一種c反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑及應(yīng)用該試劑的試紙的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑及應(yīng)用該試劑的試紙，C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑包括以下組分：包被用CRPⅠ抗體劃線：0.1-3mg/ml；包被用goatantirabbit抗體C1線：0.1-1mg/ml；包被用goatantirabbit抗體C2線：0.1-1mg/ml；標(biāo)記用CRPⅡ抗體：每毫升膠體金中CRPⅡ抗體含量為1-10μg；標(biāo)記用兔IgG抗體：每毫升膠體金中兔IgG抗體含量為5-20μg；金重懸液：含20mMTris的Tris-Hcl重懸液,pH7-10；樣品墊處理液：含20mMTris的Tris-Hcl溶液,pH7-10；樣品稀釋液：含20mMTris的Tris-Hcl溶液,pH8。本發(fā)明的檢測試劑及試紙，使用方便，檢測效率高，響應(yīng)速度快，靈敏度高，特異性好。
【專利說明】一種C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑及應(yīng)用該試劑的試紙
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)領(lǐng)域C反應(yīng)蛋白檢測試劑及應(yīng)用該試劑的試紙，特別是一種C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑及應(yīng)用該試劑的試紙。
[0003]本專利文件中所涉及之術(shù)語含義:
0.9% Nacl:表不配直完成后的溶液中每10mL含Nacl0.9g。
[0004]類似格式均表示類似含義，本文另有說明的除外。
[0005]

【背景技術(shù)】
[0006]C反應(yīng)蛋白，1930年Tillet和Francis在急性大葉性肺炎患者血清中發(fā)現(xiàn)能在隹丐離子存在時(shí)與肺炎球菌C多糖起沉淀反應(yīng)而得名，是人類重要的急性期反應(yīng)蛋白，急性期濃度可升高上千倍，循環(huán)中的CRP半衰期為19小時(shí)。人類CRP是由肝臟產(chǎn)生，由五個(gè)相同的亞基依靠非共價(jià)鍵形成的環(huán)狀五聚體，這一特征性結(jié)構(gòu)使其歸類于五聚素(一組具有免疫防御特性的鈣結(jié)合蛋白)家族。低等動(dòng)物同樣存在CRP，如在鱟、河蛘等中也發(fā)現(xiàn)過，但并不一定起急性期反應(yīng)蛋白的作用。CRP特征反應(yīng)是能在鈣離子存在的條件下特異性結(jié)合磷酸膽堿基團(tuán)。
[0007]人高敏C 反應(yīng)蛋白(Human C-reactive protein, CRP),簡稱 HS-CRP,因其能和肺炎雙球菌的細(xì)胞壁的C多糖起沉淀反應(yīng)而得名，是相對分子質(zhì)量為115-140KD的血清β球蛋白。CRP持續(xù)增高提示機(jī)體存在慢性炎癥或自身免疫疾病，CRP在病毒感染時(shí)不會(huì)升高，其變化不受患者的個(gè)體差異、機(jī)體狀態(tài)和治療藥物的影響。近年來，隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，采用超敏感方法檢測到的CRP被稱為超敏CRP。大量的文章研究顯示，它在冠心病、中風(fēng)、周圍血管栓塞等疾病診斷和預(yù)測中發(fā)揮越來越重要的作用，甚至被認(rèn)為是心血管病危險(xiǎn)評估的“金標(biāo)準(zhǔn)”。從檢測角度上來說，目前臨床上用于測定HS-CRP的方法主要有放免法、ELISA法、化學(xué)發(fā)光法等。
[0008]CRP是由5個(gè)完全相同的非糖基化的亞單位非共價(jià)聯(lián)結(jié)，每個(gè)亞單位相對分子質(zhì)量23017，由206個(gè)氨基酸殘基組成。CRP這種盤狀五聚體特征結(jié)構(gòu)使其歸于五聚素(pentraxins)家方矣。
[0009]CRP是在組織受損、發(fā)炎或感染時(shí)，經(jīng)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素6 (IL-6)等誘導(dǎo)，主要在肝臟中合成，為急性期時(shí)相反應(yīng)蛋白。CRP在健康人血清中濃度很低，但對炎癥反應(yīng)非常敏感，炎癥開始4h?7h其濃度就顯著升高，是非特異性的炎癥指示劑。CRP水平可以反映機(jī)體潛在的炎癥活躍程度，廣泛應(yīng)用于臨床。
[0010]健康人的CRP值非常低，一般小于0.8mg/L，90%的健康人CRP〈0.3mg/L。而在炎性反應(yīng)或急性損傷后，CRP的合成則在4?6h內(nèi)迅速增加，36?50h達(dá)高峰，峰值可為正常值的100?1000倍。其半衰期較短(4?6h)，經(jīng)積極合理治療后，3?7天迅速降至正常。
[0011]膠乳顆粒增強(qiáng)比濁法是近年來出現(xiàn)的一種較為穩(wěn)定、準(zhǔn)確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法。PETIA法大體分為兩種。一種是散射比濁檢測法；另一種是透射比濁檢測法。這兩種方法的基本原理非常相似，都是在高分子膠乳微球的表面交聯(lián)單克隆抗體，當(dāng)交聯(lián)有抗體的微球與抗原結(jié)合后，在短時(shí)間內(nèi)會(huì)迅速聚集在一起，改變了反應(yīng)液的散光性能或透光性能。而且，反應(yīng)液散光性能或透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原的濃度有較強(qiáng)的相關(guān)性，在一定范圍內(nèi)可以反映被測抗原的濃度。PETIA檢測方法是在均相反應(yīng)體系中進(jìn)行抗原、抗體反應(yīng)及結(jié)果的測定。
[0012]由于血清CRP的含量分布差異較大從零點(diǎn)幾毫克每升到幾百毫克每升，其測定方法需要較高的靈敏度和特異性。目前，免疫比濁法是最為普遍通用的方法，但是傳統(tǒng)的CRP檢測不適合單人份測試、檢測時(shí)間較長，并且需要大型的生化檢測儀，不適用于規(guī)模較小的醫(yī)院。
[0013]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]為解決上述問題，本發(fā)明公開了一種C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑及應(yīng)用該試劑的試紙，該試劑靈敏度高，線性范圍寬，生產(chǎn)成低，使用方便，同時(shí)該試劑的試紙使用方便，靈敏度高，測試準(zhǔn)確，極大地方便了對C反應(yīng)蛋白的測定。
[0015]本發(fā)明公開的C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑包括以下組分:
包被用CRP I抗體劃線:0.l-3mg/ml ；
包被用 goat anti rabbit 抗體 Cl 線:0.1-lmg/ml ；
包被用 goat anti rabbit 抗體 C2 線:0.1-lmg/ml ；
標(biāo)記用CRP II抗體:每毫升膠體金中CRP II抗體含量為1-10 μ g ；
標(biāo)記用兔IgG抗體:每毫升膠體金中兔IgG抗體含量為5-20 μ g ；
金重懸液:含20mM Tris的Tris-Hcl重懸液，pH 7-10 ；
樣品墊處理液:含20mM Tris的Tris-Hcl溶液，pH 7-10 ；
樣品稀釋液:含20mM Tris的Tris-Hcl溶液，pH 8。
[0016]作為一種優(yōu)選,金重懸液中Tris-Hcl重懸液還含0.1-0.5% casein, 5-20%鹿糖，1-3% BSA,0.1-0.3% tween20,0.05% NaN3。
[0017]作為一種優(yōu)選，樣品墊處理液中Tris-Hcl溶液還含1-5% PVP,l-5% tritonX
100,0.1-0.5% Casein,0.05% NaN3。
[0018]作為一種優(yōu)選，樣品稀釋液中Tris-Hcl溶液還含0.9% Nacl,0.05% NaN3。
[0019]本發(fā)明公開的試紙，包括底板、樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙，底板、樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙均為長條形，樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙均設(shè)置在底板上表面，樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙順次由底板一端向底板另一端設(shè)置。
[0020]作為一種優(yōu)選，樣品墊與金標(biāo)墊相鄰端、金標(biāo)墊與醋酸纖維膜相鄰端以及醋酸纖維膜與吸水紙相鄰端重疊，重疊部分寬度均為2_，所述樣品墊與金標(biāo)墊相鄰端為樣品墊疊放在金標(biāo)墊上，所述金標(biāo)墊與醋酸纖維膜相鄰端為金標(biāo)墊疊放在醋酸纖維膜上，所述醋酸纖維膜與吸水紙相鄰端為吸水紙疊放在醋酸纖維膜上。通過疊放部分形成不同結(jié)構(gòu)間良好的橋接作用，便于展開劑展開并且與介質(zhì)充分接觸，提高試紙響應(yīng)速度、改善檢測效果和檢測穩(wěn)定性。
[0021]作為一種優(yōu)選，底板為PVC板，并且所述底板、樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙均為等寬長條形。如此不僅規(guī)格整齊，還可以保證試紙具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)便于保存，同時(shí)能夠保證在穩(wěn)定的尺寸下，保證層析過程具有良好的穩(wěn)定性和顯示平滑性。
[0022]作為一種優(yōu)選，樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙均為多孔材質(zhì)板。
[0023]本發(fā)明公開的C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑，反應(yīng)靈敏，應(yīng)用范圍廣泛，通過半定量測試方法在C反應(yīng)蛋白檢測中可以迅速對其生理指數(shù)進(jìn)行檢測，對檢測對象的身體狀態(tài)進(jìn)行初步判斷，降低了檢測應(yīng)用成本。
[0024]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1、本發(fā)明試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026]附圖標(biāo)記列表:
1、底板；2、樣品塾； 3、金標(biāo)塾；
4、醋酸纖維膜； 5、吸水紙。
[0027]

【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解下述【具體實(shí)施方式】僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。需要說明的是，下面描述中使用的詞語“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附圖中的方向，詞語“內(nèi)”和“外”分別指的是朝向或遠(yuǎn)離特定部件幾何中心的方向。
[0029]本發(fā)明公開的C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑包括以下組分:
包被用CRP I抗體劃線:0.l-3mg/ml ；
包被用 goat anti rabbit 抗體 Cl 線:0.1-lmg/ml ；
包被用 goat anti rabbit 抗體 C2 線:0.1-lmg/ml ；
標(biāo)記用CRP II抗體:每毫升膠體金中CRP II抗體含量為1-10 μ g ；
標(biāo)記用兔IgG抗體:每毫升膠體金中兔IgG抗體含量為5-20 μ g ；
金重懸液:含20mM Tris的Tris-Hcl重懸液，pH 7-10 ；
樣品墊處理液:含20mM Tris的Tris-Hcl溶液，pH 7-10 ；
樣品稀釋液:含20mM Tris的Tris-Hcl溶液，pH 8。
[0030]作為一種優(yōu)選,金重懸液中Tris-Hcl重懸液還含0.1-0.5% casein, 5-20%鹿糖，1-3% BSA,0.1-0.3% tween20,0.05% NaN3。
[0031]作為一種優(yōu)選，樣品墊處理液中Tris-Hcl溶液還含1-5% PVP,l-5% tritonX
100,0.1-0.5% Casein,0.05% NaN3。
[0032]作為一種優(yōu)選，樣品稀釋液中Tris-Hcl溶液還含0.9% Nacl,0.05% NaN3。
[0033]本發(fā)明公開的試紙，包括底板1、樣品墊2、金標(biāo)墊3、醋酸纖維膜4和吸水紙5，底板1、樣品墊2、金標(biāo)墊3、醋酸纖維膜4和吸水紙5均為長條形，樣品墊2、金標(biāo)墊3、醋酸纖維膜4和吸水紙5均設(shè)置在底板I上表面，樣品墊2、金標(biāo)墊3、醋酸纖維膜4和吸水紙5順次由底板I一端向底板I另一端設(shè)置。
[0034]作為一種優(yōu)選，樣品墊2與金標(biāo)墊3相鄰端、金標(biāo)墊3與醋酸纖維膜4相鄰端以及醋酸纖維膜4與吸水紙5相鄰端重疊，重疊部分寬度均為2_，所述樣品墊2與金標(biāo)墊3相鄰端為樣品塾2置放在金標(biāo)塾3上，所述金標(biāo)塾3與醋酸纖維I吳4相鄰端為金標(biāo)塾3置放在醋酸纖維膜4上，所述醋酸纖維膜4與吸水紙5相鄰端為吸水紙5疊放在醋酸纖維膜4上。
[0035]作為一種優(yōu)選，底板I為PVC板，并且所述底板1、樣品墊2、金標(biāo)墊3、醋酸纖維膜4和吸水紙5均為等寬長條形。
[0036]作為一種優(yōu)選，樣品墊2、金標(biāo)墊3、醋酸纖維膜4和吸水紙5均為多孔綿材質(zhì)板，材料中微孔孔徑10-100 μ m占75-80%，并且樣品墊2、金標(biāo)墊3、醋酸纖維膜4和吸水紙5比表面積均大于lm2/g。
[0037]以下實(shí)施例均采用薄層層析法來舉例說明本申請，但本申請?jiān)噭┑膽?yīng)用不僅僅限于薄層層析法，還可以采用其它方案，如柱層析或紙層析。
[0038]實(shí)施例1
1.樣品(血清或血漿)用樣品稀釋液按1:200稀釋；
2.取40μ I稀釋好的樣品，滴加到本發(fā)明公開的試紙上樣品墊上；
3.室溫水平靜置1min；
4.1Omin后，根據(jù)質(zhì)控線判斷樣品測試結(jié)果。
[0039]一、膠體金的制備原材料:
2% HAucl4Clg HAucl4溶解于50ml去離子水中)
I %檸檬酸三鈉溶液(Ig檸檬酸三鈉二水溶于10ml去離子水中)
方法:
1、取198ml ddH20( 二次蒸餾水)于錐形瓶中，加入2ml 2% HAuCL4溶液，混勻。
[0040]2、錐形瓶置于上，加熱沸騰。
[0041]3、迅速一次性加入5ml I %檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸。
[0042]4、觀察溶液顏色變化，由淺黃一黑色一紫色一紫紅色，當(dāng)完全變?yōu)樽霞t色時(shí)，繼續(xù)保持沸騰5分鐘。
[0043]5、停止加熱，冷卻至室溫，制得膠體金。
[0044]二、抗體的標(biāo)記(金標(biāo)液，按照下述步驟逐步配置)
1、取2個(gè)1.5ml離心管
2、分別加入4μ I 0.2Μ K2CO3溶液
3、分別加入Iml前述膠體金混勻
4、分別加入2μg CRP II與5μ g兔IgG，加入抗體后立即混勻，再靜置15min
5、加入1%BSA，混勻后靜置15min
6、離心機(jī)1000rpm離心5min,輕輕吸取上清液
7、最后用Iml 金重懸液 pH9.4, 2OmM Tris-Hcl 重懸(含 0.2% casein, 10%鹿糖，2%BSA,0.1% tween20 ；0.05% NaN3)重懸即可。
[0045]三、劃線與點(diǎn)金劃線:
1、將CRP I抗體稀釋至lmg/ml，稀釋溶劑為PBS (10nM-50mM，以磷酸根濃度計(jì)，本處優(yōu)選濃度1nM)，得到包被用CRP I抗體劃線用試劑。
[0046]GAR (goat anti rabbit)抗體分別稀釋至0.12和0.25mg/ml,稀釋溶劑為PBS(10-50mM,以磷酸根濃度計(jì),本處優(yōu)選濃度20mM),分別作為包被用goat anti rabbit抗體Cl線和包被用goat anti rabbit抗體C2線劃線用試劑。
[0047]2、用劃線儀分別在距離醋酸纖維(NC)膜一端(金標(biāo)墊側(cè))7.5mm, 11.5mm, 15.5mm處劃lmg/ml CRP I (檢測線)，0.12mg/ml (包被用goat anti rabbit抗體Cl線，質(zhì)控線)與0.25mg/ml (包被用goat anti rabbit抗體C2線,質(zhì)控線)的GAR抗體線。劃線速度為1.0ul/cm。
[0048]3、畫完后，除濕機(jī)前烘干。
[0049]點(diǎn)金:
30cm*0.6cm的金標(biāo)墊用500 μ I (CRP11與兔IgG金標(biāo)液都為250 μ I組成)的金標(biāo)液均勻浸潤，至于除濕機(jī)前烘干
四、樣品墊的預(yù)處理樣品墊預(yù)處理液:
20Mm Tris-hcl pH 10:含 2% PVP，2% tritonX 100,0.2% Casein ；0.05% NaN30
[0050]30cm*1.7cm的樣品墊用3ml的樣品墊預(yù)處理液處理,至于除濕機(jī)前烘干
五、試紙組裝
試紙的組裝如圖1，樣品墊為18mm,金標(biāo)墊為6mm,醋酸纖維膜為25mm,吸水紙為17mm,樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙重疊部分都為2_，底板選用PVC板，底板長度至少為樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙的長度總和。組裝后用斬切機(jī)切成4_寬的試紙條。
[0051]六、樣品測試
樣品稀釋液:20mM Tris-hcl pH 8(0.9% Nac 1,0.05% NaN3)
樣品經(jīng)樣品稀釋液稀釋后，以滴40ul于試紙上樣品墊距底端5-8mm處，室溫靜置1min,流動(dòng)方向?yàn)閳D1中箭頭方向。
[0052]七、檢測結(jié)果
以下樣品的檢測可以選用本申請?jiān)嚰垶檩d體也可以選用專用檢測儀或者光度儀。
[0053]1、相關(guān)性實(shí)驗(yàn)
將本C反應(yīng)蛋白半定量檢測試紙與CRP定量生化檢測儀比對臨床血清樣品。結(jié)果顯示本研發(fā)的試紙檢測結(jié)果與定量生化檢測儀檢測的結(jié)果有較好的相關(guān)性。

【權(quán)利要求】
1.一種C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑，其特征在于:所述C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑包括以下組分: 包被用CRP I抗體劃線:0.1-3 mg/ml ； 包被用 goat anti rabbit 抗體 Cl 線:0.1-1 mg/ml ； 包被用 goat anti rabbit 抗體 C2 線:0.1-1 mg/ml ； 標(biāo)記用CRP II抗體:每毫升膠體金中CRP II抗體含量為1-10 μ g ； 標(biāo)記用兔IgG抗體:每毫升膠體金中兔IgG抗體含量為5-20 μ g ； 金重懸液:含20mM Tris的Tris-Hcl重懸液，pH 7-10 ； 樣品墊處理液:含20mM Tris的Tris-Hcl溶液，pH 7-10 ； 樣品稀釋液:含20mM Tris的Tris-Hcl溶液，pH 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑，其特征在于:所述金重懸液中 Tris-Hcl 重懸液還含 0.1-0.5%casein, 5-20% 蔗糖，1_3%BSA，0.1-0.3% tween20,0.05%NaN3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑，其特征在于:所述樣品墊處理液中 Tris-Hcl 溶液還含 1-5% PVP，1-5% tritonX 100，0.1-0.5% Casein, 0.05% NaN30
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑，其特征在于:所述樣品稀釋液中 Tris-Hcl 溶液還含 0.9% Nacl,0.05% NaN30
5.一種應(yīng)用如權(quán)利要求1所述的C反應(yīng)蛋白半定量檢測試劑的試紙，其特征在于:所述試紙包括底板、樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙，所述底板、樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙均為長條形，所述樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙均設(shè)置在底板上表面，所述樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙順次由底板一端向底板另一端設(shè)置。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試紙，其特征在于:所述樣品墊與金標(biāo)墊相鄰端、金標(biāo)墊與醋酸纖維膜相鄰端以及醋酸纖維膜與吸水紙相鄰端重疊，重疊部分寬度均為2mm，所述樣品墊與金標(biāo)墊相鄰端為樣品墊疊放在金標(biāo)墊上，所述金標(biāo)墊與醋酸纖維膜相鄰端為金標(biāo)墊疊放在醋酸纖維膜上，所述醋酸纖維膜與吸水紙相鄰端為吸水紙疊放在醋酸纖維膜上。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試紙，其特征在于:所述底板為PVC板，并且所述底板、樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙均為等寬長條形。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試紙，其特征在于:所述樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙均為多孔材質(zhì)板。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試紙，其特征在于:所述樣品墊、金標(biāo)墊、醋酸纖維膜和吸水紙均為多孔材質(zhì)板。
【文檔編號】G01N33/68GK104198731SQ201410430781
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】蔣海, 張聞, 周海濱, 王建飛 申請人:寧波瑞源生物科技有限公司