甚至可以半定量蛋白表達(dá)強(qiáng)度，而不像蛋白質(zhì)印跡技術(shù)只能半定量檢測細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的含量變化。
[0024](4)較強(qiáng)的實(shí)用性和擴(kuò)展性。本發(fā)明對(duì)大多數(shù)動(dòng)物肝臟組織的冷凍切片同樣適用，若同時(shí)孵以微絲相關(guān)蛋白的帶熒光標(biāo)記的抗體，可以完整觀測整個(gè)細(xì)胞骨架系統(tǒng)。由于制作石蠟切片前期采用4% (v/v)多聚甲醛水溶液常溫即可以固定，因此適用于除細(xì)胞試驗(yàn)之外的大多數(shù)動(dòng)物毒理試驗(yàn)，應(yīng)用范圍較廣，運(yùn)用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)，彌補(bǔ)了同類研究中只能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清晰成像的缺陷。
[0025](3)可研究污染物脅迫下細(xì)胞骨架的劑量-效應(yīng)變化關(guān)系。研究結(jié)果表明多種污染物在低濃度下能顯著誘導(dǎo)動(dòng)物肝臟細(xì)胞骨架發(fā)生重組、破壞。細(xì)胞骨架系統(tǒng)變化或受損程度與暴露物在一定濃度范圍內(nèi)存在著一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為激光掃描共聚焦顯微鏡成像的鯉魚(Cyprinus carp1 L.)正常肝臟細(xì)胞核(藍(lán)色部分)和細(xì)胞骨架系統(tǒng)(綠色部分)。標(biāo)尺為5 μ m。
[0027]圖2為腹腔注射50 μ g/kg MC-LR作用12h后，激光掃描共聚焦顯微鏡顯示的鯉魚肝臟細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化。標(biāo)尺為?ο μ m。
[0028]圖3為腹腔注射120 μ g/kg MC-LR作用5h后，激光掃描共聚焦顯微鏡顯示的鯉魚肝臟細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化。標(biāo)尺為?ο μ m。
[0029]圖4為腹腔分別單獨(dú)注射MC-LR和丁胱亞磺酰亞胺(BSO)、以及共同注射MC-LR和BSO作用48h后鯉魚肝臟細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化對(duì)比。(A)腹腔注射50 μ g/kg MC-LR作用48h，標(biāo)尺為10 μ m ; (B)腹腔注射200mg/kg BSO作用48h，標(biāo)尺為5 μ m ; (C)腹腔注射50 μ g/kg MC-LR Ih前預(yù)先注射BSO 200mg/kg，共同作用48h，標(biāo)尺為10 μ m。
[0030]圖5為含不同濃度MC-LR水溶液暴露14d對(duì)鯉魚肝臟β -tubulin表達(dá)的影響，采用Image-Pro Plus軟件計(jì)算陽性表達(dá)區(qū)域平均累計(jì)光密度(M1D);數(shù)值表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(η = 6) ;*表示處理組相對(duì)于對(duì)照組有顯著性差異(p〈0.05)。

【具體實(shí)施方式】
[0031]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0032]實(shí)施例1:利用激光掃描共聚焦顯微鏡成像鯉魚(Cyprinus carp1)正常肝臟細(xì)胞骨架系統(tǒng)。
[0033]選擇購自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心某漁場的幼齡(約6個(gè)月)鯉魚為受試生物，平均體長和重量分別為14.00±1.08cm和29.26±5.09g。在曝氣自來水中馴養(yǎng)14d，馴養(yǎng)期間，環(huán)境條件如下:水溫(16.1±0.2°C)，pH值(7.20 + 0.35)，溶解氧(8.6±0.5mg/L)，光暗比(12h/12h)，換算為 CaCO3 的總硬度(129.7 ±8.3mg/L)。在馴養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)期間保持曝氣。暴露前2天停止喂食，兩天暴露期間每天喂食一次。
[0034]馴養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選擇數(shù)條健康魚于冰上處死，迅速取出魚肝，經(jīng)0.0lM且pH為
7.2的磷酸緩沖溶液(PBS)清洗，4% (v/v)多聚甲醛水溶液固定過夜(8?12h)，石蠟包埋，將包埋好的肝臟標(biāo)本用切片機(jī)切石蠟連續(xù)切片(4?5 μ m)。將蠟片貼附于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60°C烘片2?6小時(shí)，置于二甲苯中脫蠟30分鐘(第一道脫蠟)，取出，再放入新鮮二甲苯中脫蠟10分鐘(第二道脫蠟)脫蠟10分鐘；之后，進(jìn)行梯度酒精復(fù)水(100%酒精 3min, 100%酒精 3min, 95%酒精 3min, 85%酒精 3min, 75%酒精 3min, 50%酒精 3min,去離子水3min，去離子水3min，PBS 5min);將復(fù)水后的切片置于1mM且pH為6.0的枸櫞酸液修復(fù)液中，用微波爐100%火力3min至微微沸騰，再用50 %火力維持7min，停止加熱后自然冷卻20?30min ;去離子水清洗3次，每次約5min ;再用PBS清洗5min，用濾紙擦去標(biāo)本外的 PBS ;用含 0.3% (v/v)TritonX-1OO 的 PBS(0.01M、pH 7.2)稀釋的 5% (v/v)山羊血清封閉液室溫下封閉Ih,傾去封閉液；用含0.3% (v/v) TritonX-100> I % (m/v)牛血清白蛋白的 PBS 封閉液稀釋的一抗(1:500)，即用 β -Tubulin (9F3) Rabbit (Alexa Fluor?488Conjugate)單克隆抗體稀釋液4°C濕盒孵育過夜。之后,用PBS 3minX 5次洗去一抗,用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS ;滴加DAPI (Sigma)避光孵育2?5min，可對(duì)標(biāo)本細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記。用PBS IminX 3次洗去DAPI，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS，最后用甘油封片。使用Zeiss公司的LSM 710激光掃描共聚焦顯微鏡，F(xiàn)luor? 488和DAPI分別在488nm和405nm下激發(fā)，立即觀察，拍片。
[0035]圖1為激光掃描共聚焦顯微鏡成像的鯉魚(Cyprinus carp1 L.)正常肝臟細(xì)胞核(藍(lán)色部分)和細(xì)胞骨架系統(tǒng)(綠色部分)。由圖可知，經(jīng)過本技術(shù)處理，正常肝臟細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞骨架系統(tǒng)清晰可見，肝臟細(xì)胞核被微觀蛋白所包圍，綠色熒光標(biāo)示的β -tubulin蛋白呈拉絲狀由細(xì)胞核福射出去。
[0036]實(shí)施例2:微囊藻毒素脅迫下鯉魚(Cyprinus carp1)肝臟細(xì)胞骨架系統(tǒng)出現(xiàn)的變化。
[0037]選擇購自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心某漁場的幼齡(約6個(gè)月)鯉魚為受試生物，平均體長和重量分別為14.00±1.08cm和29.26±5.09g。實(shí)驗(yàn)前先將鯉魚在曝氣自來水中馴養(yǎng)14d，隨機(jī)分成兩大組，每大組按暴露時(shí)間再細(xì)分成2小組，每個(gè)處理小組6條魚。兩大組魚按MC-LR腹腔分別注射亞致死劑量50 μ g/kg和120 μ g/kg (MC-LR溶于生理鹽水)，然后分別在5和12h之后冰上處死，迅速取出魚肝，按實(shí)例I所述方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行前處理，甘油封片后，使用Zeiss公司的LSM 710激光掃描共聚焦顯微鏡，F(xiàn)luor? 488和DAPI分別在488nm和405nm下激發(fā)，立即觀察，拍片。
[0038]在整個(gè)馴養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)期間，環(huán)境條件如下:水溫(16.1±0.2 °C )，pH值(7.20 ± 0.35)，溶解氧(8.6±0.5mg/L)，光暗比(12h/12h)，換算為 CaCO3 的總硬度(129.7±8.3mg/L)。在馴養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)期間保持曝氣。暴露前2天停止喂食，兩天暴露期間每天喂食一次。
[0039]圖2與圖3分別顯示了腹腔注射50 μ g/kg MC-LR作用12h后與注射120 μ g/kgMC-LR作用5h后，激光掃描共聚焦顯微鏡顯示的鯉魚肝臟細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化。由圖可知，50 μ g/kg MC-LR作用下，鯉魚肝臟細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)開始發(fā)生有規(guī)律的變化，骨架蛋白以細(xì)胞核為中心匯聚，濃縮，這種現(xiàn)象在12h時(shí)候非常明顯(圖2)，還需注意的是，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比正常組細(xì)胞核發(fā)生固縮，出現(xiàn)“空心核”現(xiàn)象。120yg/kg MC-LR作用下可以發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，5h開始骨架蛋白發(fā)生明顯的濃縮并向細(xì)胞核聚集現(xiàn)象(圖3)，且細(xì)胞核發(fā)生明顯的固縮變形，出現(xiàn)凋亡癥狀，并伴隨明顯的“空心核”現(xiàn)象，這應(yīng)該是MC-LR作用引起細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞出現(xiàn)的空泡結(jié)構(gòu)，與明顯濃縮聚集的細(xì)胞核一起，可以視為出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的征兆。
[0040]實(shí)施例3:微囊藻毒素和丁胱亞磺酰亞胺共同作用對(duì)鯉魚(Cyprinus carp1)肝臟細(xì)胞骨架系統(tǒng)的影響。
[0041]選擇購自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心某漁場的幼齡(約6個(gè)月)鯉魚為受試生物，平均體長和重量分別為14.00±1.08cm和29.26±5.09g。實(shí)驗(yàn)前先將鯉魚在曝氣自來水中馴養(yǎng)14d，隨機(jī)分成三組，每個(gè)處理小組6條魚。兩腹腔分別注射亞致死劑量
50μ g/kg MC-LR (溶于生理鹽水)、200mg/kg BS0,以及 200mg/kg BS0+50 μ g/kg MC-LR (腹腔注射50 μ g/kg MC-LR Ih前預(yù)先注射BSO 200mg/kg)，分別作用48h后，將魚冰上處死，迅速取出魚肝，按實(shí)例I所述方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行前處理，甘油封片后，使用Zeiss公司的LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡，F(xiàn)luor? 488和DAPI分別在488nm和405nm下激發(fā)，立即觀察，拍片。
[0042]圖4為腹腔分布單獨(dú)注射MC-LR和丁胱亞磺酰亞胺(BSO)、以及共同注射MC-LR和BSO作用48h后鯉魚肝臟細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化對(duì)比。由圖可見，單獨(dú)注射MC-LR48h后細(xì)胞骨架損傷并不嚴(yán)重，除了部分細(xì)胞因?yàn)榧?xì)胞解離破裂導(dǎo)致細(xì)胞物質(zhì)流失外，大部分細(xì)胞骨架蛋白恢復(fù)正常，充滿整個(gè)細(xì)胞(圖4中A);而由于BSO是一種常見的GSH合成抑制齊U，能抑制胞內(nèi)重要解毒物質(zhì)GSH的合成，改變胞內(nèi)氧化還原電位，單獨(dú)注射BSO使肝細(xì)胞細(xì)胞核發(fā)生輕微的固縮，骨架蛋白含量也有所降低(圖4中B)，但相對(duì)BSO處理后再注射MC-LR的組別(圖4中C)，損傷要輕得多，圖4C顯示鯉魚肝臟細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)已基本完全喪失，且相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞核消失。
[0043]實(shí)施例4:不同濃度MC-LR水溶液暴露14d對(duì)鯉魚肝臟β -tubulin表達(dá)強(qiáng)度的影響。
[0044]選擇購自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心某漁場的幼齡(約6個(gè)月)鯉魚為受試生物，平均體長和重量分別為13.98±1.06cm和27.69±5.20g。實(shí)驗(yàn)前先將鯉魚在裝有45L曝氣自來水的玻璃缸(60 X 30 X 35cm，每缸8 - 10條魚)中馴養(yǎng)10d。馴養(yǎng)期間鯉魚死亡率〈I %。馴養(yǎng)期間鯉魚死亡率〈I %。馴養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)分成5組，每組設(shè)三組重復(fù)，采用體表暴露方式，分別于空白、0.1、1.0、5.0、10.01^/1 MC-LR溶液中暴露14d。暴露期間，隔天換一半水，并補(bǔ)充MC-LR至預(yù)設(shè)值，定期采水樣檢測實(shí)際水體中MC-LR濃度。暴露結(jié)束后將魚于冰上處死，迅速取出魚肝，按實(shí)例I所述方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行前處理，甘油封片后，使用Zeiss公司的LSM 710激光掃描共聚焦顯微鏡，F(xiàn)luor? 488和DAPI分別在488nm和405nm下激發(fā),立即觀察,拍片。之后,采用Image-Pro Plus軟件計(jì)算β-tubulin蛋白陽性表達(dá)區(qū)域的平均累積光密度(mean integrated optical density, M10D)來表征蛋白表達(dá)強(qiáng)度。每張切片至少觀察六個(gè)區(qū)域。所得結(jié)果如圖5所示。不同濃度MC-LR靜態(tài)暴露14d后，0.1 - 1.0 μ g/L MC-LR處理組肝臟β -tubulin的表達(dá)水平略有上升但未出現(xiàn)顯著性差異，隨著處理濃度的進(jìn)一步加大，β -tubulin的表達(dá)水平轉(zhuǎn)為下降,并在10.0 μ g/L MC-LR處理組出現(xiàn)顯著性下降(為對(duì)照組的71.9%,p<0.05)。引入計(jì)算機(jī)軟件，結(jié)合本發(fā)明方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)強(qiáng)度的定量計(jì)算。
【權(quán)利要求】
1.一種觀察動(dòng)物肝臟組織中細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，它包括如下步驟: (1)將動(dòng)物肝臟組織，經(jīng)PBS清洗，4v/v%多聚甲醛水溶液固定8?12h，石蠟包埋，連續(xù)切片； (2)對(duì)步驟(I)得到的石蠟切片進(jìn)行脫蠟，抗原修復(fù)，封閉，熒光標(biāo)記抗體孵育； 其中，所述的脫蠟，將石蠟切片貼附于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60°C烘片2?6小時(shí)，置于二甲苯中脫蠟30分鐘，取出，再放入新鮮的二甲苯中再次脫蠟10分鐘；之后，進(jìn)行梯度酒精復(fù)水； 其中，所述的抗原修復(fù)，室溫下將脫蠟后的切片置于10mM、pH 6.0的枸櫞酸緩沖液修復(fù)液中，用微波爐100%火力處理3min至微微沸騰，再用50%火力維持7min，停止加熱后自然冷卻20?30min ;去離子水清洗3次,每次5min ;再用PBS清洗5min,用濾紙擦去標(biāo)本外的 PBS ； 其中，所述的封閉，是用封閉液室溫下孵育封閉lh，傾去封閉液；所述的封閉液用含0.3v/v% TritonX-1OO的PBS將山羊血清稀釋至5?10v/v% ； 其中，所述的突光標(biāo)記抗體孵育，是用Alexa Fluor? 488Conjugate的β -Tubulin (9F3)Rabbit單克隆抗體稀釋液4°C濕盒孵育標(biāo)本過夜；之后，用PBS 3minX 5次洗去一抗，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS ;滴加4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚避光孵育2?5min，對(duì)標(biāo)本細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記，用PBS Imin X 3次洗去4’，6-二脒基-2-苯基吲哚，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS，最后用甘油封片； (3)對(duì)于甘油封片后的標(biāo)本，在24h內(nèi)使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，F(xiàn)luoriD488和4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚分別在488nm和405nm下激發(fā)，室溫、暗室環(huán)境下立即觀察，拍片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的觀察動(dòng)物肝臟組織中細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，步驟(I)中，切片厚度為4?5μπι。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的觀察動(dòng)物肝臟組織中細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，步驟(I)或(2)中，所述的PBS為0.01Μ, pH 7.2的磷酸緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的觀察動(dòng)物肝臟組織中細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的梯度酒精復(fù)水，使用以下溶劑依次浸泡:100V/V%酒精3min，100v/V %酒精3min，95v/v %酒精水溶液3min，85v/v %酒精水溶液3min，75v/v %酒精水溶液3min, 50ν/ν%酒精水溶液 3min,去離子水 3min,去離子水 3min, 0.01M、pH 7.2PBS 5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的觀察動(dòng)物肝臟組織中細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，步驟(2)中，熒光標(biāo)記抗體孵育過程中，單克隆抗體稀釋液配制方法如下:用含0.3v/v% TritonX-1OO和I %牛血清白蛋白的PBS稀釋單克隆抗體，單克隆抗體的與PBS的體積比為 1:500 ?1:800。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的觀察動(dòng)物肝臟組織中細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，步驟(3)中，激光掃描共聚焦顯微鏡為Zeiss公司的LSM 710激光掃描共聚焦顯微鏡。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104133068SQ201410393479
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】姜錦林, 單正軍, 卜元卿, 程燕, 王曉蓉 申請(qǐng)人:環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所