屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種或數(shù)種過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒、制備和檢測方法，包括磁分離試劑的制備、過敏原試劑的制備、酶反應(yīng)物的制備、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的制備、濃縮清洗液的制備、底物A液和底物B液的制備六個步驟。本發(fā)明過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒所采用的檢測方法，通過過敏原特異性IgE抗體捕獲過敏原的方法來實現(xiàn)的，同時采用化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)和磁分離技術(shù)相結(jié)合的方法，大大提高了過敏原特異性抗體的檢測靈敏度和特異性，使得檢測結(jié)果更真實可信；同時優(yōu)化了反應(yīng)時間和反應(yīng)步驟，使操作更簡單。
【專利說明】屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及屋塵螨過敏原特異性IgE抗體(定量)檢測試劑盒及其制備方法，用于體外定量測定人血清中的針對屋塵螨過敏原特異性的IgE抗體的含量。

【背景技術(shù)】
[0002]屋塵螨是常見的吸入性過敏原(因此，屋塵螨特異性IgE抗體的檢測通常被稱之為屋塵螨過敏原的檢測)，其所能引起的過敏癥狀多為呼吸道的相關(guān)病癥，其檢測結(jié)果對于我們?nèi)粘Ｉ畹母纳凭o密相關(guān)。
[0003]塵螨是誘發(fā)過敏性哮喘、過敏性鼻炎和濕疹過敏性結(jié)膜炎等過敏性疾病的重要變應(yīng)原。近年研究證實塵螨與過敏性疾病關(guān)系密切，根據(jù)美國、新西蘭和澳大利亞等許多國家的調(diào)查相繼證實了塵螨是許多國家重要的過敏原之一。目前全球已有幾百項研究證實了塵螨與哮喘等過敏性疾病之間的密切關(guān)系。
[0004]塵螨過敏的診斷主要依賴免疫學(xué)檢測。目前臨床上有許多體內(nèi)和體外的免疫學(xué)檢測方法，包括塵螨變應(yīng)原皮膚試驗、血清塵螨特異性IgE測定、塵螨支氣管或鼻腔激發(fā)試驗、肥大細(xì)胞脫顆粒試驗、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白水平測定等。塵螨過敏患者的血清特異性抗體水平增高。可通過ELISA或RAST方法檢測塵螨特異性抗體。有臨床意義的指標(biāo)包括特異性IgE、IgG和IgA抗體。檢測特異性抗體水平可以幫助確診塵螨過敏及其過敏程度，同時可作為臨床療效評價的指標(biāo)。
[0005]目前臨床多采用的ELISA方法，由于其局限性，檢測靈敏度和準(zhǔn)確性遠(yuǎn)不如化學(xué)發(fā)光的方法，而且我們克服了 ELISA的非均相反應(yīng)所帶來的本底高特異性不好的缺點。
[0006]過敏性疾病是指由變態(tài)反應(yīng)機(jī)制引起的疾病。變態(tài)反應(yīng)又稱超敏反應(yīng)，是免疫機(jī)體再次接觸相同變應(yīng)原時發(fā)生的反應(yīng)過渡劇烈而引起生理功能紊亂和(或)組織損傷的病理性免疫反應(yīng)。變態(tài)反應(yīng)性疾病(又稱過敏性疾病)包括特應(yīng)性皮炎、食物過敏、變應(yīng)性鼻炎和過敏性哮喘等，其發(fā)病率日益增高，且病情逐趨復(fù)雜化。WHO已將變態(tài)反應(yīng)性疾病列為21世紀(jì)重點研究和防治的疾病。近年，隨著免疫組化、分子生物學(xué)技術(shù)和臨床新技術(shù)，如纖維支氣管鏡的開展，已對該病達(dá)成共識，即其屬于過敏性炎癥，在炎癥區(qū)有大量炎癥細(xì)胞(包括嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞等)浸潤。該病的發(fā)病主要涉及過敏原、抗體、細(xì)胞、受體和介質(zhì)5個環(huán)節(jié)。當(dāng)過敏原激發(fā)后，在15-20分鐘所發(fā)生的速發(fā)相反應(yīng)主要與肥大細(xì)胞有關(guān)，而在激發(fā)后4-24小時所發(fā)生的遲發(fā)相反應(yīng)則被認(rèn)為有嗜酸粒細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞參與。這兩個時相的反應(yīng)均依賴于T淋巴細(xì)胞，特別是輔助T細(xì)胞(TH)中的一個亞型TH2。過敏原是引起過敏性炎癥的原因，因此若能發(fā)現(xiàn)致敏變應(yīng)原種類，則對防治過敏性疾病有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單的屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒、其制備及其使用方法。
[0008]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:
一種屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒，所述試劑盒含有如下組分:磁分離試劑，過敏原試劑，酶反應(yīng)物，校準(zhǔn)品、質(zhì)控品，濃縮清洗液，底物A液和底物B液；其中，過敏原試劑含有生物素標(biāo)記的特異性過敏原，磁分離試劑含有包被有抗人IgE抗體的磁微粒，所述底物A液為含魯米諾試劑，底物B液為含過氧化物試劑，所述酶反應(yīng)物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素試劑。所述濃縮清洗液為含有吐溫的磷酸鹽緩沖液濃縮清洗試劑。
[0009]一種屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒的制備方法，其中制備過程如下:
步驟一、磁分離試劑的制備一、磁微粒緩沖液配制
(I)、稱取 TRIS (三羥甲基氨基甲烷)4.58g/L，NaCl 6.81g/L, TRITON X-100 (聚乙二醇單辛基苯基醚)0.5ml/L于IL容器中；(2)、量取防腐劑Proclin-300 0.5-lml于IL容器中；量取800ml純化水于上述容器，充分?jǐn)嚢瑁?3)、調(diào)節(jié)pH值到7.95-8.05之間；(4)、稱取牛血清白蛋白BSA 3-5g至上述IL容器中；(5)、最后定容至1000ml，0.22 μ m微孔濾器過濾；做好標(biāo)記于2-8°C冷庫貯存。
[0010]二、磁分離試劑的制備
(I)、將1.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50 μ I 二甲基亞砜DMSO中，取2mg抗人IgE抗體溶于PH 9.0-9.5的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液中至總體積為Iml ; (2)、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到上述抗人IgE抗體溶液中，置室溫90min ;(3)、然后將抗體溶液加入到Centricon-1O濃縮管中，放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下濃縮30min至體積為0.5ml ； (4)、取0.5ml磁珠加入5ml反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；(5)、每次加入1.5ml pH9.5的0.lmol/L的PB緩沖液(磷酸鹽緩沖液)，混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；將獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時；(6)、加入0.3ml lmol/L的TRIS溶液37°C 15分鐘；(7)、每次加入1.5ml ρΗ7.2的0.lmol/L的PB緩沖液清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；(8)、用10ml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶，即為
0.05%的IgE磁分離試劑；磁珠保存液配方為0.1% BSA，0.05%吐溫-20，0.02% NaN3,20%乙醇，4°C保存；(9)、將獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1:1的比例混勻，即得磁分離試劑；
步驟二、過敏原試劑的制備
一、過敏原稀釋液的配置
(I)、稱取 TRIS (三羥甲基氨基甲烷)4.58g/L, NaCl 6.81g/L, TRITON X-100 0.5ml/L于IL容器中；(2)、量取Proclin-300 0.5-lml于IL容器中；量取800ml純化水于上述容器，充分?jǐn)嚢瑁?3)、調(diào)節(jié)pH值到7.95-8.05之間；(4)、稱取BSA 3_5g至上述IL容器中；
(5)、最后定容至1000ml，0.22 μ m微孔濾器過濾；做好標(biāo)記于2_8°C冷庫貯存；
二、生物素偶聯(lián)的過敏原的配置
將生物素標(biāo)記的屋塵螨過敏原按照0.1-1.0 μ g/ml的濃度，使用過敏原稀釋液進(jìn)行稀釋。
[0011]步驟三、酶反應(yīng)物的制備
一、酶反應(yīng)物稀釋液配置
(I)、取TRIS 4.846g、HCl 2847 μ I于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢枋乖噭┩耆芙猓?2)、調(diào)pH，控制在7.35-7.45 ; (3)、稱取BSA 4g至上述燒瓶中；
(4)、最后燒杯定容至1000ml,用0.22 μ m微孔濾器過濾即得。
[0012]二、酶反應(yīng)物的配置
按照1:2000-1:5000的稀釋體積比例，使用酶反應(yīng)物稀釋液對辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行稀釋，混合均勻即得酶反應(yīng)物。
[0013]步驟四、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品的制備一、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品稀釋液的配置
(I)、稱取Tris 7.268g和HCl 4270 μ I于IL的容器中，定容至600ml ; (2)、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，即為校準(zhǔn)品稀釋液，2-8°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0014]二、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品的配置
校準(zhǔn)品的濃度為0,0.35,0.7,3.5,17.5、100KU/L，質(zhì)控品的濃度分別為0.35,17.5KU/L.使用校準(zhǔn)品、質(zhì)控品稀釋液按照以上濃度進(jìn)行稀釋。校準(zhǔn)品、質(zhì)控品所含物質(zhì)為純化的人IgE抗體。
[0015]步驟五、濃縮清洗液的配制
(I)、稱取 KCl 4g、NaCl 40g、蔗糖 1g 于 IL 容器中；(2)、稱取 0.225g Tween-20 于10ml容器中加15ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；(3)、量取Proclin-300
0.225ml至上述IL容器中；(4)、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓?5)、調(diào)pH至7.35-7.45之間；(6)、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.22 μ m微孔濾器過濾即得。
[0016]步驟六、底物液(含A液和B液)的制備
一、底物A液的配置
(I)、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、魯米諾1.0g和對碘苯酚0.1mg于IL燒杯中；(2)、用量筒量取400ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，調(diào)節(jié)pH值至7.95-8.05之間；(3)、用0.22 μ m微孔濾器過濾,收集濾液,用純化水定容至500ml,混勻后即得。
[0017]二、底物B液的配置
(1)、稱取硼砂5.721g、硼酸 2.474g、過氧化脲 0.1g 和 Proclin-300 250ul 于 IL 燒杯中；(2)、用量筒量取400ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，調(diào)pH值至7.95-8.05之間；(3)、用0.22 μ m微孔濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500ml，混勻后即得。
[0018]一種屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒的使用方法，其包括檢測步驟如下:
采用的反應(yīng)容器為常見的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)平底試管。
[0019](I)、加入50μ I磁分離試劑至化學(xué)發(fā)光反應(yīng)管底；
(2)、加入50μ I標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、待檢血清至化學(xué)發(fā)光反應(yīng)管底；
(3)、用多功能均勻混合器輕輕振蕩反應(yīng)管30s后，置37°C恒溫箱反應(yīng)15分鐘； (4)、反應(yīng)管放至磁分離器上，確保每個管底都與分離器表面接觸，沉淀2-3分鐘；緩慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，用力在吸水紙上將反應(yīng)管內(nèi)的液體拍干，以除去粘在反應(yīng)管中的液滴；
(5)、濃縮清洗液用純化水稀釋20倍后，加300-500μI稀釋后的清洗液至每一反應(yīng)管中，置多功能均勻混合器上輕輕振蕩混勻30s ；
(6)、重復(fù)步驟(4)、(5)、(4)一遍；
(7)、加入50μ I過敏原試劑至反應(yīng)管底；
(8)、加入50μ I酶反應(yīng)物至反應(yīng)管底；
(9)、用多管均勻混合器輕輕振蕩反應(yīng)管30s后，置37°C恒溫箱反應(yīng)15分鐘；
(10)、重復(fù)步驟(4)、(5)、(6)—遍；
(11)、加入50μ I底物液A和50 μ I底物液B至反應(yīng)管底手動混勻(或放置在多管均勻混合器上輕輕震蕩5-lOs)，迅速用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測；
(12)、根據(jù)校準(zhǔn)品采用四參數(shù)擬合方式擬合一條曲線，通過曲線計算待檢樣本所含的屋塵螨過敏原特異性IgE抗體的濃度。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒，其檢測方法為化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)和磁微粒分離技術(shù)相結(jié)合的一種檢測方法，同時采用了酶免的捕獲方法，具有操作方便、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、快速和無污染的特點。
[0021]工作原理:
本發(fā)明為捕獲法化學(xué)發(fā)光免疫分析法與磁微粒分離技術(shù)相結(jié)合的一種檢測方法。用包被有抗人IgE的磁微粒與血清中的人IgE反應(yīng)，在外加磁場的作用下直接沉淀，然后加入生物素標(biāo)記的屋塵螨過敏原，偶聯(lián)在磁微粒上的人IgE中的過敏原特異性IgE抗體捕獲生物素標(biāo)記的屋塵螨過敏原，經(jīng)洗滌后，加入鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，催化底物發(fā)光。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時便發(fā)出光子，形成發(fā)光反應(yīng)，即可使用發(fā)光儀檢測反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度。在檢測范圍內(nèi)，反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度與樣本中的屋塵螨過敏原特異性IgE抗體濃度成正比。

【具體實施方式】
[0022]實施例1
一種屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒，所述試劑盒含有如下組分:磁分離試劑，過敏原試劑，酶反應(yīng)物，校準(zhǔn)品、質(zhì)控品，濃縮清洗液，底物A液和底物B液；其中，過敏原試劑含有生物素標(biāo)記的特異性過敏原，磁分離試劑含有包被有抗人IgE抗體的磁微粒，所述底物A液為含魯米諾試劑，底物B液為含過氧化物試劑，所述酶反應(yīng)物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素試劑。所述濃縮清洗液為含有吐溫的磷酸鹽緩沖液濃縮清洗試劑。
[0023]實施例2:
上述實施例1記載的一種屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒，其制備方法如下:
步驟一、磁分離試劑的制備一、磁微粒緩沖液配制
(I)、稱取 TRIS (三羥甲基氨基甲烷)4.58g/L，NaCl 6.81g/L, TRITON X-1OO (聚乙二醇單辛基苯基醚)0.5ml/L于IL容器中；(2)、量取防腐劑Proclin-300 0.5_lml于IL容器中；量取800ml純化水于上述容器，充分?jǐn)嚢瑁?3)、調(diào)節(jié)pH值到7.95-8.05之間；(4)、稱取牛血清白蛋白BSA 3-5g至上述IL容器中；(5)、最后定容至1000ml，0.22 μ m微孔濾器過濾；做好標(biāo)記于2-8°C冷庫貯存。
[0024]二、磁分離試劑的制備
(I )、將1.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50 μ I 二甲基亞砜DMSO中，取2mg抗人IgE抗體溶于PH 9.0-9.5的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液中至總體積為Iml ; (2)、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到上述抗人IgE抗體溶液中，置室溫90min ;(3)、然后將抗體溶液加入到Centricon-1O濃縮管中，放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下濃縮30min至體積為0.5ml ； (4)、取0.5ml磁珠加入5ml反應(yīng)杯中,放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；(5)、每次加入1.5ml pH9.5的0.lmol/L的PB緩沖液(磷酸鹽緩沖液)，混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；將獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時；(6)、加入0.3ml lmol/L的TRIS溶液37°C 15分鐘；(7)、每次加入1.5ml ρΗ7.2的0.lmol/L的PB緩沖液清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；(8)、用10ml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶，即為
0.05%的IgE磁分離試劑；磁珠保存液配方為0.1% BSA，0.05%吐溫-20，0.02% NaN3,20%乙醇，4°C保存；(9)、將獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1:1的比例混勻，即得磁分離試劑；
步驟二、過敏原試劑的制備
一、過敏原稀釋液的配置
(I)、稱取 TRIS (三羥甲基氨基甲烷)4.58g/L, NaCl 6.81g/L, TRITON X-100 0.5ml/L于IL容器中；(2)、量取Proclin-300 0.5_lml于IL容器中；量取800ml純化水于上述容器，充分?jǐn)嚢瑁?3)、調(diào)節(jié)PH值到7.95-8.05之間；(4)、稱取BSA 3_5g至上述IL容器中；
(5)、最后定容至1000ml，0.22 μ m微孔濾器過濾；做好標(biāo)記于2_8°C冷庫貯存；
二、生物素偶聯(lián)的過敏原的配置
將生物素標(biāo)記的屋塵螨過敏原按照0.1-1.0 μ g/ml的濃度，使用過敏原稀釋液進(jìn)行稀釋。
[0025]步驟三、酶反應(yīng)物的制備
一、酶反應(yīng)物稀釋液配置
(I)、取TRIS 4.846g、HCl 2847 μ I于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢枋乖噭┩耆芙猓?2)、調(diào)pH，控制在7.35-7.45 ; (3)、稱取BSA 4g至上述燒瓶中；(4)、最后燒杯定容至1000ml,用0.22 μ m微孔濾器過濾即得。
[0026]二、酶反應(yīng)物的配置
按照1:2000-1:5000的稀釋體積比例，使用酶反應(yīng)物稀釋液對辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行稀釋，混合均勻即得酶反應(yīng)物。
[0027]步驟四、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品的制備一、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品稀釋液的配置 (I)、稱取Tris 7.268g和HCl 4270 μ I于IL的容器中，定容至600ml ; (2)、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，即為校準(zhǔn)品稀釋液，2-8°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0028]二、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品的配置
校準(zhǔn)品的濃度為0,0.35,0.7,3.5,17.5、100KU/L，質(zhì)控品的濃度分別為0.35,17.5KU/L.使用校準(zhǔn)品、質(zhì)控品稀釋液按照以上濃度進(jìn)行稀釋。校準(zhǔn)品、質(zhì)控品所含物質(zhì)為純化的人IgE抗體。
[0029]步驟五、濃縮清洗液的配制
(I)、稱取 KCl 4g、NaCl 40g、蔗糖 1g 于 IL 容器中；(2)、稱取 0.225g Tween-20 于10ml容器中加15ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；(3)、量取Proclin-300
0.225ml至上述IL容器中；(4)、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓?5)、調(diào)pH至7.35-7.45之間；(6)、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.22 μ m微孔濾器過濾即得。
[0030]步驟六、底物A液的配置
(I)、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、魯米諾1.0g和對碘苯酚0.1mg于IL燒杯中；(2)、用量筒量取400ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓{(diào)節(jié)pH值至7.95-8.05之間；(3)、用0.22 μ m微孔濾器過濾,收集濾液,用純化水定容至500ml,混勻后即得。
[0031]步驟七、底物B液的配置
(I)、稱取硼砂 5.721g、硼酸 2.474g、過氧化脲 0.1g 和 Proclin-300 250ul 于 IL 燒杯中；(2)、用量筒量取400ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，調(diào)pH值至7.95-8.05之間；(3)、用0.22 μ m微孔濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500ml，混勻后即得。
[0032]實施例3:
實施例2制備的屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒的使用方法如下:
(1)、加入50μ I磁分離試劑至化學(xué)發(fā)光反應(yīng)管底；
(2)、加入50μ I標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、待檢血清至化學(xué)發(fā)光反應(yīng)管底；
(3)、用多功能均勻混合器輕輕振蕩反應(yīng)管30s后，置37°C恒溫箱反應(yīng)15分鐘；
(4)、反應(yīng)管放至磁分離器上，確保每個管底都與分離器表面接觸，沉淀2-3分鐘；緩慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，用力在吸水紙上將反應(yīng)管內(nèi)的液體拍干，以除去粘在反應(yīng)管中的液滴；
(5)、濃縮清洗液用純化水稀釋20倍后，加300-500μI稀釋后的清洗液至每一反應(yīng)管中，置多功能均勻混合器上輕輕振蕩混勻30s ；
(6)、重復(fù)步驟(4)、(5)、(4)一遍；
(7)、加入50μ I過敏原試劑至反應(yīng)管底；
(8)、加入50μ I酶反應(yīng)物至反應(yīng)管底；
(9)、用多管均勻混合器輕輕振蕩反應(yīng)管30s后，置37°C恒溫箱反應(yīng)15分鐘；
(10)、重復(fù)步驟(4)、(5)、(6)—遍；
(11)、加入50μ I底物A液和50 μ I底物B液至反應(yīng)管底手動混勻(或放置在多管均勻混合器上輕輕震蕩5-lOs)，迅速用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測；
(12)、根據(jù)校準(zhǔn)品采用四參數(shù)擬合方式擬合一條曲線，通過曲線計算待檢樣本所含的屋塵螨過敏原特異性IgE抗體的濃度。
【權(quán)利要求】
1.一種屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有如下組分:磁分離試劑，過敏原試劑，酶反應(yīng)物，校準(zhǔn)品、質(zhì)控品，濃縮清洗液，底物A液和底物B液；其中，過敏原試劑含有生物素標(biāo)記的特異性過敏原，磁分離試劑含有包被有抗人IgE抗體的磁微粒，所述底物A液為含魯米諾試劑，底物B液為含過氧化物試劑，所述酶反應(yīng)物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒，其特征在于:所述濃縮清洗液為含有吐溫的磷酸鹽緩沖液濃縮清洗試劑。
3.制備如權(quán)利要求1或2所述的一種屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒的方法，其特征在于包括如下步驟: 步驟一、磁分離試劑的制備 一、磁微粒緩沖液配制
(I)、稱取 TRIS 4.58g/L, NaCl 6.81g/L, TRITON X-1OO 0.5ml/L 于 IL 容器中;(2)、量取防腐劑Proclin300 0.5-lml于IL容器中；量取800ml純化水于上述容器，充分?jǐn)嚢瑁?3)、調(diào)節(jié)pH值到7.95-8.05之間；(4)、稱取牛血清白蛋白BSA 3_5g至上述IL容器中；(5)、最后定容至1000ml，0.22 μ m微孔濾器過濾；做好標(biāo)記于2_8°C冷庫貯存； 二、磁分離試劑的制備 (I)、將1.0mg辛二酸二琥拍酰亞胺酯溶于50 μ I 二甲基亞砜中，取2mg抗人IgE抗體溶于pH 9.0-9.5的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液中至總體積為Iml ; (2)、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到上述抗人IgE抗體溶液中，置室溫90min ; (3)、然后將抗體溶液加入到Centricon-1O濃縮管中，放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下濃縮30min至體積為0.5ml ； (4)、取0.5ml磁珠加入5ml反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；(5)、每次加入1.5ml pH9.5的0.lmol/L的PB緩沖液，混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；將獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時；(6)、加入0.3ml lmol/L的TRIS溶液37°C 15分鐘；(7)、每次加入1.5ml pH7.2的0.lmol/L的PB緩沖液清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；(8)、用10ml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶，即為0.05%的IgE磁分離試劑；磁珠保存液配方為0.1% BSA，0.05%吐溫-20，0.02% NaN3, 20%乙醇，4°C保存；(9)、將獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1:1的比例混勻，即得磁分離試劑； 步驟二、過敏原試劑的制備 一、過敏原稀釋液的配置
(I)、稱取 TRIS 4.58g/L, NaCl 6.81g/L, TRITON X-100 0.5ml/L 于 IL 容器中；(2)、量取Proclin-300 0.5-lml于IL容器中；量取800ml純化水于上述容器，充分?jǐn)嚢瑁?3)、調(diào)節(jié)pH值到7.95-8.05之間；(4)、稱取BSA 3_5g至上述IL容器中；(5)、最后定容至1000ml, 0.22 μ m微孔濾器過濾；做好標(biāo)記于2_8°C冷庫貯存； 二、生物素偶聯(lián)的過敏原的配置 將生物素標(biāo)記的屋塵螨過敏原按照0.1-1.ομ g/ml的濃度，使用過敏原稀釋液進(jìn)行稀釋； 步驟三、酶反應(yīng)物的制備 一、酶反應(yīng)物稀釋液配置 (I)、取TRIS 4.846g、HCl 2847 μ I于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢枋乖噭┩耆芙猓?2)、調(diào)pH，控制在7.35-7.45 ; (3)、稱取BSA 4g至上述燒瓶中；(4)、最后燒杯定容至1000ml,用0.22 μ m微孔濾器過濾即得； 二、酶反應(yīng)物的配置 按照1:2000-1:5000的稀釋體積比例，使用酶反應(yīng)物稀釋液對辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行稀釋，混合均勻即得酶反應(yīng)物； 步驟四、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品的制備 一、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品稀釋液的配置 (I)、稱取Tris 7.268g和HCl 4270 μ I于IL的容器中，定容至600ml ; (2)、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，即為校準(zhǔn)品稀釋液，2-8°C儲存?zhèn)溆茫? 二、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品的配置 校準(zhǔn)品的濃度為0,0.35,0.7,3.5,17.5、100KU/L，質(zhì)控品的濃度分別為0.35,17.5KU/L ;使用校準(zhǔn)品、質(zhì)控品稀釋液按照以上濃度進(jìn)行稀釋； 校準(zhǔn)品、質(zhì)控品所含物質(zhì)為純化的人IgE抗體； 步驟五、濃縮清洗液的配制 (I)、稱取 KCl 4g、NaCl 40g、蔗糖 1g 于 IL 容器中；(2)、稱取 0.225g Tween-20于10ml容器中加15ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；(3)、量取Proclin-3000.225ml至上述IL容器中；(4)、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?(5)、調(diào)pH至7.35-7.45之間；(6)、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.22 μ m微孔濾器過濾即得； 步驟六、底物液的制備 一、底物A液的配置 (I)、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、魯米諾1.0g和對碘苯酚0.1mg于IL燒杯中；(2)、用量筒量取400ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，調(diào)節(jié)pH值至7.95-8.05之間；(3)、用0.22 μ m微孔濾器過濾，收集濾液，用純化水定容至500ml，混勻后即得； 二、底物B液的配置 (I)、稱取硼砂 5.721g、硼酸 2.474g、過氧化脲 0.1g 和 Proclin-300 250ul 于 IL 燒杯中；(2)、用量筒量取400ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，調(diào)pH值至7.95-8.05之間；(3)、用0.22 μ m微孔濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500ml，混勻后即得。
4.一種屋塵螨過敏原特異性IgE抗體定量檢測試劑盒的使用方法，其特征在于其包括檢測步驟如下: (1)、加入50μ I磁分離試劑至化學(xué)發(fā)光反應(yīng)管底； (2)、加入50μ I標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、待檢血清至化學(xué)發(fā)光反應(yīng)管底； (3)、用多功能均勻混合器輕輕振蕩反應(yīng)管30s后，置37°C恒溫箱反應(yīng)15分鐘； (4)、反應(yīng)管放至磁分離器上，確保每個管底都與分離器表面接觸，沉淀2-3分鐘；緩慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，用力在吸水紙上將反應(yīng)管內(nèi)的液體拍干，以除去粘在反應(yīng)管中的液滴； (5)、濃縮清洗液用純化水稀釋20倍后，加300-500μ I稀釋后的清洗液至每一反應(yīng)管中，置多功能均勻混合器上輕輕振蕩混勻30s ； (6)、重復(fù)步驟(4)、(5)、(4)一遍； (7)、加入50μ I過敏原試劑至反應(yīng)管底； (8)、加入50μ I酶反應(yīng)物至反應(yīng)管底； (9)、用多管均勻混合器輕輕振蕩反應(yīng)管30s后，置37°C恒溫箱反應(yīng)15分鐘； (10)、重復(fù)步驟(4)、(5)、(6)—遍； (11)、加入50μ I底物液A和50 μ I底物液B至反應(yīng)管底手動混勻或放置在多管均勻混合器上輕輕震蕩5-lOs，迅速用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測； (12)、根據(jù)校準(zhǔn)品采用四參數(shù)擬合方式擬合一條曲線，通過曲線計算待檢樣本所含的屋塵螨過敏原特異性IgE抗體的濃度。
【文檔編號】G01N33/558GK104165987SQ201410397013
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】葉興旺, 奚偉紅 申請人:江蘇福隆生物技術(shù)有限公司