基于熒光金納米團(tuán)簇的脲酶抑制劑測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基于熒光金納米團(tuán)簇的脲酶抑制劑測(cè)定方法，其特征是利用脲酶特異性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高體系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇的熒光發(fā)生猝滅，而脲酶抑制劑可以阻止脲酶催化尿素分解這一過程，抑制熒光猝滅，從而用于脲酶抑制劑的檢測(cè)。測(cè)定F65。值，計(jì)算抑制率，通過軟件擬合得到巰基乙胺和對(duì)苯醌的IC5。分別為2.8ymol/L和11.9ymol/L。本發(fā)明可應(yīng)用于脲酶抑制劑的高通量篩選。
【專利說明】基于熒光金納米團(tuán)簇的脲酶抑制劑測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇為熒光探針的脲酶抑制劑 的測(cè)定方法，屬于分析化學(xué)及納米【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 脲酶（urease)是一種含鎳的寡聚酶，它能高效、特異性催化尿素水解生成二氧化 碳和氨。醫(yī)學(xué)上，細(xì)菌脲酶是一種不容忽視的致病因素，它可誘發(fā)許多疾病，如腎盂腎炎、肝 昏迷、消化性潰瘍和感染性尿路結(jié)石等。脲酶抑制劑作為一種藥物可溶解尿結(jié)石，阻止尿液 生成新的晶體。農(nóng)業(yè)上，當(dāng)土壤脲酶的活性過高時(shí)，化肥中的尿素被迅速分解生成氨，排放 到大氣中，造成經(jīng)濟(jì)損失及環(huán)境污染。為了提高化肥中尿素氮的利用率，脲酶抑制劑的使用 是一個(gè)極佳的選擇。因此，脲酶抑制劑的篩選對(duì)醫(yī)學(xué)及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 近年來，熒光金屬納米團(tuán)簇作為一種新型的熒光納米材料備受關(guān)注。金屬納米團(tuán) 簇是指在一定的分子層(如硫醇）保護(hù)作用下，由幾個(gè)到幾百個(gè)金屬原子構(gòu)成的分子級(jí)聚集 體，其直徑一般小于2 nm，接近于電子的費(fèi)米波長(約0.7 nm)。由于其獨(dú)特的物理、電學(xué)和 光學(xué)性質(zhì)，金屬納米團(tuán)簇在單分子光電、催化、生物成像和傳感器等領(lǐng)域顯示出廣泛的應(yīng)用 前景。在所有的金屬納米團(tuán)簇材料中，金納米團(tuán)簇（gold nanoclusters，AuNCs)因其具有 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前研究最多的一種金屬納米團(tuán)簇材料。
[0004] 本發(fā)明以N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇作為熒光探針，提供了一種簡(jiǎn) 便、靈敏的脲酶抑制劑檢測(cè)的新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種以N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇為熒光探針 的脲酶抑制劑的測(cè)定方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 本發(fā)明所述的基于熒光金納米團(tuán)簇的脲酶抑制劑測(cè)定方法，其特征是利用脲酶特 異性催化尿素生成氨和二氧化碳的體系，新生成的氨能提高所述體系的pH值，使N-乙 酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇的熒光發(fā)生猝滅，而脲酶抑制劑能阻止脲酶催化尿素分 解這一過程，抑制熒光猝滅，從而用于脲酶抑制劑的檢測(cè)。
[0007] 所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還 原氯金酸的方法制備：將濃度為〇. 02~0. 18 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和濃度為 0. 1~0. 8 mol/L的氫氧化鈉溶液加入到濃度為0. 01~0. 1 g/L的氯金酸溶液中，混勻，置于 2(T70° C水浴恒溫反應(yīng)(Γ3. 5小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對(duì)反應(yīng)液 進(jìn)行透析純化處理，得到Ν-乙酰-L-半胱氨酸-金納米團(tuán)簇?zé)晒獠牧纤芤骸?br> [0008] 所使用的Ν-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇采用Ν-乙酰-L-半胱氨酸還原 氯金酸的方法制備：將0.6 mL濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0.4 mL濃度為0.02 g/ L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0. 08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置 于37° C恒溫水浴槽中反應(yīng)2.5 h，反應(yīng)液由淺黃色變?yōu)闊o色，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為 3500的透析袋對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行純化處理，純化后的金納米團(tuán)簇溶液放置于4° C冰箱避光保 存。
[0009] 利用N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇在650 nm處的發(fā)射光強(qiáng)度值（F65Q) 以判斷脲酶抑制劑對(duì)脲酶活性的抑制作用，所使用的激發(fā)波長為355 nm。
[0010] 將〇. 05 mL濃度為1. 5 U/mL、pH=6. 0的脲酶溶液加入到0. 2 mL含有不同濃度脲 酶抑制劑的1 mol/L、pH=6. 0的尿素溶液中，混合均勻后在25 ° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40 min，將0. 2 mL的N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇溶液加入到上述反應(yīng)液中，在25 ° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)3 min，測(cè)定發(fā)射光強(qiáng)度值^5(|值，計(jì)算抑制率，通過軟件擬合得到 脲酶抑制劑的IC5Q。
[0011] 將〇. 05 mL濃度為1. 5 U/mL、pH=6. 0的脲酶溶液加入到0. 2 mL含有不同濃度巰基 乙胺的1 mol/L、pH=6.0尿素溶液中，混合均勻后在25 ° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40 min，將 0. 2 mL的N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇溶液加入到上述反應(yīng)液中，再在25 ° C 的恒溫水浴槽中反應(yīng)3 min，測(cè)定發(fā)射光強(qiáng)度值^5(|值，計(jì)算抑制率，通過軟件擬合得到巰基 乙胺的 IC5Q 為 2.8 ymol/L。
[0012] 將0. 05 mL濃度為1. 5 U/mL、pH=6. 0的脲酶溶液加入到0. 2 mL含有不同濃度對(duì)苯 醌的1 mol/L、pH=6. 0的尿素溶液中，混合均勻后在25 ° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40 min， 將0.2 mL的N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇溶液加入到上述反應(yīng)液中，在25 ° C 的恒溫水浴槽中反應(yīng)3 min，測(cè)定發(fā)射光強(qiáng)度值^5(|值，計(jì)算抑制率，通過軟件擬合得到對(duì)苯 醌的 IC5Q 為 11.9 ymol/L。
[0013] 所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原 氯金酸的方法制備：將0.6 mL濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0.4 mL濃度為0.02 g/ L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0. 08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置 于37° C恒溫水浴槽中反應(yīng)2.5 h，反應(yīng)液由淺黃色變?yōu)闊o色，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為 3500的透析袋對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行純化處理，純化后的金納米團(tuán)簇溶液放置于4° C冰箱避光保 存。
[0014] 具體地說，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： (一）金納米團(tuán)簇?zé)晒獠牧系闹苽?以下過程中使用的所有玻璃器皿均經(jīng)過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。金納米 團(tuán)簇?zé)晒獠牧系闹苽浞椒ㄈ缦拢簩?. 6 mL濃度為0. 5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0. 4 mL濃 度為0. 02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0. 08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液 中，混勻，置于37° C恒溫水浴槽中反應(yīng)2. 5小時(shí)，反應(yīng)液由淺黃色變?yōu)闊o色。反應(yīng)結(jié)束后 用分子量為3500的透析袋對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行純化處理，純化后的金納米團(tuán)簇溶液放置于4° C 冰箱避光保存。
[0015] (二）脲酶抑制劑的測(cè)定 脲酶活性的測(cè)定分兩步進(jìn)行：（1)將0. 05 mL濃度為1. 5 U/mL的脲酶溶液（pH=6. 0)加 入到0. 2 mL (pH=6. 0)濃度為1 mol/L的尿素溶液(含不同濃度抑制劑）中，混合均勻后在 25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40 min。（2)將0.2 mL的金納米團(tuán)簇溶液加入到上述反應(yīng)液 中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)3 min，結(jié)束后取出測(cè)定^5(|值。通過軟件擬合，得到各 個(gè)抑制劑的IC5(I值，即酶活性被抑制一半時(shí)抑制劑的濃度。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： (1)本發(fā)明基于脲酶特異性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高體系的pH 值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇的熒光發(fā)生猝滅，而脲酶抑制劑可以阻止脲 酶催化尿素分解這一過程，抑制熒光猝滅，從而可用于脲酶抑制劑的檢測(cè)。
[0017] (2)本發(fā)明所使用的金納米團(tuán)簇直接由N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸得到，無 需進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，制備過程簡(jiǎn)單快速。
[0018] (3)本發(fā)明可用于脲酶抑制劑的高通量篩選。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為紫外燈下的外觀圖：圖中：（A)實(shí)驗(yàn)組：金納米團(tuán)簇溶液+脲酶+尿素+巰 基乙胺；（B)實(shí)驗(yàn)組：金納米團(tuán)簇溶液+脲酶+尿素+對(duì)苯醌；（C)對(duì)照組：金納米團(tuán)簇溶液 +脲酶+尿素。
[0020] 圖2為熒光發(fā)射光譜圖：圖中：（A)金納米團(tuán)簇溶液+脲酶+尿素+巰基乙胺；（B) 金納米團(tuán)簇溶液+脲酶+尿素+對(duì)苯醌；（C)金納米團(tuán)簇溶液+脲酶+尿素。
[0021] 圖3為疏基乙胺抑制率曲線圖。
[0022] 圖4為對(duì)苯醌抑制率曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下述實(shí)例所用的脲酶抑制劑優(yōu)選巰基乙胺或?qū)Ρ锦?，而?duì)于其它種類的脲酶抑制 齊U，本發(fā)明的測(cè)試方法具有同樣的效果。
[0024] 實(shí)例 1 : 將0. 6 mL濃度為0. 5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0. 4 mL濃度為0. 02 g/L的氯金酸溶 液加入到4 mL濃度為0. 08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置于37° C恒溫 水浴槽中反應(yīng)2.5 h。反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行純化處理。 所得到的金納米團(tuán)簇溶液可見光下為無色，紫外燈照射下產(chǎn)生強(qiáng)烈的紅色熒光。4° C暗處 保存，能保持至少一個(gè)月的相對(duì)穩(wěn)定。
[0025] 實(shí)例 2 : 將0. 05 mL濃度為1. 5 U/mL的脲酶溶液（pH=6. 0)加入到0. 2 mL分別含有巰基乙胺 (8 μ mol/L)或?qū)Ρ锦?0 μ mol/L)的濃度為1 mol/L的尿素溶液（ρΗ=6·0)中，混合均 勻后在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40 min。（2)將0. 2 mL的實(shí)例1所制得的溶液加入到 上述反應(yīng)液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)3 min。設(shè)置一組無脲酶抑制劑的空白對(duì)照 組。反應(yīng)結(jié)束后，在紫外燈下觀察，加入8 ymol/L巰基乙胺（圖1中的A)或50 ymol/L 的對(duì)苯醌（圖1中的B)后，金納米團(tuán)簇有紅色熒光，而對(duì)照組紅色熒光發(fā)生猝滅（圖1中的 C)。圖2為相應(yīng)的熒光發(fā)射光譜圖。
[0026] 實(shí)例 3 : 將0. 05 mL濃度為1. 5 U/mL的脲酶溶液（pH=6. 0)加入到0. 2 mL含有不同濃度巰基 乙胺的濃度為1 mol/L的尿素溶液（pH=6. 0)中，混合均勻后在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng) 40 min。將0. 2 mL的實(shí)例1所制得的溶液加入到上述反應(yīng)液中，在25° C的恒溫水浴槽中 反應(yīng)3 min，測(cè)定發(fā)射光強(qiáng)度值^5(|值，計(jì)算抑制率。結(jié)果如圖3所示，通過軟件擬合得到巰 基乙胺的IC5Q為2.8 ymol/L。
[0027]實(shí)例 4 : 將0. 05 mL濃度為1. 5 U/mL的脲酶溶液（pH=6. 0)加入到0. 2 mL含有不同濃度對(duì)苯 醌的濃度為1 mol/L的尿素溶液（pH=6. 0)中，混合均勻后在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40 min。將0. 2 mL的實(shí)例1所制得的溶液加入到上述反應(yīng)液中，在25° C的恒溫水浴槽中反 應(yīng)3 min，測(cè)定發(fā)射光強(qiáng)度值^5(|值，計(jì)算抑制率。結(jié)果如圖4所示，通過軟件擬合得到對(duì)苯 醌的 IC5Q 為 11. 9 μ mol/L。
【權(quán)利要求】
1. 一種基于熒光金納米團(tuán)簇的脲酶抑制劑測(cè)定方法，其特征是利用脲酶特異性催化 尿素生成氨和二氧化碳的體系，新生成的氨能提高所述體系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨 酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇的熒光發(fā)生猝滅，而脲酶抑制劑能阻止脲酶催化尿素分解這一過程， 抑制熒光猝滅，從而用于脲酶抑制劑的檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光金納米團(tuán)簇的脲酶抑制劑測(cè)定方法，其特征是所使 用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法 制備：將濃度為0.02、· 18 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和濃度為0· f〇.8 mol/L的 氫氧化鈉溶液加入到濃度為〇. 〇l~〇. 1 g/L的氯金酸溶液中，混勻，置于2(T70° C水浴恒溫 反應(yīng)(Γ3. 5小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行透析純化處理， 得到Ν-乙酰-L-半胱氨酸-金納米團(tuán)簇?zé)晒獠牧纤芤骸?br> 3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光金納米團(tuán)簇的脲酶抑制劑測(cè)定方法，其特征是所使 用的Ν-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇采用Ν-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法 制備：將0. 6 mL濃度為0. 5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0. 4 mL濃度為0. 02 g/L的氯金酸溶 液加入到4 mL濃度為0. 08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置于37 ° C恒溫 水浴槽中反應(yīng)2. 5 h，反應(yīng)液由淺黃色變?yōu)闊o色，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析 袋對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行純化處理，純化后的金納米團(tuán)簇溶液放置于4° C冰箱避光保存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基于熒光金納米團(tuán)簇的脲酶抑制劑測(cè)定方法，其特征是 利用N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇在650 nm處的發(fā)射光強(qiáng)度值（F65CI)以判斷脲 酶抑制劑對(duì)脲酶活性的抑制作用，所使用的激發(fā)波長為355 nm。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基于熒光金納米團(tuán)簇的脲酶抑制劑測(cè)定方法，其特征是 將0. 05 mL濃度為1. 5 U/mL、pH=6. 0的脲酶溶液加入到0. 2 mL含有不同濃度脲酶抑制劑 的1 mol/L、pH=6. 0的尿素溶液中，混合均勻后在25 ° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40 min，將 0. 2 mL的N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇溶液加入到上述反應(yīng)液中，在25 ° C的 恒溫水浴槽中反應(yīng)3 min，測(cè)定發(fā)射光強(qiáng)度值^5(|值，計(jì)算抑制率，通過軟件擬合得到脲酶抑 制劑的IC5Q。
6. -種基于熒光金納米團(tuán)簇的脲酶抑制劑測(cè)定方法，其特征是將0.05 mL濃度為1.5 U/mL、pH=6. 0的脲酶溶液加入到0. 2 mL含有不同濃度巰基乙胺的1 mol/L、pH=6. 0尿素溶 液中，混合均勻后在25 ° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40 min，將0. 2 mL的N-乙酰-L-半胱氨 酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇溶液加入到上述反應(yīng)液中，再在25 ° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)3 min， 測(cè)定發(fā)射光強(qiáng)度值F65(l值，計(jì)算抑制率，通過軟件擬合得到巰基乙胺的IC5(I為2. 8 μ mol/L。
7. -種基于熒光金納米團(tuán)簇的脲酶抑制劑測(cè)定方法，其特征是將0.05 mL濃度為1.5 U/mL、pH=6. 0的脲酶溶液加入到0. 2 mL含有不同濃度對(duì)苯醌的1 mol/L、pH=6. 0的尿素溶 液中，混合均勻后在25 ° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40 min，將0. 2 mL的N-乙酰-L-半胱氨 酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇溶液加入到上述反應(yīng)液中，在25 ° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)3 min，測(cè) 定發(fā)射光強(qiáng)度值F65(l值，計(jì)算抑制率，通過軟件擬合得到對(duì)苯醌的IC5(I為11. 9 μ mol/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的基于熒光金納米團(tuán)簇的脲酶抑制劑測(cè)定方法，其特征是 所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的 方法制備：將〇. 6 mL濃度為0. 5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0. 4 mL濃度為0. 02 g/L的氯金 酸溶液加入到4 mL濃度為0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置于37° C
【文檔編號(hào)】G01N33/573GK104215760SQ201410464413
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月13日
【發(fā)明者】陳偉, 鄧豪華, 林小青, 王艷紅, 沈奕珉 申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)