一種抗CBir1抗體檢測(cè)試紙的制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗CBir1抗體層析試紙條、制備方法及應(yīng)用。該試紙條包括樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、分析膜(3)、吸水墊(6)、底板(7)、檢測(cè)帶T線(4)和質(zhì)控帶C線(5)，所述底板(7)的上部貼合有分析膜(3)，所述分析膜(3)上部的兩端分別貼合有結(jié)合墊(2)和吸水墊(6)，結(jié)合墊(2)上部的一端貼合有樣品墊(1)，檢測(cè)帶T線(4)和質(zhì)控帶C線(5)設(shè)置在分析膜(3)上。本發(fā)明用CBir1抗原蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中抗CBir1抗體的高靈敏度、高特異性快速檢測(cè)，為臨床克隆恩病等自體免疫性疾病的輔助診斷提供依據(jù)。
【專利說明】-種抗CBi r1抗體檢測(cè)試紙的制備方法及用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫分析檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)CBirl的免疫層 析檢測(cè)試紙的制備方法及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] IBD是北美和歐洲的常見病，近30年來日本IBD發(fā)病率亦呈逐步增高趨勢(shì)，我國雖 尚無普通人群的流行病學(xué)資料，但近10多年來本病就診人數(shù)呈逐步增加趨勢(shì)則非常明顯。 IBD的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，不僅有消化道癥狀，還可有腸外表現(xiàn)。由于癥狀為腹痛、腹瀉、便 血等非特異性腸炎表現(xiàn)，CD與UC，以及IBD與結(jié)核性腸炎等其他腸道慢性疾病很難鑒別診 斷。
[0003] 目前鑒別UC與⑶的生物標(biāo)志物主要集中在自身免疫抗體與抗微生物抗體，CBirl 是從一種自發(fā)產(chǎn)生結(jié)直腸炎的C3H/HeJBir大鼠的血清學(xué)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌鞭毛蛋白。研究證明 CBirl參與多種炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與核因子NF-KB的激活有關(guān)。近來研究發(fā)現(xiàn)，CBirl與某 些非典型克隆恩病的發(fā)病有關(guān)，是克隆恩病相關(guān)抗原。CBirl能分別與來自克隆恩病患者 和結(jié)直腸炎大鼠的血清蛋白IgG發(fā)生反應(yīng)，而與正常人IgG無反應(yīng)。這些鞭毛蛋白的序列 已被證明含有種族發(fā)育結(jié)構(gòu)功能保守的氨基末端和羧基末端，而且還附有一個(gè)具預(yù)測(cè)功能 的類似沙門氏菌fliC基因的三維結(jié)構(gòu)，其上帶有一個(gè)完整的TLR5結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合對(duì)鞭毛 蛋白在大鼠和人體上激發(fā)的免疫應(yīng)答有限性的研究，提示CBirl對(duì)宿主細(xì)菌在腸道內(nèi)的慢 性炎癥的誘發(fā)和維持起了重要作用。通過對(duì)CBirl的血清反應(yīng)來識(shí)別克隆恩病，發(fā)現(xiàn)其與 復(fù)雜的克隆恩病患者的異常亞型有關(guān)；通過利用來自結(jié)腸炎大鼠的血清以及與來自大鼠盲 腸細(xì)菌的DNA噬菌體基因庫的血清學(xué)表達(dá)克隆分化，發(fā)現(xiàn)CBirl的血清學(xué)免疫應(yīng)答的優(yōu)勢(shì)； 當(dāng)把表達(dá)CBirl的內(nèi)源性細(xì)菌菌株轉(zhuǎn)移入重度免疫缺陷大鼠體內(nèi)時(shí)，CBirl激發(fā)的⑶4+Thl 細(xì)胞株能誘發(fā)結(jié)腸炎，提示CBirl在大鼠結(jié)腸炎中是免疫顯性的。而在克隆恩病中，Thl細(xì) 胞被過度激活，產(chǎn)生大量的Thl型細(xì)胞因子（如：TNF-a、IFN - 7、IL-12等），導(dǎo)致過度的 炎癥和腸道黏膜的損傷。所以，CBirl與腸道炎癥，特別是與克隆恩病之間存在一定的相關(guān) 性?？寺《鞑∈且环N機(jī)體直接針對(duì)共生腸道菌群產(chǎn)生異常免疫應(yīng)答的疾病，并且證明了共 生腸道鞭毛蛋白是克隆恩病免疫應(yīng)答相關(guān)的特殊抗原靶位點(diǎn)。因此提示CBirl不僅可通過 激活TLR5表達(dá)而引起炎癥，而且還可能在獲得性免疫反應(yīng)中起到一定的作用，從而維持克 隆恩病的慢性炎癥的特征。
[0004] 抗CBirl抗體是在IBD大鼠模型上被發(fā)現(xiàn)的引起結(jié)直腸炎的第1個(gè)細(xì)菌抗原抗 體，可以導(dǎo)致IBD患者發(fā)生病理上的免疫應(yīng)答。抗CBirl抗體檢測(cè)的臨床意義研究已發(fā)現(xiàn) 針對(duì)CBirl的血清抗體的存在標(biāo)記克隆恩病的一類亞群。
[0005] 免疫層析法（immunochromatography)是近幾年來興起的一種快速診斷技術(shù)，其 原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的纖維 素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至 固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成肉眼可見的檢 測(cè)帶?，F(xiàn)有的免疫層析試紙條產(chǎn)品常用的示蹤標(biāo)記粒子有納米金、納米硒、彩色膠乳等等， 其中以納米金應(yīng)用最為廣泛，納米金也稱為膠體金。
[0006] 以膠體金作為失蹤標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)特稱為免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidal gold technique，GICT)。膠體金是由氯金酸（HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞血 酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定 的膠體狀態(tài)而得名。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢 固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì) 結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物 理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而 使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。
[0007] 表面帶活性基團(tuán)的彩色膠乳微球也可以作為免疫層析的示蹤劑，與膠體金技術(shù)一 樣，彩色膠乳標(biāo)記免疫層析技術(shù)也具有操作簡(jiǎn)便、試劑穩(wěn)定、快速出結(jié)果、可室溫保存等優(yōu) 點(diǎn)。彩色膠乳標(biāo)記是將不同直徑范圍〇. lum-lum彩色膠乳微球與含有羧基、氨基、羥基等酯 類或其他大分子物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，使這些大分子標(biāo)記上顏色，當(dāng)在檢測(cè)線或質(zhì)控線上富集停 留后形成肉眼可見的彩色條帶。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)ELISA和化學(xué)發(fā)光法相比，免疫層析法檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)主要包括：（1)使用 方便快速，便于基層使用和現(xiàn)場(chǎng)使用，所有反應(yīng)能在20分鐘內(nèi)完成；（2)成本低，不需要特 殊的儀器設(shè)備；(3)應(yīng)用范圍廣，可適應(yīng)多種檢測(cè)條件；(4)可以進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)，若陽性樣本 比較難獲得，多項(xiàng)檢測(cè)可以節(jié)省樣品，降低成本；（5)標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記樣品在4°C貯存兩年 年以上，無信號(hào)衰減現(xiàn)象；(6)膠體金本身為紅色，不需要加入發(fā)色試劑，省卻了酶標(biāo)的致 癌性底物及終止液的步驟，對(duì)人體無毒害。
[0009] 在IBD診斷方面，基于抗CBirl抗體檢測(cè)的試劑已經(jīng)用于商業(yè)用途的只有美國 Promethues實(shí)驗(yàn)室的ELISA試劑，以及本公司開發(fā)的化學(xué)發(fā)光試劑，抗CBirl的免疫層析試 紙?jiān)趪鴥?nèi)外市場(chǎng)上仍沒有問世。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有方法的不足，將免疫層析法應(yīng)用到抗 CBirl抗體的檢測(cè)中，通過把CBirl抗原蛋白包被在結(jié)合墊或分析膜的檢測(cè)帶上，實(shí)現(xiàn)對(duì) 樣品中抗CBirl抗體的高特異、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的檢測(cè)，快速篩查抗CBirl抗體陽性標(biāo) 本，為臨床UC等自體免疫性疾病提供快速的輔助診斷。
[0011] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種快速、準(zhǔn)確的抗CBirl抗體的免疫層析檢測(cè)試紙 條及制備方法，目的之二是提供一種基于免疫層析技術(shù)的抗CBirl抗體檢測(cè)方法。
[0012] 作為本發(fā)明第一個(gè)方面的一種抗CBirl抗體的免疫層析檢測(cè)試紙條，包括樣品 墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊和底板，分析膜上設(shè)置檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，所述底板的上部貼合有 分析膜，分析膜上部的兩端分別貼合有結(jié)合墊和吸水墊，結(jié)合墊上部的一端貼合有樣品墊。
[0013] 所述的結(jié)合墊結(jié)合膠體金標(biāo)記蛋白或彩色膠乳標(biāo)記蛋白；所述的結(jié)合墊為1層 (圖1)或
[0014] 2層（圖2)，其中2層時(shí)錯(cuò)落與分析膜搭接。
[0015] 所述抗CBirl抗體的免疫層析檢測(cè)試紙條的制備方法，包括以下步驟：
[0016] 步驟1. CBirl抗原蛋白的制備
[0017] 步驟2.結(jié)合墊⑵制備
[0018] (1)納米金標(biāo)記物的制備：用20?40nm粒徑的納米金溶液標(biāo)記CBirl抗原蛋白、 抗人IgG抗體、葡萄球菌A蛋白（SPA)、鏈球菌G蛋白（Protein G)，以及其他與質(zhì)控帶C線 能形成免疫復(fù)合物的蛋白。
[0019] (2)彩色膠乳標(biāo)記物的制備：用帶活性氨基或羧基基團(tuán)的彩色膠乳標(biāo)記CBirl抗 原蛋白、抗人IgG抗體、葡萄球菌A蛋白（SPA)、鏈球菌G蛋白（Protein G)，以及其他與質(zhì) 控帶C線能形成免疫復(fù)合物的蛋白。
[0020] (3)結(jié)合墊（2)制備：玻璃纖維膜或聚脂膜作為結(jié)合墊，先用含BSA和糖的緩沖液 預(yù)處理并烘干，將步驟（1)制備的納米金標(biāo)記物或膠乳標(biāo)記物，用噴涂?jī)x噴涂在預(yù)處理的 玻璃纖維膜或聚脂膜上，干燥備用。
[0021] 步驟3.分析膜（3)制備
[0022] (1)檢測(cè)帶T線（4)制備：根據(jù)結(jié)合墊標(biāo)記蛋白類型選擇檢測(cè)帶T線包被蛋白，如 結(jié)合墊上的結(jié)合蛋白含CBirl，檢測(cè)帶T線的包被蛋白是抗人IgG。如果結(jié)合墊上含有抗人 IgG，檢測(cè)帶T線包被蛋白為CBirl。
[0023] (2)質(zhì)控帶C線（5)制備：根據(jù)結(jié)合墊的標(biāo)記蛋白類型選擇質(zhì)控帶的包被蛋白，如 結(jié)合墊標(biāo)記蛋白是單一的CBirl，質(zhì)控帶C線的包被蛋白為抗CBirl的抗體；如果結(jié)合墊標(biāo) 記蛋白是單一的抗人IgG抗體，質(zhì)控帶C線的標(biāo)記蛋白為對(duì)應(yīng)的抗人IgG抗體的抗體；或者 其他結(jié)合墊標(biāo)記蛋白形成免疫復(fù)合物的蛋白。
[0024] 步驟4.樣品墊制備
[0025] 將玻璃纖維膜或聚酯膜經(jīng)緩沖液浸漬烘干備用，或者直接使用。
[0026] 步驟5.試紙條組裝
[0027] 把步驟1?4所制作完成的材料，按圖1或圖2搭接，根據(jù)底板的規(guī)格切割成一定 的長(zhǎng)度和寬度，安裝在底板和卡殼里。優(yōu)選地，試紙條長(zhǎng)度為6. 5cm，寬度為3_或4_。
[0028] 所述的CBirl抗原蛋白是把全長(zhǎng)CBirl基因或者含有重要抗原表位的基因序列， 克隆到原核或真核表達(dá)載體里，表達(dá)純化獲得。
[0029] 所述的CBirl抗原蛋白是用多肽合成儀合成含有CBirl重要抗原表位的CBirl多 肽，并偶聯(lián)到載體蛋白上而獲得。
[0030] 所述的抗人IgG抗體為鼠源、兔源、羊源、馬源、駱駝源或豚鼠源中的一種或多種 單克隆抗體或多克隆抗體。
[0031] 所述的抗CBirl的抗體是以CBirl為免疫源，鼠源、兔源、羊源、馬源、駱駝源或豚 鼠源中的一種或多種單克隆抗體或多克隆抗體。
[0032] 所述的抗人IgG抗體的抗體是指能與該抗體形成免疫復(fù)合物的抗體，比如該抗人 IgG抗體是鼠抗人IgG，它的抗體是羊抗鼠 IgG的抗體或其他非鼠源的鼠 IgG抗體。
[0033] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種抗CBirl抗體檢測(cè)方法，用本發(fā)明第一方面方法 及步驟所制備的抗CBirl抗體免疫層析試紙條，對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟：
[0034] (1)樣本處理：取血清、血漿或全血樣本，用加樣緩沖液稀釋0?100倍；
[0035] (2)把上述處理過的樣品滴加到試紙條的樣品墊上，靜置5?20分鐘，觀察T線和 C線；
[0036] (3)結(jié)果判讀：T線和C線均顯現(xiàn)，結(jié)果為陽性；T線不顯現(xiàn)，C線顯現(xiàn)，結(jié)果為陰性； T線和C線均不顯現(xiàn)，提示試紙失效。
[0037] 本發(fā)明的檢測(cè)原理：
[0038] 選用金標(biāo)/膠乳等標(biāo)記CBirl抗原蛋白或其他能與待檢樣品中目的物結(jié)合的蛋 白，噴涂在結(jié)合墊上，制成結(jié)合墊；在檢測(cè)帶上包被能與標(biāo)記蛋白-目的物蛋白復(fù)合物發(fā) 生免疫反應(yīng)的蛋白，當(dāng)把待檢樣本加樣到樣品墊上后，樣本中的CBirl抗體與結(jié)合墊上的 標(biāo)記蛋白形成免疫復(fù)合物，由于毛細(xì)管效應(yīng)，該復(fù)合物向吸水墊方向泳動(dòng)，此復(fù)合物與包被 于檢測(cè)帶T線上的抗原蛋白發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，形成金標(biāo)/膠乳蛋白-抗CBirl抗 體-CBirl抗原蛋白三聯(lián)體復(fù)合物而被截留在檢測(cè)線上，逐漸富集形成較深的紫紅色條帶 或膠乳顏色；由于毛細(xì)效應(yīng)繼續(xù)泳動(dòng)向前，金標(biāo)/膠乳兔IgG與包被在質(zhì)控線上的羊抗兔 IgG發(fā)生特異的免疫反應(yīng)被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成較深的紫紅色條帶或膠乳顏色， 多余的未結(jié)合的物質(zhì)繼續(xù)層析到吸水墊上，因此在檢測(cè)線和質(zhì)控線都出現(xiàn)條帶的判為陽 性結(jié)果；若血清樣品中不含有抗CBirl抗體，標(biāo)記蛋白到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，不與包被在檢測(cè)線上 的相應(yīng)蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，因此在檢測(cè)線處沒有出現(xiàn)顯色帶，而金標(biāo)/膠乳兔IgG繼續(xù)泳動(dòng) 向前與包被于質(zhì)控線處的相應(yīng)包被蛋白發(fā)生特異的免疫反應(yīng)而被截留，逐漸富集在質(zhì)控線 上形成紫紅色條帶或膠乳顏色，因此僅在質(zhì)控上出現(xiàn)條帶判為陰性結(jié)果。
[0039] 本發(fā)明首次將免疫層析技術(shù)應(yīng)用于抗CBirl抗體檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了高特異性、高靈敏 度的檢測(cè)性能。與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的ELISA和化學(xué)發(fā)光試劑盒相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要包括： 檢測(cè)時(shí)間短（5?20min);不需要任何特殊儀器，可實(shí)現(xiàn)床邊檢測(cè)和門診即時(shí)檢測(cè)；操作簡(jiǎn) 便，只需一步反應(yīng)，操作人員無需培訓(xùn)，檢測(cè)成本低；對(duì)溫度無特殊要求，無需冷凍，儲(chǔ)存運(yùn) 輸方便，室溫可保存24個(gè)月。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1本發(fā)明的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖1。
[0041] 圖2本發(fā)明的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖2。
[0042] 圖3本發(fā)明檢測(cè)帶為1條時(shí)陽性和陰性結(jié)果示意圖3。
[0043] 其中3a是條市不思圖；3b為陽性結(jié)果；3c為陰性結(jié)果；3d和3e表不試紙條失效。

【具體實(shí)施方式】
[0044] 本發(fā)明所述的CBirl抗體檢測(cè)免疫層析試紙，如圖1所示，該試紙是在底板（7)上 由一側(cè)向另一側(cè)順次相互搭接地粘貼分析膜（3)、結(jié)合墊（2)、樣品墊（1)、吸水墊（6)。
[0045] 結(jié)合墊（2)上噴涂有金標(biāo)/膠乳標(biāo)記蛋白，分析膜（3)上設(shè)置檢測(cè)帶（4)和質(zhì)控 帶（5)，根據(jù)結(jié)合墊上標(biāo)記蛋白的不同，選用相應(yīng)的檢測(cè)帶包被蛋白和質(zhì)控帶包被蛋白。優(yōu) 選地，在結(jié)合墊上噴涂的標(biāo)記蛋白為CBirl抗原蛋白和鼠 IgG，則檢測(cè)帶上的包被蛋白為抗 人IgG抗體，質(zhì)控帶上的包被蛋白為抗鼠 IgG。另一優(yōu)選，在結(jié)合墊上噴涂的標(biāo)記蛋白為抗 人IgG抗體，貝U檢測(cè)帶上的包被蛋白為CBirl抗原蛋白。
[0046] 下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0047] 實(shí)施例1. CBirl抗原蛋白制備
[0048] 抗原蛋白制備方法一：重組蛋白
[0049] 1)試劑
[0050] 大腸桿菌宿主菌DH5 α、BL21 (DE3)，克隆載體pCR2. lT-vector，表達(dá)質(zhì)粒 pET28a(+)，DNA聚合酶rTaq，T4DNA連接酶，DNA聚合酶rTaq、LA Taq以及限制性內(nèi)切酶 BamH I、Hind III 和 EcoR I、BamH I，DL2000DNA Marker、T4DNA 連接酶，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋 白，DNA膠回收試劑盒，IPTG等
[0051] 2)儀器
[0052] 普通搖床SCS-24 ;隔水式恒溫電熱培養(yǎng)箱；Biophotometer分光光度計(jì)、臺(tái)式冷凍 離心機(jī)Centrifuge 5810R、臺(tái)式離心機(jī)MiniSpin ;高速冷凍離心機(jī)；蛋白質(zhì)電泳儀以及凝 膠成像系統(tǒng)；PCR儀；超聲裂解儀；恒溫金屬??；HIS蛋白純化柱等。
[0053] 3)實(shí)驗(yàn)方法
[0054] a.載體構(gòu)建：
[0055] 設(shè)計(jì)引物 GGA ATT CCA TAT GGG CAG TTG CAA TTT TCT AGAT 和 CGC GGA TCC CCC AAG TAG CTG GGA TTA CAGA從模板DNA中PCR擴(kuò)增出CBirl片段，膠回收試劑盒回收片段 后連接到pCR2. 1克隆載體進(jìn)行測(cè)序鑒定。將鑒定正確的序列克隆至表達(dá)載體pET28a(+) 中，酶切位點(diǎn)為EcoR I、BamH I，同時(shí)載體上有6XHIS標(biāo)簽，便于后續(xù)的蛋白純化。
[0056] b.表達(dá)
[0057] 將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，通過抗性篩選陽性表達(dá)菌株。將篩選 出來的陽性菌液按1 : 1000的比例接種加有Kan抗性的LB培養(yǎng)基中，每個(gè)菌接種兩管，一 管用于誘導(dǎo)，另一管用于非誘導(dǎo)對(duì)照，同時(shí)要接種一管空質(zhì)粒菌作對(duì)照。37°C過夜培養(yǎng)至 0D600值約為0. 4-0. 6時(shí)，誘導(dǎo)管和空質(zhì)粒對(duì)照管加入IPTG至終濃度為lmmol/L，非誘導(dǎo)對(duì) 照不加，最終選擇表達(dá)能力高的兩個(gè)菌，用于大量的蛋白的表達(dá)。并按照常規(guī)的SDS-PAGE 方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
[0058] c.純化
[0059] 將表達(dá)的產(chǎn)物用HIS蛋白純化柱純化蛋白，并透析脫鹽，經(jīng)測(cè)定純化后的蛋白濃 度為 509mg/L。
[0060] CBirl抗原蛋白制備方法2 :
[0061] 篩選CBirl重要抗原表位多肽2-6個(gè)，用多肽合成儀進(jìn)行從從C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成，然后與載體蛋白偶聯(lián)，使分子量增大，便于結(jié)合在結(jié)合墊和分析膜上。 常用的載體蛋白包括但不限于牛血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白（0A)、鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH)、 人血清白蛋白（HSA)及人工合成的多聚賴氨酸（PLL)等。
[0062] 實(shí)施例2抗體制備
[0063] 結(jié)合墊及檢測(cè)帶包被抗體抗人IgG單克隆抗體和多克隆抗體，以及用于質(zhì)控帶和 結(jié)合墊其他動(dòng)物來源的單克隆抗體和多克隆抗體，可通過免疫動(dòng)物獲得。
[0064] 1、單克隆抗體制備的具體操作方法為：
[0065] 通過將〇· 05mg?5mg免疫制劑（分別針對(duì)山羊、小鼠、兔子、馬和豚鼠）與1倍體 積的弗氏完全佐劑混合得到注射溶液，將該注射溶液在動(dòng)物皮內(nèi)多部位注射；
[0066] 一個(gè)月后將弗氏完全佐劑混合液經(jīng)多部位動(dòng)物皮下注射而加強(qiáng)免疫。7?14天后 將動(dòng)物放血，測(cè)定抗血清滴度。
[0067] 對(duì)動(dòng)物加強(qiáng)免疫直至滴度達(dá)到平臺(tái)期。通過從被免疫的動(dòng)物回收脾細(xì)胞與小鼠骨 髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，篩選后即可得到能穩(wěn)定表達(dá)目的抗體的雜交瘤細(xì)胞。
[0068] 體外培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞，接種小鼠或大鼠腹腔，取腹水純化獲得單克隆抗體；或者 從培養(yǎng)上清液中純化獲得單克隆抗體。
[0069] 2、多克隆抗體制備：
[0070] 同單克隆抗體步驟1)和2)，在獲得抗血清后，純化抗血清獲得多克隆抗體。
[0071] 3、葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白制備
[0072] 根據(jù)葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白的基因序列，可通過大腸桿菌原核表達(dá)克隆 化基因來制備，具體操作方法可參見（分子克隆實(shí)驗(yàn)指南），或?qū)嵤├齦CBirl的步驟。
[0073] 實(shí)施例3金標(biāo)試紙各組分制備
[0074] 1、膠體金液制備
[0075] 將0· 01 % (w/v)的HAuC14溶液加熱至沸騰，迅速加入每100mL HAuC14溶液加入 適量的還原劑溶液，顏色從藍(lán)色，然后淺藍(lán)、藍(lán)色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7?lOmin出現(xiàn)透 明的橙紅色。再用超濾或微孔濾膜（0.45 μ M)過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入 的雜質(zhì)。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，液面出現(xiàn)油狀物和大量黑色 顆粒狀沉淀物雜質(zhì)時(shí)棄用。
[0076] 其中所使用的還原劑可以為朽1檬酸三鈉、縣酸-朽1檬酸三鈉、白磷，優(yōu)選使用朽 1檬 酸三鈉，更優(yōu)選地使用1% (w/v)檸檬酸三鈉。
[0077] 其中所用玻璃容器應(yīng)絕對(duì)清潔，用前需經(jīng)酸洗。其水應(yīng)為去離子超純水，電阻率達(dá) 18. 2ΜΩ。
[0078] 膠體金溶液制備過程中，各溶液的配制方法如下：HAuC14的配制：用超純水溶解氯 金酸，配成1%溶液，置4°C備用，有效期三個(gè)月；lOOOmL 1%祖11(：14溶液配方：10g HAuC14、 超純水定容至lOOOmLd%朽1檬酸三鈉 （Sodium Citrate)的配制：用超純水溶解Sodium Citrate,配成1 %溶液，0· 22 μ Μ膜濾過，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0079] 2、金標(biāo)蛋白制備
[0080] 本發(fā)明待標(biāo)記金標(biāo)蛋白包括但不限于鼠抗人IgG、CBirl抗原蛋白、鼠 IgG、羊IgA、 SPA、羊抗人IgG、馬抗人IgG、兔IgM、鼠 IgA。
[0081] 用0.1M碳酸鈉調(diào)節(jié)膠體金pH 7.0?8. 5,按每毫升膠體金溶液緩慢加入5? 25 μ G待標(biāo)記蛋白，混勻，靜置10?30min，然后加入BSA至終濃度0. 5?1 %，混勻，靜置 5?lOmin, 3000rpm離心5min，去沉淀，將上層溶液轉(zhuǎn)至新管，9000rpm離心30min，去上清， 加入重懸液至原量，將溶液移至新管，9000rpm再次離心30min，加入用十分之一初始體積 的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。
[0082] 3、分析膜制備
[0083] 分析膜選擇：分析膜的材質(zhì)可選硝酸纖維素膜（NC)或者醋酸纖維素膜，商品化的 硝酸纖維素膜包括 S&SAE99、whatman 8ym、millipore M135、sartorius CN140 等。使用哪 種規(guī)格的具體NC膜或醋酸纖維素膜不是本發(fā)明的關(guān)鍵，但是在每次測(cè)定中，上述幾種NC膜 可以作為優(yōu)選。不同廠家使用的含不同表面活性劑的不同緩沖液處理的膜，與所用檢測(cè)線 抗體溶液親和力有不同程度的差距，也會(huì)很大程度造成線條不均勻，拖帶或是彌散的現(xiàn)象， 因此運(yùn)用組裝試紙來選擇優(yōu)選的NC膜或醋酸纖維素膜。
[0084] 分析膜制備：用包被緩沖液稀釋檢測(cè)帶包被蛋白至0. 5?1. 5mG/mL濃度，用劃膜 噴金儀HM3035,距離結(jié)合墊lcm處，以0. 5?1. 5μ L/cm噴涂于膜上，構(gòu)成檢測(cè)帶（4)，距離 檢測(cè)帶約5mm處，以0. 5?1. 5 μ L/cm用劃膜噴金儀儀器噴涂于同一張膜上，構(gòu)成質(zhì)控帶 (5)，質(zhì)控帶同時(shí)距離吸水墊約lcm。分析膜37°C烘干，封裝備用。
[0085] 所使用的包被緩沖液可以是硼酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽、Tris-HCl或Tris-磷酸鹽 等，緩沖液的作用是提供一定pH和離子強(qiáng)度使蛋白牢固包被于NC膜，緩沖液pH值一般約 為6?9. 5范圍內(nèi)，優(yōu)選為6. 5?7. 5的中性緩沖范圍內(nèi)，且最優(yōu)選緩沖液的pH值為7. 0? 7. 4范圍內(nèi)。
[0086] A.分析膜1
[0087] 檢測(cè)帶T線：用pH為7. 1的10mM PB緩沖溶液配制豚鼠抗人IgG，濃度為0. 3mg/ mL，噴涂在硝酸纖維膜上，涂布量為1 μ L/cm。
[0088] 質(zhì)控帶C線：用pH為7· 2的10mM PB緩沖溶液配制Protein G和鼠抗羊IgA，濃 度分別為〇. 6mG/mL和0. 8mG/mL，1 : 1混合，噴涂在硝酸纖維膜上，涂布量為1 μ L/cm。
[0089] B.分析膜2
[0090] 檢測(cè)帶T線：用pH為7· 1的10mM PB緩沖溶液配制CBirl抗原蛋白，濃度為0.6mG/ mL，嗔涂在醋酸纖維|旲上，涂布量為1.0 μ L/cm。
[0091] 質(zhì)控帶C線：用pH為7. 3的10mM PB緩沖溶液配制兔抗羊IgG，濃度為0. 3mG/mL， 嗔涂在醋fe纖維I旲上，涂布量為1. 0 u L/cm。
[0092] C.分析膜3
[0093] 檢測(cè)帶T線：將兔抗人IgG與pH為7. 2的10mM PB緩沖溶液混合配制成為濃度為 0. 4mG/mL的混合溶液，噴在硝酸纖維膜上，涂布量為1 μ L/cm。
[0094] 質(zhì)控帶C線：將羊抗鼠 IgG與pH為7. 5的10mM PB緩沖溶液混合配制成為濃度為 0. 2mG/mL混合溶液，噴在硝酸纖維膜上，涂布量為1 μ L/cm。
[0095] D.分析膜4
[0096] 檢測(cè)帶T線：將羊抗人IgG與pH為7. 3的10mM碳酸鹽緩沖溶液混合配制成為濃 度為0. 2mG/mL的混合溶液，噴在醋酸纖維膜上，涂布量為1 μ L/cm。
[0097] 質(zhì)控帶C線：用pH為7. 5的10mM碳酸鹽緩沖溶液配制鼠抗CBirl單克隆抗體，濃 度為0. 3mG/mL，噴涂在醋酸纖維膜上，涂布量為1 μ L/cm。
[0098] 4、結(jié)合墊的制備
[0099] 結(jié)合墊的處理：結(jié)合墊材質(zhì)為玻璃纖維紙或聚酯膜，用配制好的結(jié)合墊處理液浸 泡結(jié)合墊，在37°C下lh烘干后，將抗體或者蛋白以4uL/cm的用量噴涂在預(yù)處理的聚脂膜 上，37°C干燥lh后得結(jié)合墊，結(jié)合墊置于2?8°C的環(huán)境下備用；結(jié)合墊處理液的組成為： pH 為 7.0 ?9.0 的 10mM PB 緩沖溶液，含 1 % BSA，10 ?20%蔗糖，0.1 % Tween-20。結(jié)合 墊也可不做預(yù)處理，直接使用。
[0100] A.結(jié)合墊1玻璃纖維膜，單層，CBirl和羊IgA等比例混合。
[0101] B.結(jié)合墊2玻璃纖維膜，單層，羊抗人IgG。
[0102] C.結(jié)合墊3玻璃纖維膜，雙層，2a層為CBirl抗原蛋白，2b層為鼠 IgG。
[0103] D.結(jié)合墊4聚酯膜，單層，CBirl抗原蛋白。
[0104] 5、樣品墊的制備
[0105] 樣品墊材質(zhì)為玻璃纖維紙或聚酯膜，用配制好的樣品墊處理液浸泡樣品墊，在 37°C下lh烘干，樣品墊緩沖液的組成為：pH為7. 0?9. 0的lOMm PB緩沖溶液，含1 % BSA， 10%鹿糖，〇. 1% Tween-20。樣品墊也可不做預(yù)處理直接使用。
[0106] 實(shí)施例4膠體金標(biāo)記抗CBirl抗體檢測(cè)試紙1?4制備
[0107] 用裁切機(jī)將實(shí)施例3制備的并干燥的樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水紙分別剪切 1. 7cm、0. 8cm、2. 5cm和1. 5cm寬的窄條，按圖1或圖2方式搭接成大板，用切條機(jī)將大板切 成單人份，每人份寬度根據(jù)底板卡殼的不同而異，本發(fā)明優(yōu)選3mm和4mm寬度。將單人份 已切好的試紙組裝在備好的試紙卡里，使加樣窗對(duì)應(yīng)試紙的樣品墊，結(jié)果顯示窗對(duì)應(yīng)檢測(cè) 區(qū)和質(zhì)控區(qū)，組裝時(shí)溫度控制在25?37°C，濕度20?30%。
[0108] 金標(biāo)試紙條1?4的各組分如下表：
[0109]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗CBirl抗體免疫層析試紙條，包括樣品墊（1)、結(jié)合墊（2)、分析膜（3)、吸水 墊（6)、底板（7)、檢測(cè)帶T線（4)和質(zhì)控帶C線（5)，所述底板（7)的上部貼合有分析膜 (3)，所述分析膜（3)上部的兩端分別貼合有結(jié)合墊（2)和吸水墊（6)，所述結(jié)合墊（2)上部 的一端貼合有樣品墊（1)，所述檢測(cè)帶T線（4)和質(zhì)控帶C線（5)設(shè)置在分析膜（3)上，其 特征在于，CBirl抗原蛋白結(jié)合在結(jié)合墊（2)上或包被在檢測(cè)帶T線（4)上。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于：所述的結(jié)合墊（2)包被膠體 金標(biāo)記物或膠乳（乳膠）標(biāo)記物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CBirl抗體檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述的結(jié)合墊為1層 (圖1)或2層與分析膜錯(cuò)落搭接（圖2)。
4. 一種抗CBirl抗體免疫層析試紙條的制備方法，包括如下步驟： 步驟1. CBirl抗原蛋白的制備 步驟2.結(jié)合墊⑵制備 (1) 膠體金標(biāo)記物的制備：用納米金溶液標(biāo)記CBirl抗原蛋白、抗人IgG抗體、葡萄球 菌A蛋白（SPA)、鏈球菌G蛋白（Protein G)，以及其他與檢測(cè)帶T線或質(zhì)控帶C線能形成 免疫復(fù)合物的蛋白。 (2) 膠乳標(biāo)記物的制備：用帶活性基團(tuán)的膠乳標(biāo)記CBirl抗原蛋白、抗人IgG抗體、葡 萄球菌A蛋白（SPA)、鏈球菌G蛋白（Protein G)，以及其他與檢測(cè)帶T線或質(zhì)控帶C線能 形成免疫復(fù)合物的蛋白。 (3) 結(jié)合墊（2)制備：玻璃纖維膜或聚脂膜作為結(jié)合墊，將步驟（1)制備的膠體金標(biāo)記 物或膠乳標(biāo)記物，噴涂在預(yù)處理的玻璃纖維膜或聚脂膜上，干燥備用。 步驟3.分析膜（3)制備 A. 檢測(cè)帶T線（4)制備：根據(jù)結(jié)合墊標(biāo)記蛋白類型選擇檢測(cè)帶T線包被蛋白，如結(jié)合 墊上的結(jié)合蛋白含CBirl，檢測(cè)帶T線的包被蛋白是抗人IgG抗體。如果結(jié)合墊上含有抗人 IgG抗體，檢測(cè)帶T線包被蛋白為CBirl抗原蛋白。 B. 質(zhì)控帶C線（5)制備：根據(jù)結(jié)合墊的標(biāo)記蛋白類型選擇質(zhì)控帶的包被蛋白，如結(jié)合 墊標(biāo)記蛋白是單一的CBirl,質(zhì)控帶C線的包被蛋白為抗CBirl的抗體；如果結(jié)合墊標(biāo)記蛋 白是單一的抗人IgG抗體，質(zhì)控帶C線的標(biāo)記蛋白為對(duì)應(yīng)的抗人IgG抗體的抗體；結(jié)合墊標(biāo) 記蛋白有2層時(shí)，質(zhì)控帶C線的包被蛋白是能與結(jié)合墊對(duì)應(yīng)層結(jié)合蛋白形成免疫復(fù)合物的 蛋白。 步驟4.樣品墊制備 將玻璃纖維膜或聚酯膜經(jīng)緩沖液浸漬烘干備用，或者直接使用。 步驟5.試紙條組裝 把步驟1?4所制作完成的材料，按圖1或圖2搭接，根據(jù)底板的規(guī)格切割成一定的長(zhǎng) 度和寬度，安裝在底板和卡殼里。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于：所述的CBirl抗原蛋白是把 全長(zhǎng)CBirl基因或者含有重要抗原表位的基因序列，克隆到原核或真核表達(dá)載體里，表達(dá) 純化獲得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于：所述的CBirl抗原蛋白是用 多肽合成儀合成含有CBirl重要抗原表位的CBirl多肽，并偶聯(lián)到載體蛋白上而獲得。牛 血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白（0A)、鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH)、人血清白蛋白（HSA)及人工合成的 多聚賴氨酸（PLL)等。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述的抗人IgG抗體為鼠源、 兔源、羊源、馬源、駱駝源或豚鼠源中的一種或多種單克隆抗體或多克隆抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述的抗CBirl的抗體是以 CBirl為免疫源產(chǎn)生的抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述的抗人IgG抗體的抗體是 指能與該抗體形成免疫復(fù)合物的抗體。
10. -種抗CBirl抗體的檢測(cè)方法，其特征在于，用權(quán)利要求1?9所述的免疫層析試 紙條，對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟包括： (1) 樣本處理：取血清、血漿或全血樣本； (2) 把樣品滴加到試紙條的樣品墊上，靜置5?30分鐘，觀察T線和C線； (3) 結(jié)果判讀：T線和C線均顯現(xiàn)，結(jié)果為陽性；T線不顯現(xiàn)，C線顯現(xiàn)，結(jié)果為陰性；其 他情況提示試紙失效。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104297488SQ201410411684
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月20日
【發(fā)明者】陳菲, 霍如松, 周陽, 錢洋 申請(qǐng)人:蘇州和銳醫(yī)藥科技有限公司