一種免疫磁珠及其在檢測(cè)玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種免疫磁珠及其在檢測(cè)玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用，本發(fā)明免疫磁珠上偶聯(lián)有玉米赤霉烯酮單克隆抗體。本發(fā)明免疫磁珠在檢測(cè)玉米赤霉烯酮中具體的應(yīng)用方法為：將免疫磁珠與待測(cè)樣品溶液、PBS緩沖液混勻，室溫振蕩反應(yīng)，使抗體與抗原充分結(jié)合；再加入酶標(biāo)單抗，室溫振蕩反應(yīng)，使酶標(biāo)單抗與抗原充分結(jié)合；沉淀免疫磁珠，去除液體，將免疫磁珠洗滌干凈加入AMPPD溶液混勻，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度判斷樣品中玉米赤霉烯酮的含量。本發(fā)明免疫磁珠檢測(cè)玉米赤霉烯酮靈敏高、特異高、線性寬、檢測(cè)時(shí)間短。
【專利說(shuō)明】一種免疫磁珠及其在檢測(cè)玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫磁珠及其在檢測(cè)玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN),又稱F2毒素，是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)等鐮刀菌產(chǎn)生的一種雌激素類真菌毒素。其化學(xué)式為6 (10-羥基-6氧基-十一碳烯基)β -雷羧酸內(nèi)酯，分子量為318，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如I所示。它廣泛存在于霉變的玉米、高粱、小麥、燕麥、大麥等谷物作物以及奶制品中。玉米赤霉烯酮可引起動(dòng)物和人的雌激素過(guò)多綜合癥，還具有生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、基因毒性和可疑致癌性等。飼料和食品生產(chǎn)中所用的谷物是ZEN產(chǎn)生的最好基質(zhì)，其次為豆類及其制品，因此，ZEN給畜牧業(yè)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]目前關(guān)于玉米赤霉烯酮的檢測(cè)存在以下缺點(diǎn):1、價(jià)格昂貴，專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行檢測(cè)；2、檢測(cè)方法的線性窄、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)；3、成本高、靈敏度低、操作繁瑣；因此研究一種高靈敏、高特異、線性寬、檢測(cè)時(shí)間短的玉米赤烯酮檢測(cè)方法已迫在眉睫。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種免疫磁珠。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供該免疫磁珠在檢測(cè)玉米赤霉烯酮中的具體應(yīng)用方法。
[0006]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種免疫磁珠，該免疫磁珠上偶聯(lián)有玉米赤霉烯酮單克隆抗體。
[0007]上述免疫磁珠在檢測(cè)玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用，其具體的應(yīng)用方法包括以下步驟:
1)將免疫磁珠與待測(cè)樣品溶液、PBS緩沖液混勻，室溫振蕩反應(yīng)，使免疫磁珠上的抗體與玉米赤霉烯酮抗原充分結(jié)合；
2)將上述反應(yīng)液中加入堿性磷酸酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮單克隆抗體，室溫振蕩反應(yīng)，使酶標(biāo)單抗與抗原充分結(jié)合；
3)將2)中的反應(yīng)體系置于磁性分離器上，使免疫磁珠沉淀，去除液體，將免疫磁珠洗滌干凈，除凈殘液，加入ΑΜΡΗ)溶液混勻，室溫放置進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度判斷樣品中玉米赤霉烯酮的含量。
[0008]進(jìn)一步的，上述步驟I)中免疫磁珠與樣品溶液、PBS緩沖液體積比為30:30:200。
[0009]進(jìn)一步的,上述步驟I)中所述振蕩反應(yīng)的時(shí)間為30min。
[0010]進(jìn)一步的，上述步驟2)中所述堿性磷酸酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮單克隆抗體與免疫磁珠的體積比為1:1。
[0011]進(jìn)一步的，上述步驟2)中所述室溫振蕩反應(yīng)時(shí)間為20min。
[0012]進(jìn)一步的,上述步驟3)中所述發(fā)光反應(yīng)時(shí)間為30min。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
I)本發(fā)明直接利用AMPro新型發(fā)光試劑，對(duì)玉米赤霉烯酮進(jìn)行檢測(cè)，建立了一種新的化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析方法。
[0014]2)利用本發(fā)明免疫磁珠檢測(cè)玉米赤霉烯酮，靈敏高、特異高、線性寬、檢測(cè)時(shí)間短。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為不同免疫磁珠用量的檢測(cè)效果；
圖2為不同的免疫磁珠與抗原反應(yīng)時(shí)間的檢測(cè)效果；
圖3為不同ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體用量的檢測(cè)效果；
圖4為不同的ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體與抗原反應(yīng)時(shí)間的檢測(cè)效果；
圖5為不同發(fā)光反應(yīng)時(shí)間的檢測(cè)效果；
圖6為本發(fā)明免疫磁珠檢測(cè)玉米赤霉烯酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0017]實(shí)施例1免疫磁珠的制備方法
I)磁珠的醛基化:將10.0mg帶有氨基修飾的磁珠用戊二醛活化，使磁珠醛基化。
[0018]2)單抗活化磁珠:取上述醒基化的磁珠與0.50 mg玉米赤霉烯酮單克隆抗體,50mLVBS緩沖液混合，室溫振蕩2?4h，再將磁珠用PBS洗滌干凈，重懸于1%牛血清白蛋白溶液(W/V)進(jìn)行封閉，4°C保存，即可。
[0019]上述抗體與磁珠反應(yīng)后,溶液中還剩0.1lmg玉米赤霉烯酮單克隆抗體，由此可知磁珠結(jié)合玉米赤霉烯酮單克隆抗體的能力為0.39 mg/mg。
[0020]實(shí)施例2本發(fā)明免疫磁珠在檢測(cè)玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用
1)在取30μ L實(shí)施例1中制備的免疫磁珠和30 μ L待測(cè)樣品、200 μ L PBS緩沖液混勻，室溫振湯30min ；
2)將上述反應(yīng)液中加入15μ L ALP (堿性磷酸酶)標(biāo)記的玉米赤霉烯酮單克隆抗體，室溫震動(dòng)20min ；
3)將反應(yīng)后的免疫磁珠置于磁性分離器上沉淀2min，將去除液體，用洗滌液將免疫磁珠洗滌干凈，將殘液拍干，加10 μ L AMPPD溶液混勻室溫放置30min進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度判斷樣品是否含有玉米赤霉烯酮。
[0021]實(shí)施例3免疫磁珠的最佳用量
參照實(shí)施例2所述的方法對(duì)玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)樣品液(玉米赤霉烯酮濃度為lmg/L)進(jìn)行檢測(cè)，免疫磁珠的用量分別設(shè)為0、5、10、15、30、40、60μ L，其他參數(shù)條件均與實(shí)施例2 —致。檢測(cè)結(jié)果顯示(如圖1所示)，當(dāng)免疫磁珠的用量為15?40 μ L，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度較高，尤其是當(dāng)免疫磁珠的用量為30 μ L時(shí)，檢測(cè)效果最佳，故免疫磁珠的最佳用量為30 μ L。
[0022]實(shí)施例4免疫磁珠與抗原的最佳反應(yīng)時(shí)間
參照實(shí)施例2所述的方法對(duì)玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)樣品液(玉米赤霉烯酮濃度為lmg/L)進(jìn)行檢測(cè)，免疫磁珠與抗原的反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)為2、5、10、20、30、60min，其他參數(shù)條件均與實(shí)施例2 —致。檢測(cè)結(jié)果顯示(如圖2所示)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為20?60min時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度較高，尤其是當(dāng)免疫磁珠與抗原的反應(yīng)30min時(shí)，檢測(cè)效果最佳，故免疫磁珠與抗原的最佳反應(yīng)時(shí)間為30min。
[0023]實(shí)施例5 ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體的最佳用量
參照實(shí)施例2所述的方法對(duì)玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)樣品液(玉米赤霉烯酮濃度為lmg/L)進(jìn)行檢測(cè)，ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體的用量分別設(shè)為0、5、10、15、20、30、40yL，其他參數(shù)條件均與實(shí)施例2 —致。檢測(cè)結(jié)果顯示(如圖3所示)，當(dāng)ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體的用量為15?40 μ L，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度較高，尤其是用量為30?40 μ L時(shí)，檢測(cè)效果最佳，但15?30 μ L單抗的檢測(cè)效果與30?40 μ L的效果相差較小，故綜合檢測(cè)效果和成本問(wèn)題，選用15 μ L作為ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體的最佳用量。
[0024]實(shí)施例6 ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體與抗原的最佳反應(yīng)時(shí)間
參照實(shí)施例2所述的方法對(duì)玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)樣品液(玉米赤霉烯酮濃度為lmg/L)進(jìn)行檢測(cè)，ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體與抗原的反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)為2、5、10、20、30、60min，其他參數(shù)條件均與實(shí)施例2 —致。檢測(cè)結(jié)果顯示(如圖4所示)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為20?60min時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度較高，尤其是當(dāng)ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體與抗原的反應(yīng)20min和60min時(shí)，檢測(cè)效果最佳，但考慮到時(shí)間成本，故ALP-玉米赤霉烯酮單克隆抗體與抗原的最佳反應(yīng)時(shí)間為20min。
[0025]實(shí)施例7最佳發(fā)光反應(yīng)時(shí)間
參照實(shí)施例2所述的方法對(duì)玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)樣品液(玉米赤霉烯酮濃度為lmg/L)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)光反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)為0、l、3、5、10、20、30、40、50、60、65min，其他參數(shù)條件均與實(shí)施例2 —致。檢測(cè)結(jié)果顯示(如圖5所示)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30?65min時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度最佳，但考慮到時(shí)間成本，故選用30min作為最佳發(fā)光反應(yīng)時(shí)間。
[0026]實(shí)施例8本發(fā)明檢測(cè)方法的靈敏度
將玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為 0.lng/kg、0.5ng/kg、lng/kg、1.5ng/kg、2ng/kg、3ng/kg、4ng/kg、5ng/kg共8個(gè)不同濃度,參照實(shí)施例2的方法檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0027]標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0037X+4.3X 103，R2=0.982，線性范圍為0.20ng/kg?4ng/kg ;故本發(fā)明免疫磁珠檢測(cè)玉米赤霉烯酮的檢測(cè)限(靈敏度)達(dá)
0.20ng/kg。
【權(quán)利要求】
1.一種免疫磁珠，其特征在于:該免疫磁珠上偶聯(lián)有玉米赤霉烯酮單克隆抗體。
2.權(quán)利要求1所述免疫磁珠在檢測(cè)玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的應(yīng)用，其特征在于:具體的應(yīng)用方法包括以下步驟: 1)將權(quán)利要求1所述的免疫磁珠與待測(cè)樣品溶液、PBS緩沖液混勻，室溫振蕩反應(yīng)，使免疫磁珠上的抗體與玉米赤霉烯酮抗原充分結(jié)合； 2)將上述反應(yīng)液中加入堿性磷酸酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮單克隆抗體，室溫振蕩反應(yīng)，使酶標(biāo)單抗與抗原充分結(jié)合； 3)將2)中的反應(yīng)體系置于磁性分離器上，使免疫磁珠沉淀，去除液體，將免疫磁珠洗滌干凈，除凈殘液，加入AMPPD溶液混勻，室溫放置進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度判斷樣品中玉米赤霉烯酮的含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:步驟I)中免疫磁珠與樣品溶液、PBS緩沖液體積比為30:30:200o
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:步驟I)中所述振蕩反應(yīng)的時(shí)間為30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:步驟2)中所述堿性磷酸酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮單克隆抗體與免疫磁珠的體積比為1:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:步驟2)中所述室溫振蕩反應(yīng)時(shí)間為20mino
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:步驟3)中所述發(fā)光反應(yīng)時(shí)間為30min。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104198711SQ201410422038
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】羅勝軍 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所