一種測(cè)定殺菌劑對(duì)香蕉尾孢葉斑病菌毒力的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種測(cè)定殺菌劑對(duì)香蕉尾孢葉斑病菌毒力的方法，屬于植物病害防控領(lǐng)域。通過(guò)本發(fā)明的方法，香蕉尾孢菌在特定液體培養(yǎng)基中菌絲體生長(zhǎng)良好，采用菌絲體干重測(cè)定法可以達(dá)到有關(guān)室內(nèi)毒力測(cè)定的目的要求，相比大田活體病斑擴(kuò)展法，節(jié)省大量人力、物力成本，試驗(yàn)影響因素小，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可信。真空抽濾法過(guò)濾菌液，有效將菌絲球內(nèi)的水分過(guò)濾掉，保證菌絲干濕度有效統(tǒng)一。香蕉尾孢菌在液體培養(yǎng)基中形成菌絲球，若采用烘箱干燥法，菌絲球容易粘附在濾紙上，菌絲量不同烘干效果不一致，對(duì)稱重誤差影響較大。
【專利說(shuō)明】一種測(cè)定殺菌劑對(duì)香蕉尾孢葉斑病菌毒力的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病害防控領(lǐng)域中一種測(cè)定殺菌劑對(duì)病原菌毒力的方法，特別涉及 一種離體條件下測(cè)定殺菌劑對(duì)香蕉尾孢葉斑病原菌毒力的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 香蕉葉斑病（Sigatoka disease of banana)是香蕉葉部病害的總稱，是香蕉生產(chǎn) 中最為嚴(yán)重、具有毀滅性的病害之一。在華南香蕉產(chǎn)區(qū)，香蕉葉斑病普遍發(fā)生，危害嚴(yán)重，該 病主要危害功能葉片，引起葉片布滿病斑，光合作用面積明顯減少，發(fā)病嚴(yán)重的植株早衰干 枯，嚴(yán)重影響果實(shí)發(fā)育充實(shí)，病株減產(chǎn)可達(dá)30%?50%。香蕉葉斑病的常見(jiàn)種類有：尾孢菌 (Cercospora musae)葉斑病、小竇氏霉葉斑病、暗雙孢霉葉斑病、彎孢霉葉斑病等，以尾孢 菌葉斑病發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重、危害性最大。香蕉尾孢菌葉斑病主要危害香蕉葉片，從 植株下部葉片開(kāi)始發(fā)病，逐步向上部葉片擴(kuò)展，在葉片上產(chǎn)生大量病斑，使葉片在短期內(nèi)早 衰干枯，病斑初為米粒狀或線條狀、淡黃色或褐色，后發(fā)展成橢圓形或長(zhǎng)條形、黃褐色或黑 褐色，多個(gè)病斑匯合引起蕉葉大面積干枯加速蕉葉衰老死亡田間病株可達(dá)50%?100%， 葉發(fā)病率可高達(dá)70%?80%。在珠江三角洲蕉區(qū)5?6月始見(jiàn)發(fā)病，7?8月高溫多雨季 節(jié)，病害傳播迅速，9?10月病害進(jìn)入高峰，嚴(yán)重危害香蕉葉片，損失嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)50%以 上，目前仍是生產(chǎn)上需重點(diǎn)進(jìn)行藥劑防治的病害。
[0003] 針對(duì)一般病原菌，殺菌劑毒力測(cè)定方法通常采用離體條件下，在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn) 行的不依附于作物體的農(nóng)藥本身對(duì)靶標(biāo)菌的抑菌作用的測(cè)定，如傳統(tǒng)的毒力測(cè)定方法中的 菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定法和孢子萌發(fā)法等。
[0004] 香蕉尾孢菌可在馬鈴薯瓊脂（PDA)培養(yǎng)基上人工分離獲得，但在PDA平板培養(yǎng)基 上生長(zhǎng)速度特別緩慢，難以產(chǎn)生分生孢子，室溫27°C、培養(yǎng)15d菌落直徑也只有3?5mm， 因此，難以通過(guò)孢子萌發(fā)法和菌絲生長(zhǎng)速率法來(lái)進(jìn)行有關(guān)室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)，目前一般通 過(guò)大田活體病斑擴(kuò)展法進(jìn)行毒力測(cè)定，即在田間發(fā)病蕉園選擇初始發(fā)病的中部蕉葉，用油 墨筆標(biāo)記新形成的病斑（約5. OmmX2. Omm)，將各處理藥劑均勻噴施在標(biāo)記蕉葉的正反面。 噴藥前和噴藥后分別調(diào)查并記錄病斑長(zhǎng)度，計(jì)算病斑長(zhǎng)度增加值和抑菌效果，對(duì)不同處理 的抑菌效果進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算EC 5tl值和EC9tl值。該方法目前雖已作為一種香蕉尾孢菌 毒力測(cè)定的方法，但在測(cè)定過(guò)程中存在工作量大、測(cè)定周期長(zhǎng)、環(huán)境條件影響因素較多等缺 點(diǎn)。
[0005] 國(guó)家農(nóng)藥檢定部門及藥劑生產(chǎn)廠家急切需要建立一種新的快速、準(zhǔn)確和有效的測(cè) 定方法，以確定和比較殺菌劑對(duì)香蕉尾孢葉斑病菌的抑菌效果和毒力，為進(jìn)一步的田間藥 效試驗(yàn)和混配藥劑的研制提供理論依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種測(cè)定殺菌劑對(duì)香蕉 尾孢葉斑病菌毒力的方法。該方法可有效測(cè)定殺菌劑對(duì)香蕉尾孢菌的室內(nèi)毒力，為進(jìn)一步 的田間藥效試驗(yàn)和混配藥劑的研制提供了理論依據(jù)，將在香蕉葉斑病的防治中發(fā)揮重要作 用，具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。
[0007] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種測(cè)定殺菌劑對(duì)香蕉尾孢葉斑病菌毒力 的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)制備相同大小的香蕉尾孢菌（Cercospora musae)菌塊；
[0009] (2)在液體培養(yǎng)基中接種步驟（1)制備的香蕉尾孢菌菌絲塊，并加入不同濃度梯 度的待測(cè)殺菌劑，振蕩培養(yǎng)，過(guò)濾，通過(guò)真空抽濾法測(cè)定各處理的菌絲干重，利用DPS數(shù)據(jù) 處理系統(tǒng)計(jì)算試驗(yàn)藥劑對(duì)香蕉尾孢菌菌絲體生長(zhǎng)抑制的EC 5tl和EC9tl，通過(guò)計(jì)算獲得待測(cè)殺 菌劑的毒力。
[0010] 本發(fā)明根據(jù)病原菌生長(zhǎng)特性，其毒力測(cè)定方法不使用常規(guī)的"菌絲生長(zhǎng)速率法"、 "大田活體病斑擴(kuò)展法"，而是采用"菌絲體干重測(cè)定法"，可以更好地達(dá)到有關(guān)室內(nèi)毒力測(cè) 定的目的要求。
[0011] 步驟（1)中所述的香蕉尾孢菌菌塊優(yōu)選按下述方法制備：在PDA平板上培養(yǎng)14? 16d的尾孢菌菌落，用無(wú)菌的手術(shù)刀切成（3. 0?4. 0)mmX (3. 0?4. 0)mm的菌塊；注：該病 原菌菌落硬度強(qiáng)，無(wú)法用打孔器打孔處理。
[0012] 所述的PDA平板是指馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，配方是去皮馬鈴薯200g/L， 葡萄糖20g/L，瓊脂15?20g/L ;
[0013] 步驟⑵中所述的液體培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為：硝酸鈉 3. 75g/L+磷酸氫二鉀 I. 25g/L+ 硫酸鎂 0· 8g/L+ 氯化鉀 0· 8g/L+ 硫酸亞鐵 0· 02g/L+ 蔗糖 30. Og/L，pH 值 7. 0 ;經(jīng) 試驗(yàn)配比，篩選出適合香蕉尾孢菌快速生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基配方，可以在較短時(shí)間內(nèi)形成大 量菌絲球，達(dá)到毒力測(cè)定試驗(yàn)的要求；
[0014] 步驟（2)中所述的菌絲塊的塊數(shù)優(yōu)選為各2塊；
[0015] 步驟（2)中所述的振蕩培養(yǎng)的條件優(yōu)選為在26?28°C條件下100?IlOrpm振蕩 培養(yǎng)10?14天；
[0016] 步驟（2)中所述的過(guò)濾優(yōu)選用真空抽濾法進(jìn)行過(guò)濾；
[0017] 本發(fā)明的機(jī)理是：
[0018] 1、香蕉尾孢菌在PDA平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度特別緩慢，難以產(chǎn)生分生孢子，難以 通過(guò)孢子萌發(fā)法和菌絲生長(zhǎng)速率法來(lái)進(jìn)行有關(guān)室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)，目前一般通過(guò)大田活體 病斑擴(kuò)展法進(jìn)行毒力測(cè)定，但在測(cè)定過(guò)程中存在工作量大、測(cè)定周期長(zhǎng)、環(huán)境條件影響因素 較多等缺點(diǎn)。根據(jù)病原菌生長(zhǎng)特性，其毒力測(cè)定方法采用"菌絲體干重測(cè)定法"，可以更好地 達(dá)到有關(guān)室內(nèi)毒力測(cè)定的目的要求，相比大田活體病斑擴(kuò)展法，節(jié)省大量人力、物力成本， 試驗(yàn)影響因素小，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可信。
[0019] 2、通過(guò)對(duì)查氏培養(yǎng)基的優(yōu)化配比，篩選出適合香蕉尾孢菌生長(zhǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基配 方，可以在較短時(shí)間內(nèi)形成大量菌絲球，達(dá)到毒力測(cè)定試驗(yàn)的要求。
[0020] 3、采用真空抽濾法測(cè)定各處理的菌絲干重，其優(yōu)點(diǎn)在于真空抽濾法過(guò)濾菌液，有 效將菌絲球內(nèi)的水分過(guò)濾掉，保證菌絲干濕度有效統(tǒng)一。香蕉尾孢菌在液體培養(yǎng)基中形成 菌絲球，若采用烘箱干燥法，菌絲球容易粘附在濾紙上，菌絲量不同烘干效果不一致，對(duì)稱 重誤差影響較大。
[0021] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0022] (1)香蕉尾孢菌在特定液體培養(yǎng)基中菌絲體生長(zhǎng)良好，采用菌絲體干重測(cè)定法可 以達(dá)到有關(guān)室內(nèi)毒力測(cè)定的目的要求，相比大田活體病斑擴(kuò)展法，節(jié)省大量人力、物力成 本，試驗(yàn)影響因素小，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可信。
[0023] (2)真空抽濾法過(guò)濾菌液，有效將菌絲球內(nèi)的水分過(guò)濾掉，保證菌絲干濕度有效統(tǒng) 一。香蕉尾孢菌在液體培養(yǎng)基中形成菌絲球，若采用烘箱干燥法，菌絲球容易粘附在濾紙 上，菌絲量不同烘干效果不一致，對(duì)稱重誤差影響較大。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0025] 下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件。
[0026] 實(shí)施例1測(cè)定殺菌劑對(duì)香蕉尾孢葉斑病菌的毒力及兩種殺菌劑的聯(lián)合毒力測(cè)定 和配方篩選。
[0027] 一、試驗(yàn)材料
[0028] (1)供試菌株
[0029] 香蕉尾孢菌（Cercospora musae)，在文獻(xiàn)"50 %醚菌酯干懸浮劑對(duì)香蕉尾孢菌葉 斑病的毒力測(cè)定與防治試驗(yàn)，廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007 (12) :64-66"中公開(kāi)。
[0030] (2)試驗(yàn)藥劑
[0031] 95%丙環(huán)唑原藥，陜西上格之路生物科學(xué)有限公司生產(chǎn)；
[0032] 96%嘧菌酯原藥，陜西上格之路生物科學(xué)有限公司生產(chǎn)。
[0033] 丙環(huán)唑和嘧菌酯分別按照15. 7 :3、13. 7 :5、11. 7 :7、9. 7 :9、7. 7 :11的配比制成混 配制劑。
[0034] (3)供試液體培養(yǎng)基
[0035] 硝酸鈉3. 75g/L+磷酸氫二鉀I. 25g/L+硫酸鎂0· 8g/L+氯化鉀0· 8g/L+硫酸亞鐵 0· 02g/L+ 蔗糖 30. Og/L，pH 值 7. 0。
[0036] (4)供試試劑
[0037] 無(wú)菌水、丙酮、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、蔗糖。
[0038] (5)儀器設(shè)備
[0039] 三角瓶、電子天平、移液器、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、全溫度搖瓶柜、真空泵等。
[0040] 二、試驗(yàn)方法
[0041] 共設(shè)7個(gè)藥劑配比：95 %丙環(huán)唑原藥、96 %嘧菌酯原藥、15. 7 %丙環(huán)唑+3 %嘧菌 酯混劑、13. 7%丙環(huán)唑+5%嘧菌酯混劑、11. 7%丙環(huán)唑+7%嘧菌酯混劑、9. 7%丙環(huán)唑+9% 嘧菌酯混劑和7. 7%丙環(huán)唑+11%嘧菌酯混劑，各配比分別配制成0. 1、0. 25、0. 5、1、2. 5和 5 μ g/mL共6個(gè)不同濃度的含藥培養(yǎng)基，并設(shè)空白對(duì)照。
[0042] 每濃度處理均設(shè)4次重復(fù)。
[0043] 將供試藥劑按不同劑量加入定量的液體培養(yǎng)基中，配制成系列濃度的含藥培養(yǎng) 基。7個(gè)試劑配方分別配制成6個(gè)不同濃度的含藥培養(yǎng)基，每濃度處理均設(shè)4次重復(fù)。在無(wú)菌 狀態(tài)下將2塊大小3. OmmX 3. Omm尾孢菌菌絲塊，接入含藥的定量液體培養(yǎng)基中，在27. (TC、 120r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。
[0044] 香蕉尾孢菌振蕩培養(yǎng)12天后，先將菌絲體用濾紙過(guò)濾，再用真空泵進(jìn)行抽濾，然 后用電子天平稱量菌絲體干重，與空白對(duì)照比較，利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算試驗(yàn)藥劑對(duì) 香蕉尾孢菌菌絲體生長(zhǎng)抑制的EC5tl和EC9tl，以及試驗(yàn)藥劑的毒力回歸方程。
[0045] 三、試驗(yàn)結(jié)果
[0046] 表1香蕉尾孢菌培養(yǎng)12天后各濃度處理的菌絲體干重及抑菌效果
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 一種測(cè)定殺菌劑對(duì)香蕉尾孢葉斑病菌毒力的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 制備相同大小的香蕉尾孢菌（Cercospora musae)菌塊； (2) 在液體培養(yǎng)基中接種步驟（1)制備的香蕉尾孢菌菌絲塊，并加入不同濃度梯度的 待測(cè)殺菌劑，振蕩培養(yǎng)，過(guò)濾，通過(guò)真空抽濾法測(cè)定各處理的菌絲干重，利用DPS數(shù)據(jù)處理 系統(tǒng)計(jì)算試驗(yàn)藥劑對(duì)香蕉尾孢菌菌絲體生長(zhǎng)抑制的EC 5(I和EC9(I，通過(guò)計(jì)算獲得待測(cè)殺菌劑 的毒力。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中所述的液體培養(yǎng)基的組成為： 硝酸鈉3. 75g/L+磷酸氫二鉀1. 25g/L+硫酸鎂0· 8g/L+氯化鉀0· 8g/L+硫酸亞鐵0· 02g/L+ 蔗糖 30.0g/L，pH 值 7.0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中所述的香蕉尾孢菌菌塊按下 述方法制備：在PDA平板上培養(yǎng)14?16d的尾孢菌菌落，用無(wú)菌的手術(shù)刀切成（3. 0?4. 0) mmX (3. 0 ?4. 0)mm 的菌塊。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述的PDA平板是指馬鈴薯葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基平板，配方是去皮馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15?20g/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中所述的菌絲塊的塊數(shù)為各2 塊。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中所述的振蕩培養(yǎng)的條件為在 26?28°C條件下100?llOrpm振蕩培養(yǎng)10?14天。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中所述的過(guò)濾用真空抽濾法進(jìn) 行過(guò)濾。
【文檔編號(hào)】G01N5/00GK104237047SQ201410428735
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】宋曉兵, 彭埃天, 凌金鋒, 陳霞 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所