一種葡萄糖傳感器的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種葡萄糖傳感器的制備方法，所述傳感器以電極為基體，制備方法包括如下步驟：(1)先在電極表面附著由石墨烯和氧化石墨烯組成的復(fù)合材料；(2)經(jīng)步驟(1)處理后的電極再用葡萄糖氧化酶溶液浸泡。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單方便，葡萄糖氧化酶能夠很好地固定在電極表面，又能保持葡萄糖氧化酶的生物活性，該傳感器對(duì)葡萄糖的靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，可多次重復(fù)使用。
【專利說明】一種葡萄糖傳感器的制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于電化學(xué)傳感器領(lǐng)域，具體涉及一種葡萄糖傳感器的制備方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是一種常見的代謝紊亂性或內(nèi)分泌疾病。它可誘發(fā)腎、心血管、視網(wǎng)膜和神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生多種并發(fā)癥,其死亡率僅次于心血管、腫瘤，居第三位，被列為世界三大疾病之一。因此，快速、準(zhǔn)確、選擇性地測(cè)定血液中的葡萄糖濃度在醫(yī)學(xué)上具有極其重要的意義。1967年，Updike和Hick研制出第一支葡萄糖氧化酶電極,從此,能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定葡萄糖濃度的葡萄糖氧化酶(GOD)傳感器的研究一直都是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前為止，葡萄糖傳感器已經(jīng)發(fā)展到了第三代，主要特點(diǎn)就是GOD的氧化還原中心和電極表面直接進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，不需要介體的參與。但是，GOD的電活性中心深埋在分子內(nèi)部，且在電極表面吸附易變形，使GOD和電極之間難以直接進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，因此采用此方法制備電化學(xué)葡萄糖傳感器仍有一定的難度。
[0003]近年來，越來越多分析工作者利用納米材料修飾電極去實(shí)現(xiàn)葡萄糖氧化酶的直接電子轉(zhuǎn)移，如:碳納米管、納米金、石墨烯等。其中，由于石墨烯具有比表面積大(2600m2.g—1)、超薄的晶體厚度(0.335nm)、化學(xué)穩(wěn)定性好、導(dǎo)電性好(200?2000cm2.V-1.S-1)等優(yōu)勢(shì)備受科學(xué)界的關(guān)注。但是，結(jié)構(gòu)完整的石墨烯是由不含任何不穩(wěn)定鍵的苯六元環(huán)組合而成的二維晶體，表面呈惰性使其葡萄糖氧化酶很難固定在其表面，這給葡萄糖傳感器的制備和應(yīng)用造成了極大地困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種葡萄糖傳感器的制備方法及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案如下:
一種葡萄糖傳感器的制備方法，所述傳感器以電極為基體，制備方法包括如下步驟:
(1)、先在電極表面附著由石墨烯和氧化石墨烯組成的復(fù)合材料；
(2)、經(jīng)步驟(I)處理后的電極再用葡萄糖氧化酶溶液浸泡。
[0006]進(jìn)一步，步驟(I)所述石墨稀和氧化石墨稀的質(zhì)量比為(0.5?3):1。
[0007]進(jìn)一步，所述石墨稀和氧化石墨稀的質(zhì)量比為2.5:1。
[0008]進(jìn)一步，步驟(I)可通過如下過程實(shí)現(xiàn):將石墨烯和氧化石墨烯的混合分散液滴涂在電極表面，晚干。
[0009]石墨烯和氧化石墨烯的復(fù)合材料的附著量以正好覆蓋電極表面為佳，如0.5 mg/HiL的混合分散液滴涂3-8μ?即可。附著過多，使膜過厚，易造成脫落；附著太少不能完全覆蓋電極表面，會(huì)影響到葡萄糖氧化酶的吸附量。
[0010]進(jìn)一步，步驟⑵所述浸泡的溫度為3?5°C。浸泡時(shí)間可根據(jù)葡萄糖氧化酶溶液濃度確定，一般為18?24小時(shí)。
[0011]采用上述方法制備的葡萄糖傳感器可用于檢測(cè)葡萄糖。葡萄糖的線性濃度范圍為0.1 ?11 mmol/L,檢出限為 0.02 mmol /I,η
[0012]本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單方便，石墨烯-氧化石墨烯納米復(fù)合材料表面的羧基能夠共價(jià)結(jié)合葡萄糖氧化酶的氨基，使葡萄糖氧化酶能夠很好地固定在電極表面，而且該納米復(fù)合材料有很好的生物相容性，葡萄糖氧化酶保持其生物活性，該傳感器具有靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，可多次重復(fù)使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1所得石墨烯-氧化石墨烯納米復(fù)合材料的掃描電子顯微鏡圖片；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例1所得石墨烯-氧化石墨烯納米復(fù)合材料的透射電子顯微鏡圖片;
圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中除氧PBS中不同傳感器的循環(huán)伏安圖:a.GOD/GCE ；b.GOD/GO/GCE ；c.GOD/GR/GCE ； d.G0D/GR-G0/GCE ；
圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中不同pH值時(shí)，G0D/GR-G0/GCE的循環(huán)伏安圖(插圖為pH與電流關(guān)系)；
圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中pH與電位關(guān)系；
圖6是本發(fā)明實(shí)施例1中傳感器對(duì)葡萄糖濃度的測(cè)定。

【具體實(shí)施方式】
[0014]以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0015]實(shí)驗(yàn)過程中使用的水均為二次蒸餾水(簡(jiǎn)稱二次水)，實(shí)驗(yàn)所用的試劑均為分析純，本實(shí)施例所使用的儀器和試劑:CHI660B電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器公司)用于循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)；石英管加熱式自動(dòng)雙重純水蒸餾器(SZ-93，上海亞榮生化儀器廠)用于制備二次蒸餾水；電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)用于稱量藥品JSM-6701F掃描電子顯微鏡(日本)用于形貌表征；FEI_Tecnai G2 TF20透射電子顯微鏡(美國(guó))用于形貌表征；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);三氧化二鋁打磨粉(0.30 μπι,Ο.05 ym,上海辰華儀器試劑公司)用于處理玻碳電極；石墨烯(南京先豐納米材料技術(shù)有限公司)、石墨(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鉀(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)，高純氮?dú)?純度為99.999%，O2 ( 0.001%)。
[0016]實(shí)施例1
(I)氧化石墨烯的制備過程:將2g石墨粉末放入250mL的燒杯中，加入Ig NaN0jP46mL98 wt% H2SO4，在冰水浴中充分?jǐn)嚢琛＞徛尤?g高錳酸鉀于上述溶液中，保持整個(gè)體系的溫度為10°C以下攪拌5分鐘，繼而加熱到35°C，攪拌30分鐘。隨后加入92mL的二次水，力口熱至沸(溫度為98°C )下攪拌15分鐘，加入80mL的3wt%雙氧水(此時(shí)溶液應(yīng)該接近棕色，說明石墨被氧化)，然后將溶液在7200轉(zhuǎn)/分鐘下離心30分鐘。依次用5wt% HCl和二次水清洗離心所得的粉末直到上層懸浮液至中性。把上述清洗得到的粉末再次分散到水中并且超聲30分鐘(超聲剝離)。抽真空過濾完黑色殘留物后，濾液為一種均一的懸浮液(此懸浮液為氧化石墨烯在水中的分散液)。將上述得到的懸浮液在10000轉(zhuǎn)/分鐘下離心，得到黑色的固體即氧化石墨烯。
[0017](2)石墨烯-氧化石墨烯的混合分散液:取ImL濃度為lmg/mL的氧化石墨烯水分散液，緩慢加入石墨烯2.5 mg,然后加二次水稀釋至7 mL,超聲30 min,得到0.5 mg/mL的石墨烯-氧化石墨烯(GR-GO)的混合分散液(電鏡圖見附圖1、2)。
[0018](3)傳感器的制備:將玻碳電極(GCE)先用0.3 Mm的三氧化二鋁懸濁液在打磨布上處理，再用0.05Mm的三氧化二鋁懸濁液在打磨布上拋光成鏡面，最后用乙醇、二次水超聲清洗，用高純氮?dú)獯蹈?。然后?μ? 0.5 mg/mL的GR-GO混合分散液滴涂到打磨好的玻碳電極表面，空氣中自然干燥，再將該玻碳電極浸入到葡萄糖氧化酶(20mg/mL)的水溶液中，在3?5°C溫度下，浸泡18個(gè)小時(shí)；再用pH=7.0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液洗滌，在室溫下干燥，得到G0D/GR-G0/GCE傳感器。
[0019]分別制備對(duì)照傳感器:G0D/GCE，G0D/G0/GCE, GOD/GR/GCE (對(duì)照樣中的GR、GO滴涂量分別與上述的GR-GO總量一致，GOD的浸泡工藝參數(shù)完全一樣)。
[0020](4)傳感器的電化學(xué)表征:以制備的傳感器為工作電極，Ag/AgCl (飽和KCl)為參比電極，鉬柱電極為對(duì)電極，以除氧PBS溶液(pH=7.0)為緩沖溶液，采用循環(huán)伏安法(CV)考察葡萄糖氧化酶的直接電子傳遞(見圖3)，結(jié)果表明說明葡萄糖氧化酶的結(jié)構(gòu)得到了保持，沒有失活，實(shí)現(xiàn)了直接電化學(xué)。
[0021](5)緩沖溶液PBS的pH值的影響:以G0D/GR-G0/GCE傳感器為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl)為參比電極，鉬柱電極為對(duì)電極，以N2飽和的不同pH的PBS溶液為緩沖溶液，采用循環(huán)伏安法(CV)考察pH值對(duì)葡萄糖氧化酶的電流和電位影響(見圖4和圖5)。
[0022]由圖4及插圖可以看出隨著pH的變化電流不斷變化，pH7.0時(shí)電流最大，所以該實(shí)驗(yàn)的最佳PH值為7.0。由圖5可以得出，隨著pH的增加，氧化還原電位負(fù)移，說明有質(zhì)子直接參與該氧化還原反應(yīng)，且Epa(V) = - 0.0285 - 0.0515 pH (R = 0.997)、Epc(V)=-
0.0884-0.0496 pH (R = 0.999)，由直線斜率可知該反應(yīng)為兩電子兩質(zhì)子過程，推出反應(yīng)方程式如下:
GOD - FAD+ 2e' + 2H+^ GOD - FADH2
(6)葡萄糖的測(cè)定:以制備的G0D/GR-G0/GCE傳感器為工作電極，Ag/AgCl (飽和KCl)為參比電極，鉬柱電極為對(duì)電極，以氧氣飽和的PBS溶液(pH=7.0)為緩沖溶液液，對(duì)加入不同濃度的葡萄糖進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，考察葡萄糖濃度與響應(yīng)電流的關(guān)系(見圖6)。同時(shí)按照相關(guān)靈敏度的測(cè)定原則，測(cè)定其檢出限。
[0023]葡萄糖的濃度變動(dòng)范圍為0.1?11 mmol/L,所得線性方程為Ipc=22.1586-0.9506c ( μ A, mmol/L, R = 0.996)，檢出限為 0.02 mmol/L。
[0024](7)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):采相同方法及條件下分別得到五根G0D/GR-G0/GCE傳感器，且對(duì)5mmol/L的葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)，得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.56%，意味著該傳感器具有很好的再現(xiàn)性。用同一根電極對(duì)lmmol/L的葡萄糖連續(xù)六次檢測(cè)，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.17%，意味著該傳感器具有很好的重復(fù)性。最后，將傳感器在4°C下存放一周，得到電流響應(yīng)為原始相應(yīng)的95%,意味著該傳感器有很好的穩(wěn)定性。
[0025]PBS 緩沖液為 KH2PO4-K2HPO4 溶液。
[0026]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種葡萄糖傳感器的制備方法，所述傳感器以電極為基體，制備方法包括如下步驟: (1)、先在電極表面附著由石墨烯和氧化石墨烯組成的復(fù)合材料； (2)、經(jīng)步驟(I)處理后的電極再用葡萄糖氧化酶溶液浸泡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述石墨烯和氧化石墨烯的質(zhì)量比為(0.5?3):1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的葡萄糖傳感器的制備方法，其特征在于，所述石墨烯和氧化石墨稀的質(zhì)量比為2.5:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(I)通過如下過程實(shí)現(xiàn):將石墨烯和氧化石墨烯的混合分散液滴涂在電極表面，晾干。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述浸泡的溫度為3?5V。
6.采用權(quán)利要求1所述方法制備的葡萄糖傳感器用于檢測(cè)葡萄糖。
【文檔編號(hào)】G01N27/327GK104237351SQ201410462980
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】周喜斌, 何志芳, 連茜雯, 羅愛, 顏凱旺, 張東霞, 盧小泉 申請(qǐng)人:西北師范大學(xué)