蜂王漿中三種脂肪酸含量的檢測方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種蜂王漿中三種脂肪酸含量的檢測方法，所述三種脂肪酸分別為3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸，通過氣相色譜方法測定蜂王漿中3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸的含量。本發(fā)明提供的色譜條件可以使色譜峰得到較好的分離，操作簡便，準(zhǔn)確快捷，靈敏性高，重現(xiàn)性好。并且通過這些有效成分的含量了解蜂王漿的質(zhì)量品質(zhì)，為蜂王漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了新的指標(biāo)。
【專利說明】蜂王漿中三種脂肪酸含量的檢測方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品質(zhì)量控制方法，涉及蜂王漿有效成分的檢測方法，特別涉及蜂王 漿中3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸三種脂肪酸含量的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 蜂王楽（royal jelly)是5?15日齡的哺育工蜂的咽下腺（subpharyngeal gland)和上顎腺（mandibular gland)分泌的、用以飼喂蜂王和3日齡以內(nèi)工蜂、雄蜂幼蟲 的漿狀物質(zhì)。顏色呈乳白色或淡黃色。其氣味與口感主要是酸味和辛辣味。蜂王漿的化學(xué) 組成極為復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、多肽、碳水化合物、脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、酸等，其中，脂質(zhì)占 蜂王漿干重的89Γ19%，是蜂王漿中最重要的成份之一，其中游離脂肪酸占脂質(zhì)的809Γ90% 以上，是蜂王漿抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等諸多生物學(xué)功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0003] 目前，針對蜂王漿中脂肪酸成分的檢測方法主要集中于10-羥基-2-癸烯酸 (10-HDA)，缺乏對其他脂肪酸成分的可靠的定量檢測方法。3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸 二酸均是蜂王漿中重要的功能性脂肪酸，但對這些脂肪酸的檢測方法研究大多只是定性檢 測，缺乏簡便、有效、準(zhǔn)確的定量檢測方法。因此，建立蜂王漿中這三種脂肪酸的定量測定方 法對蜂王漿的質(zhì)量控制體系的進(jìn)一步完善有著重大的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種蜂王漿中三種脂肪酸含量的檢測方法，所述三種脂肪 酸分別為3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸， 本發(fā)明提供的蜂王漿中3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸含量的檢測方法，通過以 下步驟實現(xiàn)： (1) 以對羥基苯甲酸甲酯、3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸為對照品，制成一定含 量的對羥基苯甲酸甲酯、3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸的溶液，甲硅烷化衍生，通過 氣相色譜測定其圖譜，以對羥基苯甲酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物，由對羥基苯甲酸甲酯與3-羥基癸 酸、10-羥基癸酸和癸二酸的特征吸收峰面積的比值和對照品的進(jìn)樣量的比值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線. (2) 將待測蜂王漿加溶劑超聲處理，過濾得濾液，甲硅烷化衍生，制得供試品； (3) 在與步驟（1)相同的色譜條件下測定步驟（2)制得的供試品的氣相色譜圖譜，并分 別計算對羥基苯甲酸甲酯、3_羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸的特征吸收峰峰面積，根據(jù) 步驟（1)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線、添加標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量和稱取蜂王漿的質(zhì)量得到待測蜂王漿中3-羥基 癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸的含量。
[0005] 上述步驟（1)用809Γ100%乙醇溶解對羥基苯甲酸甲酯、3-羥基癸酸、10-羥基癸 酸和癸二酸對照品，制成對輕基苯甲酸甲酯濃度為0. 1 mg/ml~0. 15 mg/ml，3-輕基癸酸濃 度為 0· 004 mg/ml?0· 05 mg/ml、l〇-輕基癸酸濃度為 0· 013 mg/ml?0· 14 mg/ml 和癸二酸 濃度為〇. 0015 mg/ml~0. 025 mg/ml的對照品溶液，吸取1 ml左右對照品溶液，使用濾膜過 濾，揮干溶劑，再用1~3 ml純乙醚溶解，吸取1 ml左右乙醚溶液，使用濾膜過濾，之后揮干 溶劑，加入 300 μ--500 μ? 純吡啶和 80 μ--120 ylBSTFA+TMS(99:l)，50。C?70。C 水浴30分鐘~60分鐘，然后使用氣相色譜檢測。
[0006] 上述步驟（2)使用809Γ100%乙醇制成對羥基苯甲酸甲酯濃度為0. 5 mg/mf〇. 75 mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，稱取約0.5 g蜂王漿，置于容量瓶中，加入100 yflOOO μ? O.Olmol/ 1~0.03 mol/1鹽酸，振蕩溶解蜂王漿，精密吸取3ml~7ml的內(nèi)標(biāo)溶液加入容量瓶，用 809Γ100%乙醇稀釋至刻度，超聲15分鐘~30分鐘，制成待測溶液，吸取1 ml左右待測溶 液，使用濾膜過濾，揮干溶劑，再用1 m廣3 ml純乙醚溶解，吸取1 ml乙醚溶液，使用濾膜過 濾，之后揮干溶劑，加入300 μ 1?500 μ 1純吡啶和80 μ 1?120 μ 1 BSTFA+TMS (99:1)， 50° (T70° C水浴30分鐘~60分鐘，然后使用氣相色譜檢測。
[0007] 上述步驟（1)和步驟（3)中采用氣相色譜法的是毛細(xì)管柱氣相色譜法。
[0008] 上述步驟（1)和步驟（3)中采用氣相色譜的色譜條件是：使用分流進(jìn)樣；采用 (5%_苯基）_甲基聚硅氧烷為涂層的毛細(xì)管色譜柱，載氣為氮氣；檢測器為FID檢測器。氣 相色譜的進(jìn)樣口溫度為250° C，分流比為1:10?1:30,進(jìn)樣量1 μ 1;柱箱程序升溫起始 溫度50° C，保持5分鐘，然后以5° C/分鐘速度上升至300° C;檢測器溫度為330° C;所 采用（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷為涂層的毛細(xì)管色譜柱為Rtx-5柱，柱長30 m，內(nèi)徑0. 25 _，涂層厚 〇. 25 μπι。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述方法在蜂王漿中對3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和 癸二酸的含量進(jìn)行測定中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明采用氣相色譜法對蜂王漿中3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸的含量進(jìn) 行測定，所提供的色譜條件可以使色譜峰得到較好的分離，操作簡便，準(zhǔn)確快捷，靈敏性高， 重現(xiàn)性好。并且通過這些有效成分的含量了解蜂王漿的質(zhì)量品質(zhì)，為蜂王漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供 了新的指標(biāo)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1是實驗例1得到的3-羥基癸酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0012] 圖2是實驗例1得到的10-羥基癸酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0013] 圖3是實驗例1得到的癸二酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0014] 具體實施方法 本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進(jìn)一步的說明。
[0015] 實施例1 蜂王漿中3種脂肪酸成分含量測定的方法學(xué)研究 1.儀器與實驗用藥 儀器：氣相色譜儀（GC 2010,日本島津制作所)，自動進(jìn)樣器（A0C-20s)，F(xiàn)ID檢測器，GC solution工作站，天平(精度0· lmg，BS 124S，德國賽多利斯集團(tuán)）。
[0016] 試劑：標(biāo)準(zhǔn)品：10-羥基癸酸（10-HDAA)、3-羥基癸酸（3-HDAA)、癸二酸，均購自 Sigma公司； BSTFA+TMS (99:1) (Sigma 公司）； 批陡（Sigma公司）； 氫氣、氮氣、空氣(杭州今工特種氣體有限公司）； 甲醇(色譜純，Merck公司）； 乙醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 無水乙醚(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 鹽酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 對羥基苯甲酸甲酯(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 蜂王漿采集自浙江省平湖種蜂場，實驗用水為超純水。
[0017] 2.色譜條件選擇 色譜柱：Rtx-5,（30 m，0. 25 mmID，0. 25 μπι);進(jìn)樣口溫度：250 °C，進(jìn)樣量：1 uL，分流 比：1: 20 ;;柱箱溫度梯度：50° C保持5 min，5 ° C/min上升至300 ° C，300 ° C保持5 min， 載氣流速：1. 0 mL/min ;檢測器溫度：330 °C。在此條件下對羥基苯甲酸甲酯、3-羥基癸酸、 10-羥基癸酸和癸二酸與樣品中其他組分分離良好。
[0018] 3.空白試驗 取吡啶和BSTFA+TMS混合，水浴30分鐘，作為空白試劑，使用氣相色譜檢測，在對羥基 苯甲酸甲酯對照品、3-羥基癸酸對照品、10-羥基癸酸對照品和癸二酸對照品相同保留時 間無吸收峰。
[0019] 稱取0.5g蜂王漿，置于25ml容量瓶中，加入200 μ 1 0.01 mol/1鹽酸，振蕩溶解 蜂王漿，使用無水乙醇稀釋至刻度，超聲15分鐘，制成待測溶液，吸取1 ml待測溶液，使用 濾膜過濾，揮干溶劑，再用1.5 ml左右乙醚溶解，取1 ml乙醚溶液，使用濾膜過濾，揮干溶 齊[J，加入400 μ 1吡啶和100 μ 1 BSTFA+TMS(99:1)，60° C水浴30分鐘，然后使用氣相色 譜檢測，在對羥基苯甲酸甲酯對照品相同保留時間處無吸收峰。
[0020] 表示目標(biāo)物質(zhì)的吸收峰不會受到雜質(zhì)干擾。
[0021] 4.線性關(guān)系考察 稱取0.1625 g對輕基苯甲酸甲酯，加入無水乙醇并轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，用無水乙 醇稀釋至刻度，制成內(nèi)標(biāo)溶液。精密稱取〇. 0134 g 10-HDAA、0. 0049 g 3-HDAA和0. 0020 g癸二酸，加入無水乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為混 標(biāo)母液。精密吸取〇. 5，1，2,3,4,5 mL混標(biāo)母液至10 mL容量瓶中，加入2 mL內(nèi)標(biāo)溶液后 定容至刻度。按上述色譜條件測定對羥基苯甲酸甲酯、3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸 的吸收峰面積，以被測物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為橫坐標(biāo)，以濃度比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。結(jié)果見表1-表3。 ?1 3-?基煢酸_±?a測定結(jié)采
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種蜂王漿中三種脂肪酸含量的檢測方法，所述脂肪酸為3-羥基癸酸、10-羥基癸 酸和癸二酸，其特征在于，通過以下步驟實現(xiàn)： (1) 以對羥基苯甲酸甲酯、3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸為對照品，制成一定含 量的對羥基苯甲酸甲酯、3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸的溶液，甲硅烷化衍生，通過 氣相色譜測定其圖譜，以對羥基苯甲酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物，由對羥基苯甲酸甲酯與3-羥基癸 酸、10-羥基癸酸和癸二酸的特征吸收峰面積的比值和對照品的進(jìn)樣量的比值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線. (2) 將待測蜂王漿加溶劑超聲處理，過濾得濾液，甲硅烷化衍生，制得供試品； (3) 在與步驟（1)相同的色譜條件下測定步驟（2)制得的供試品的氣相色譜圖譜，并分 別計算對羥基苯甲酸甲酯、3_羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸的特征吸收峰峰面積，根據(jù) 步驟（1)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線、添加標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量和稱取蜂王漿的質(zhì)量得到待測蜂王漿中3-羥基 癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜂王漿中三種脂肪酸含量的檢測方法，其特征在于，步 驟（1)用809Γ100%乙醇溶解對羥基苯甲酸甲酯、3-羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸對照 品，制成對輕基苯甲酸甲酯濃度為〇. 1 mg/ml~0. 15 mg/ml，3-p5基癸酸濃度為0.004 mg/ ml?0· 05 mg/ml、l〇-輕基癸酸濃度為0· 013 mg/ml?0· 14 mg/ml和癸二酸濃度為0· 0015 mg/mfO. 025 mg/ml的對照品溶液，吸取對照品溶液,使用濾膜過濾，揮干溶劑，再用純乙醚 溶解，吸取乙醚溶液，使用濾膜過濾，之后揮干溶劑，按照99:1的比例加入300 μ廣500 μ 1 純吡啶和80 μ 1?120 μ 1 BSTFA+TMS，50° C?70° C水浴30分鐘?60分鐘，然后使用氣相 色譜檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜂王漿中三種脂肪酸含量的檢測方法，其特征在于，步 驟（2)使用80%?100%乙醇制成對輕基苯甲酸甲酯濃度為0. 5 mg/ml?0. 75 mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶 液，稱取0.5 g蜂王漿，置于容量瓶中，加入100 μ--1000 μ? O.Olmol/Ι?0.03 mol/1鹽 酸，振蕩溶解蜂王漿，吸取3ml~7ml的內(nèi)標(biāo)溶液加入容量瓶，用809Γ100%乙醇稀釋至刻度， 超聲15分鐘~30分鐘，制成待測溶液，吸取待測溶液，使用濾膜過濾，揮干溶劑，再用純乙 醚溶解，吸取乙醚溶液，使用濾膜過濾，之后揮干溶劑，按照99:1的比例加入300 μ f 500 μ 1純吡啶和80 μ 1?120 μ 1 BSTFA+TMS，50° C?70° C水浴30分鐘?60分鐘，然后使用 氣相色譜檢測。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜂王漿中三種脂肪酸含量的檢測方法，其特征在于，步 驟（1)和步驟（3)中采用氣相色譜法的是毛細(xì)管柱氣相色譜法。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種蜂王漿中三種脂肪酸含量的檢測方法，其特征在于，步 驟（1)和步驟（3)中采用氣相色譜的色譜條件是：使用分流進(jìn)樣；采用（5%-苯基）-甲基聚 硅氧烷為涂層的毛細(xì)管色譜柱，載氣為氮氣；檢測器為FID檢測器；氣相色譜的進(jìn)樣口溫度 為250° C，分流比為1 :10?1 :30,進(jìn)樣量1 μ 1 ;柱箱程序升溫起始溫度50° C，保持5分 鐘，然后以5° C/分鐘速度上升至300° C;檢測器溫度為330° C;所采用（5%-苯基）-甲 基聚硅氧烷為涂層的毛細(xì)管色譜柱為Rtx-5柱，柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，涂層厚0.25 μ m。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜂王漿中三種脂肪酸含量的檢測方法在檢測蜂王漿中 3_羥基癸酸、10-羥基癸酸和癸二酸三種脂肪酸中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N30/88GK104155401SQ201410417420
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月24日
【發(fā)明者】胡福良, 吳雨祺, 魏文挺, 鄭火青 申請人:浙江大學(xué)