一種用于痕量汞離子檢測的酶基電化學(xué)生物傳感方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種用于痕量汞離子檢測的酶基電化學(xué)生物傳感方法，屬于環(huán)境分析領(lǐng)域。本發(fā)明利用胸腺嘧啶與汞離子特異性作用和核苷酸外切酶Ⅲ循環(huán)放大功能實(shí)現(xiàn)對痕量汞離子檢測。探針DNA與目標(biāo)DNA通過捕獲汞離子雜交形成特殊結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA，結(jié)果pDNA被ExoⅢ消化，而tDNA游離出繼續(xù)與其他的pDNA雜交并重復(fù)上述過程。消化后殘留pDNA與[Ru(NH3)6]3+電信號(hào)強(qiáng)度成正比，故可實(shí)現(xiàn)對汞離子檢測。本發(fā)明的酶基電化學(xué)生物傳感方法具有靈敏度高、選擇性高、成本低等特點(diǎn)，對汞離子檢測線性范圍為0.01-500nM，檢測限為1pM。
【專利說明】—種用于痕量汞離子檢測的酶基電化學(xué)生物傳感方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境分析領(lǐng)域，涉及一種用于痕量汞離子檢測的酶基電化學(xué)生物傳感方法。

【背景技術(shù)】
[0002]作為一種非必需元素，汞離子能對人體組織和內(nèi)臟器官產(chǎn)生永久性的傷害[Bontidean I, Mortari A, Leth S，Brown N L, Karlson U, Larsen M M, VangronsveldJ, Corbisier P, Csoregi E.Environ.Pollut., 2004, 131 (2), 255-262]。污水中的萊離子一旦通過食物鏈間進(jìn)入人體后，人體自身的新陳代謝系統(tǒng)很難將其排出體外[Yu C J, Cheng TL, Tseng W L.B1sens.B1electron.2009, 25 (I): 204-210]。就萊離子的毒性而言，即使人體長期暴露在較低濃度汞源中，也能產(chǎn)生可遺傳的毒性。因此開發(fā)新型簡單的檢測方法以便高效地檢測痕量的汞離子是一件非常有意義的工作。
[0003]傳統(tǒng)的汞離子檢測方法主要為原子吸收或發(fā)射光譜、熒光分析、誘導(dǎo)耦合等離子體質(zhì)譜、X射線吸收光譜等。然而每種方法至少有如下缺點(diǎn)之一:設(shè)備昂貴、方法復(fù)雜、穩(wěn)定性差、耗時(shí)、靈敏度不高、選擇性一般。最近報(bào)道的一些傳感方法對汞離子檢測具有較好的靈敏度，但是這些方法主要集中在光傳感技術(shù)上，而光傳感技術(shù)嚴(yán)重依賴于復(fù)雜的設(shè)備和嚴(yán)格的操作技能。
[0004]作為最具潛力的檢測技術(shù)之一，電化學(xué)生物傳感器在汞離子檢測方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。因?yàn)檫@種技術(shù)所需設(shè)備簡單、耗時(shí)少、成本低，而且可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)原位分析。特別是，汞離子能特異性與兩個(gè)胸腺嘧啶堿基作用形成T-Hg2+-T絡(luò)合物，為開發(fā)高選擇性高靈敏度的檢測汞離子的電化學(xué)生物傳感器奠定了基礎(chǔ)。為了達(dá)到此目標(biāo)，當(dāng)前主要有三種信號(hào)放大方法來提高電化學(xué)生物傳感器對汞離子檢測的靈敏度，即納米材料[Zhang Y, Zhao
H,Wu Z, Xue Y, Zhang X, He Y, Li X, Yuan Z.B1sens.B1electron., 2013, 48, 180-187.] >酶[Dominguez-Renedo 0, Alonso-Lomillo M A, Ferreira-Goncalves L,Arcos-MartinezM J, Talanta, 2009，79 (5)，1306-1310.]、DNA 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[ffu D, Zhang Q, Chu X，Wang H, ShenG, Yu R, B1sens.B1electron.，2010，25 (5)，1025-1031.]。其中酶作為一種特異性和高效性的催化劑，被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建，去監(jiān)測食品和環(huán)境安全[A.Amine，H.Mohammadi,1.Bourais, G.Palleschi, B1sens.B1electron., 2006, 21 (8), 1405-1423.]。但是目前酶基電化學(xué)生物傳感器對汞離子檢測的研究很少，并且用于構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器的酶主要集中在鏈霉親和素-過氧化氫酶(HRP)和脲酶，而這兩種酶基電化學(xué)生物傳感器對汞離子的最低檢出限遠(yuǎn)高于另外兩種(基于納米材料或DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變)電化學(xué)生物傳感器的最低檢出限。因此篩選新的高效酶和設(shè)計(jì)新的檢測方法是構(gòu)建用于汞離子檢測的高選擇性高靈敏度的酶基電化學(xué)生物傳感器的關(guān)鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明的目的:本發(fā)明的目的通過篩選新的酶體系和設(shè)計(jì)新的檢測路線，利用T-Hg2+-T特異性作用和核苷酸外切酶III (Exo III)循環(huán)放大效應(yīng)的協(xié)同作用，在保證對汞離子的高選擇性的前提下，極大地提高酶基電化學(xué)生物傳感器的靈敏度。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0007]本發(fā)明提供了一種用于痕量汞離子檢測的酶基電化學(xué)生物傳感方法，包括如下步驟:
[0008](I)將10-20 μ L的含有I μ M的探針DNA(pDNA)的孵化緩沖液滴加到清潔后的金電極表面,在4°C下孵化24小時(shí)，即得到pDNA修飾后的金電極(pDNA/Au);其中，pDNA的孵化緩沖液的成分為:0.1M NaCl、10 μ M三(2-羧乙基)膦(TCEP)和pH = 7.4的1mM三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液(Tris-HCl)。
[0009](2)將步驟⑴得到的pDNA/Au浸入到6_巰基己_1_醇(MCH)緩沖溶液中，保持
1-2小時(shí)，用于減少pDNA在金電極表面的非特異性地吸附，即得到處理后的pDNA/Au。其中，MCH緩沖溶液的成分為l-5mM MCH和pH = 7.4的1mM Tris-HCl。
[0010](3)將經(jīng)過步驟⑵處理后的pDNA/Au用pH = 7.4的Tris-HCl淋洗，再浸入含有濃度不大于10 μ M汞離子的核苷酸外切酶III (Exo III)消化緩沖液中，在37-40°C恒溫水浴中反應(yīng)10-30分鐘，即得到消化后的pDNA/Au電極。其中，Exo III消化緩沖液的成分為pH =8 的 50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、ImM 二硫蘇糖醇(DTT)、0.1-1 μ M tDNA、1.8units/μ L ExoIII和 0.2-0.6Μ NaCl。
[0011](4)將步驟(3)得到的消化后的pDNA/Au電極浸入含有pH = 7.0的1mM Tris-HCl和50 μ M氯化六氨合釕(Ru (NH3)63+或RuHex)電解質(zhì)溶液中，利用方波伏安(SWV)進(jìn)行測試并分析結(jié)果。測試參數(shù)為:初始電壓-0.6V，終止電壓0V，頻率25Hz。由于靜電作用，帶正電的Ru (NH3) 63+會(huì)強(qiáng)烈的吸附到帶負(fù)電pDNA的磷酸骨架上，并被還原為Ru (NH3) 62+，因此產(chǎn)生電信號(hào)。由于電信號(hào)的強(qiáng)度與被Exo III消化后殘余的pDNA量成正比，所以能實(shí)現(xiàn)對溶液中汞離子的檢測。
[0012]所述的探針DNA為5’端巰基修飾的單鏈核苷酸。
[0013]與pDNA雜交的互補(bǔ)鏈tDNA是具有4個(gè)胸腺嘧啶失配的單鏈核苷酸，其堿基數(shù)比pDNA的堿基數(shù)至少多5個(gè)。
[0014]步驟⑴中金電極在使用前需要清潔，具體方法如下:
[0015]將金電極分別在I μ m、0.3 μ m和0.05 μ m粒徑的氧化鋁拋光粉的懸浮液中依次研磨5-10分鐘，每次研磨后分別用乙醇和高純水超聲清洗5分鐘，待電極干燥后，浸入體積比為3:1的濃硫酸和雙氧水的混合溶液中保持30分鐘,然后用高純水清洗,作為工作電極浸入0.5M的H2SO4溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直到掃描曲線穩(wěn)定，最后用高純水清洗并用N2吹干。
[0016]本發(fā)明具有如下效果:
[0017](I)靈敏度高，檢測限可達(dá)IpM(S/N = 3)。
[0018](2)選擇性高，噪聲值低。
[0019](3)成本低和操作簡單，利用普通的恒電位儀掃描和分析即可，不需要復(fù)雜昂貴的大型設(shè)備，而且避免納米材料基電化學(xué)生物傳感器的繁瑣的材料制備過程。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明所述的一種用于痕量汞離子檢測的酶基電化學(xué)生物傳感方法的檢測過程示意圖。
[0021]圖2是本發(fā)明所構(gòu)建的酶基電化學(xué)生物傳感方法對不同濃度的汞離子的SWV響應(yīng)圖。
[0022]圖3A為不同濃度的汞離子與其SWV峰電流的關(guān)系圖。
[0023]圖3B為不同濃度的汞離子與其SWV峰電流的線性范圍圖(0.01_500nM范圍內(nèi)R2=0.9987)。
[0024]圖4為所構(gòu)建的酶基電化學(xué)生物傳感方法對汞離子的選擇性測試圖(圖中金屬離子濃度均為10 μ Μ，其電流值是通過SWV測定所得)。
[0025]圖中:a為OnM汞離子的SWV響應(yīng)圖；b為0.002nM汞離子的SWV響應(yīng)圖；c為
0.0lnM汞離子的SWV響應(yīng)圖；d為0.05nM汞離子的SWV響應(yīng)圖；e為0.5nM汞離子的SWV響應(yīng)圖；f為5nM汞離子的SWV響應(yīng)圖；g為50nM汞離子的SWV響應(yīng)圖；h為500nM汞離子的SWV響應(yīng)圖；i為1000nM汞離子的SWV響應(yīng)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026]以下結(jié)合附圖和技術(shù)方案，進(jìn)一步說明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0027]本發(fā)明涉及一種用于痕量汞離子檢測的酶基電化學(xué)生物傳感方法，本方法通過PDNA與具有4個(gè)胸腺嘧啶(T)失配的tDNA雜交，形成T-Hg2+-T絡(luò)合物，來保證該傳感器對汞離子檢測的高選擇性。由于這種雜交形成的雙鏈DNA具有pDNA的3’端為平端而tDNA的3’端多出一定量堿基的特殊結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致雙鏈DNA中pDNA被Exo III消化，而tDNA完整地游離出來繼續(xù)與其他的PDNA雜交，并重復(fù)上述過程，在這過程中pDNA被循環(huán)利用，產(chǎn)生了累積放大的效應(yīng)，這樣實(shí)現(xiàn)該傳感器對汞離子檢測的高靈敏度。
[0028]下面對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于所述實(shí)施例。
[0029]實(shí)施例1:一種用于痕量汞離子檢測的酶基電化學(xué)生物傳感方法，如圖1所示，包括如下步驟:
[0030](I)將直徑為2mm金電極分別在I μ m、0.3 μ m和0.05 μ m粒徑的氧化鋁拋光粉的懸浮液中依次研磨5-10分鐘，每次研磨后需用乙醇和高純水超聲清洗5分鐘，待電極干燥后，浸入新制備的濃硫酸和30%雙氧水(體積比3:1)的混合溶液中保持30分鐘,然后用高純水清洗，作為工作電極浸入0.5M的H2SO4溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直到掃描曲線穩(wěn)定，最后用高純水清洗并用N2吹干。
[0031](2)將10 μ L的含有I μ M的探針DNA (pDNA)孵化緩沖液加到清潔后的金電極表面，將其在4°C下孵化24小時(shí)，通過自組裝形成pDNA修飾的金電極(pDNA/Au)。其中，pDNA孵化緩沖溶液的成分為:0.1M NaClUO μ M三(2-羧乙基)膦(TCEP)、pH = 7.4的1mM三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液(Tris-HCl)。pDNA為19個(gè)堿基的5’端有巰基修飾的單鏈DNA，其序列為:
[0032]5，-SH- (CH2) 6-GATTCCGTGCATGACTCAG_3'。
[0033](3)進(jìn)一步地，將pDNA/Au浸入到6_巰基己_1_醇(MCH)的緩沖溶液中，保持2小時(shí)，用于減少PDNA在金電極表面的非特異性地吸附。其中，MCH緩沖溶液的成分為5mM MCH和 1mM Tris-HCl(pH = 7.4)。
[0034](4)進(jìn)一步地，將電極用1mM Tris-HCl (pH = 7.4)淋洗后，浸入到加有不同濃度汞離子的核苷酸外切酶III (Exo III)的消化緩沖液中，在37°C恒溫水浴中反應(yīng)10-30分鐘。最后將電極取出用1mM Tris-HCKpH = 7.4)淋洗后，浸入含有1mM Tris-HCl (pH = 7.0)和50 μ M氯化六氨合釕電解質(zhì)溶液中，利用方波伏安進(jìn)行測試并分析結(jié)果。其中，核苷酸外切酶III (Exo III)的消化緩沖液的成分為 50mM Tris-HCl (pH = 8), 5mM MgCl2, ImM 二硫蘇糖醇(01'1')，1“]?目標(biāo)0嫩&0嫩)，1.81111^8/^1^ Exo III 和 0.4Μ NaCl ; tDNA 為 24 個(gè)堿基的單鏈DNA，且與pDNA具有4個(gè)堿基T失配，其堿基序列為:
[0035]5’ -CTGTGTCTTGCTCGGTATCAAGCG-3’ 。
[0036]實(shí)施例2:—種用于痕量汞離子檢測的酶基電化學(xué)生物傳感方法，如圖1所示，包括如下步驟:
[0037](I)將直徑為2mm金電極分別在I μ m、0.3 μ m和0.05 μ m粒徑的氧化鋁拋光粉的懸浮液中依次研磨5-10分鐘，每次研磨后需用乙醇和高純水超聲清洗5分鐘，待電極干燥后，浸入新制備的濃硫酸和30%雙氧水(體積比3:1)的混合溶液中保持30分鐘,然后用高純水清洗，作為工作電極浸入0.5M的H2SO4溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直到掃描曲線穩(wěn)定，最后用高純水清洗并用N2吹干。
[0038](2)將10 μ L的含有I μ M的探針DNA (pDNA)孵化緩沖液滴加到清潔后的金電極表面，將其在4°C下孵化24小時(shí)，通過自組裝形成pDNA修飾的金電極(pDNA/Au)。其中，pDNA孵化緩沖溶液的成分為:0.1M NaClUO μ M三(2-羧乙基)膦(TCEP)、pH = 7.4的1mM三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液(Tris-HCl)。pDNA為19個(gè)堿基的5’有巰基修飾的單鏈DNA，其序列為:
[0039]5，-SH- (CH2) 6-GATTCCGTGCATGACTCAG_3'。
[0040](3)進(jìn)一步地，將步驟(2)中的pDNA/Au浸入到6_巰基己_1_醇(MCH)的緩沖溶液中，保持2小時(shí)，用于減少pDNA在金電極表面的非特異性地吸附。其中，MCH緩沖溶液的成分為 5mM MCH 和 1mM Tris-HCl (pH = 7.4)。
[0041](4)進(jìn)一步地，將電極取出用1mM Tris-HCl (pH = 7.4)淋洗后，浸入到加有不同濃度汞離子的核苷酸外切酶III (Exo III)的消化緩沖液中，在37°C恒溫水浴中反應(yīng)10-30分鐘。最后將電極用1mM Tris-HCKpH = 7.4)淋洗后，浸入含有1mM Tris-HCl (pH =
7.0)和50 μ M氯化六氨合釕電解質(zhì)溶液中，利用方波伏安進(jìn)行測試并分析結(jié)果。其中，核苷酸外切酶III (Exo III)的消化緩沖液的成分為 50mM Tris-HCl (pH = 8), 5mM MgCl2, ImM 二硫蘇糖醇(DTT)，I μ M 目標(biāo) DNA(tDNA)，1.8units/ μ L Exo III 和 0.4M NaCl。tDNA 為 27堿基單鏈DNA，且與pDNA具有4個(gè)堿基T失配，其堿基序列為:
[0042]5’ -CTGTGTCTTGCTCGGTATCAAGCGAAA-3’ 。
【權(quán)利要求】
1.一種用于痕量汞離子檢測的酶基電化學(xué)生物傳感方法，其特征在于，步驟如下: (1)將10-20μ L的含有I μ M的探針DNA的孵化緩沖液滴加到清潔后的金電極表面，在4°C下孵化24小時(shí)，即得到pDNA修飾后的金電極；其中，pDNA的孵化緩沖液的成分為:0.1MNaClUOyM三(2-羧乙基)膦和pH= 7.4的1mM三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液； (2)將步驟⑴得到的pDNA/Au浸入到6-巰基己-1-醇緩沖溶液中，保持1-2小時(shí)，即得到處理后的pDNA/Au ;其中，MCH緩沖溶液的成分為l_5mM MCH和pH = 7.4的1mMTris-HCl ； (3)將經(jīng)過步驟(2)處理后的pDNA/Au用pH= 7.4的Tris-HCl淋洗，再浸入含有濃度不大于10 μ M汞離子的核苷酸外切酶III消化緩沖液中，在37-40°C恒溫水浴中反應(yīng)10-30分鐘，即得到消化后的pDNA/Au電極；其中，Exo III消化緩沖液的成分為pH = 8的50mMTris-HCl、5mM MgCl2、ImM二硫蘇糖醇、0.1-1 μ M tDNA、1.8units/μ L Exo III 和 0.2-0.6MNaCl ； (4)將步驟(3)得到的消化后的pDNA/Au電極浸入含有pH= 7.0的1mM Tris-HCl和50μΜ氯化六氨合釕的電解質(zhì)溶液中，利用方波伏安進(jìn)行測試并分析結(jié)果；測試參數(shù)為:初始電壓-0.6V，終止電壓0V，頻率25Hz。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶基電化學(xué)生物傳感方法，其特征在于，探針DNA為5’端巰基修飾的單鏈核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶基電化學(xué)生物傳感方法，其特征在于，與pDNA雜交的互補(bǔ)鏈tDNA是具有4個(gè)胸腺嘧啶失配的單鏈核苷酸，其堿基數(shù)比pDNA的堿基數(shù)至少多5個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶基電化學(xué)生物傳感方法，其特征在于，步驟(I)中金電極在使用前需要清潔，具體方法如下: 將金電極分別在ΙμπκΟ.3μηι和0.05 μ m粒徑的氧化招拋光粉的懸浮液中依次研磨5-10分鐘，每次研磨后分別用乙醇和高純水超聲清洗5分鐘，待電極干燥后，浸入體積比為3:1的濃硫酸和雙氧水的混合溶液中保持30分鐘,然后用高純水清洗,作為工作電極浸入0.5M的H2SO4溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直到掃描曲線穩(wěn)定，最后用高純水清洗并用N2吹干。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶基電化學(xué)生物傳感方法，其特征在于，步驟(I)中金電極在使用前需要清潔，具體方法如下: 將金電極分別在I μ m、0.3 μ m和0.05 μ m粒徑的氧化招拋光粉的懸浮液中依次研磨.5-10分鐘，每次研磨后分別用乙醇和高純水超聲清洗5分鐘，待電極干燥后，浸入體積比為.3:1的濃硫酸和雙氧水的混合溶液中保持30分鐘,然后用高純水清洗,作為工作電極浸入.0.5M的H2SO4溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直到掃描曲線穩(wěn)定，最后用高純水清洗并用N2吹干。
【文檔編號(hào)】G01N27/26GK104198557SQ201410445931
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】趙慧敏, 甘小榮, 全燮 申請人:大連理工大學(xué)