以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，其特征是利用脲酶特異性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高體系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇的熒光發(fā)生猝滅，從而表現(xiàn)出熒光發(fā)射光譜特征的變化，可以直接用于尿素的含量測定。在0.055~0.55mmol/L范圍內(nèi)F650與尿素濃度呈線性關(guān)系，檢測限為0.055mmol/L。本發(fā)明選擇性高，重現(xiàn)性好，能夠作為分析方法應(yīng)用于環(huán)境及生命科學體系中尿素的高靈敏測定。
【專利說明】以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇為熒光探針的尿素測定方法，屬于分析化學及納米【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]尿素是人體蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，由肝臟產(chǎn)生，經(jīng)血液運輸至腎臟以尿液形式排出。尿素的生成量取決于蛋白質(zhì)的攝入量、組織蛋白質(zhì)的分解代謝以及肝功能狀況。尿素是臨床及生物化學一個重要的目標分析物，它是評價尿毒癥毒素水平、腎臟及肝臟細胞功能的重要標志。目前，尿素的測定方法包括:氨電極法、脲酶-波氏法，脲酶-谷氨酸脫氫酶偶聯(lián)法，脲酶-亮氨酸脫氫酶偶聯(lián)法等。
[0003]近年來，熒光金屬納米團簇作為一種新型的熒光納米材料備受關(guān)注。金屬納米團簇是指在一定的分子層保護作用下，由幾個到幾百個金屬原子構(gòu)成的分子級聚集體，其直徑一般小于2 nm，接近于電子的費米波長(約0.7 nm)。由于其獨特的物理、電學和光學性質(zhì)，金屬納米團簇在單分子光電、催化、生物成像和傳感器等領(lǐng)域顯示出廣泛的應(yīng)用前景。在所有的金屬納米團簇材料中，金納米團簇(gold nanoclusters, AuNCs)因其具有化學性質(zhì)穩(wěn)定和生物相容性好等優(yōu)點，是目前研究最多的一種金屬納米團簇材料。與小分子熒光染料和熒光蛋白相比，AuNCs用作熒光探針具有水溶性好、比表面積大、表面易于修飾、抗光漂白能力強以及熒光性質(zhì)可調(diào)等優(yōu)點。因此，金納米團簇有望彌補一些有毒小分子熒光染料的不足，甚至可以取代某些光穩(wěn)定性差的傳統(tǒng)熒光探針。
[0004]本發(fā)明以N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇為熒光探針，建立了一種尿素測定的新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種以N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇為熒光探針的尿素測定方法。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
本發(fā)明所述的以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，其特征是利用脲酶特異性催化尿素生成氨和二氧化碳的體系，新生成的氨能提高所述體系的PH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇的熒光發(fā)生猝滅，從而表現(xiàn)出熒光發(fā)射光譜特征的變化，能直接用于尿素的含量測定。
[0007]所述金納米團簇溶液，脲酶溶液和尿素測定液按體積比為4:4:1混合，25° C反應(yīng)40分鐘測定發(fā)射光強度值F65tl以判斷尿素的濃度。
[0008]所使用的脲酶濃度為10 U/mL。
[0009]所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法制備:將濃度為0.02、.18 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和濃度為0.Γ0.8 mol/L的氫氧化鈉溶液加入到濃度為0.θΓθ.1 g/L的氯金酸溶液中，混勻，置于2(T70° C水浴恒溫反應(yīng)(Γ3.5小時，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進行透析純化處理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金納米團簇熒光材料水溶液。
[0010]所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法制備:將0.6 mL濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0.4 mL濃度為0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置于37° C恒溫水浴槽中反應(yīng)2.5 h，反應(yīng)液由淺黃色變?yōu)闊o色，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進行純化處理得到N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇溶液。
[0011]利用N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇在650 nm處的發(fā)射光強度值(F65tl)以判斷尿素含量，所使用的激發(fā)波長為355 nm。
[0012]將金納米團簇溶液和脲酶溶液混合均勻后，將不同濃度尿素溶液加入到上述混合液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)后，測定發(fā)射光強度值F65tl，在尿素濃度為0.055?0.55mmol/L的范圍內(nèi)F65tl與尿素濃度呈線性關(guān)系，檢測限為0.055mmol/L。
[0013]本發(fā)明所述的以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，包括如下步驟:取新鮮人尿液，用pH=6.0的緩沖液稀釋，取0.05 mL稀釋液加入到由0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇溶液和0.2 mL、濃度為10 U/mL的脲酶溶液組成的混合液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40分鐘，測定發(fā)射光強度值F65tl,通過標準曲線進行定量，獲得尿液中的尿素含量。
[0014]所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法制備:將0.6 mL濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0.4 mL濃度為0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置于37° C恒溫水浴槽中反應(yīng)2.5 h，反應(yīng)液由淺黃色變?yōu)闊o色，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進行純化處理，純化后的金納米團簇溶液放置于4° C冰箱避光保存。
[0015]所述的新鮮人尿液為用pH=6.0的醋酸鹽緩沖液稀釋200倍后選取的0.05 mL稀釋液。
[0016]具體地說，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
(一)金納米團簇熒光材料的制備
以下過程中使用的所有玻璃器皿均經(jīng)過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。金納米團簇熒光材料的制備方法如下:將0.6 mL濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0.4 mL濃度為0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置于37° C恒溫水浴槽中反應(yīng)2.5小時，反應(yīng)液由淺黃色變?yōu)闊o色。反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進行純化處理，純化后的金納米團簇溶液放置于4° C冰箱避光保存。
[0017](二)尿素的測定:
0.2毫升步驟(一)制備的金納米團簇溶液與0.2毫升濃度為10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均勻后，將0.05毫升(pH=6.0)的樣品溶液加入到上述混合液中，在25 ° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，以355 nm為激發(fā)波長，測定在650 nm處的發(fā)射光強度值(F65tl),通過標準曲線進行尿素的測定。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點: (I)本發(fā)明基于脲酶特異性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高體系的PH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇的熒光發(fā)生猝滅，從而表現(xiàn)出熒光發(fā)射光譜特征的變化，可以直接用于尿素的含量檢測。
[0019](2)本發(fā)明所使用的金納米團簇直接由N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸得到，無需進行進一步的修飾，制備過程簡單快速。
[0020](3)本發(fā)明對樣品的處理要求低，抗干擾性好，尿液僅需適當稀釋即可進行測定。
[0021](4)本發(fā)明的檢測靈敏度高，熒光分光光度計測定的檢測限為0.055 mmol/L。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為金納米團簇溶液在紫外燈下的外觀圖。圖中:(A)空白對照組；(B)尿素組(尿素濃度為0.88 mmol/L)。
[0023]圖2為金納米團簇溶液的發(fā)射光譜圖。圖中:(A)空白對照組；(B)尿素組(尿素濃度為 0.88 mmol/L)。
[0024]圖3為在金納米團簇溶液中加入脲酶和尿素后，熒光發(fā)射光強度隨時間的變化圖。
[0025]圖4為金納米團簇溶液與脲酶催化反應(yīng)液(不同濃度尿素)孵育后的熒光發(fā)射光譜圖。
[0026]圖5為金納米團簇溶液的發(fā)射光強度值(F65tl)與尿素濃度之間的關(guān)系圖。
[0027]圖6為金納米團簇溶液的發(fā)射光強度值(F65tl)與尿素濃度之間的線性關(guān)系圖。
[0028]圖7為金納米團簇溶液與不同有機物作用后的發(fā)射光強度(F65tl)圖。(黑柱:有機物+脲酶+金簇；白柱:有機物+脲酶+尿素(0.55 mM) +金簇)
圖8為金納米團簇溶液與不同陽離子作用后的發(fā)射光強度(F65tl)圖。(黑柱:陽離子+脲酶+金簇；白柱:陽離子+脲酶+尿素(0.55 mM) +金簇)
圖9為金納米團簇溶液與不同陰離子作用后的發(fā)射光強度(F65tl)圖。(黑柱:陰離子+脲酶+金簇；白柱:陰離子+脲酶+尿素(0.55 mM) +金簇)。

【具體實施方式】
[0029]實例1:
金納米團簇熒光材料的制備過程如下:將0.6 mL濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0.4 mL濃度為0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置于37° C恒溫水浴槽中反應(yīng)2.5 h。反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進行純化處理。所得到的金納米團簇溶液可見光下為無色，紫外燈照射下產(chǎn)生強烈的紅色熒光。4° C暗處保存，能保持至少一個月的相對穩(wěn)定。
[0030]實例2:
0.2毫升實例I所制得的金納米團簇溶液與0.2毫升濃度為10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均勻后，將0.05毫升(pH=6.0)尿素溶液(0.88 mmol/L)加入到上述混合液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40分鐘。設(shè)置一組無尿素的空白對照。反應(yīng)結(jié)束后，在紫外燈下觀察，空白對照組顯現(xiàn)紅色熒光(圖1中的A)，而尿素組的金納米團簇的紅色熒光發(fā)生猝滅(圖1中的B)。圖2為空白對照組和尿素組金納米團簇溶液的熒光發(fā)射光譜圖。
[0031]實例3:
0.2毫升實例I所制得的金納米團簇溶液與0.2毫升濃度為10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均勻后，將0.05毫升(pH=6.0)含有不同濃度尿素的溶液加入到上述混合液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)(Γ50分鐘。結(jié)果表明，金納米團簇的熒光在40分鐘后趨于穩(wěn)定(見圖3)。
[0032]實例4:
0.2毫升實例I所制得的金納米團簇溶液與0.2毫升濃度為10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均勻后，將0.05毫升(pH=6.0)含有不同濃度尿素的溶液加入到上述混合液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40分鐘。由圖可知，隨著尿素濃度的逐漸增大，金納米團簇的發(fā)射光譜逐漸受到抑制(見圖4)，發(fā)射光強度值F65tl逐漸減小(見圖5)。如圖6所示，在尿素濃度為0.055、.55 mmol/L的范圍內(nèi)發(fā)射光強度值F65tl與尿素濃度呈線性關(guān)系，檢測限為 0.05Smmol /I,η
[0033]實例5:
0.2毫升實例I所制得的金納米團簇溶液與0.2毫升濃度為10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均勻后，將0.05毫升(pH=6.0)濃度為0.22 mmol/L尿素的溶液加入到上述混合液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40分鐘，測定發(fā)射光強度值F65tlt5重復上述實驗12次，得相對標準偏差(RSD)為3.6%，表明本方法重現(xiàn)性良好。
[0034]實例I:
0.2毫升實例I所制得的金納米團簇溶液與0.2毫升濃度為10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均勻后，將0.05毫升(pH=6.0)濃度為0.1 mmol/L的不同有機物溶液加入到上述混合液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40分鐘，測定發(fā)射光強度值F65tlt5如圖7所示，(Γ20依次為空白、谷胱甘肽、抗壞血酸、牛血清蛋白、ATP、尿酸、葡萄糖、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-絲氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-蘇氨酸、L-乳糖、麥芽糖，結(jié)果表明本方法抗有機物干擾能力強。
[0035]實例8:
0.2毫升實例I所制得的金納米團簇溶液與0.2毫升濃度為10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均勻后，將0.05毫升(pH=6.0)濃度為0.01 mmol/L的不同陽離子加入到上述混合液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40分鐘，測定發(fā)射光強度值F65tlt5如圖8所示，0?19 依次為空白，Ni2+、Mg2+、Fe3+、Cd2+、Mn2+、NH:、Cu2+、Ag+、Fe2+、Al3+、Pb2+、Zn2+、Ba2+、Co2+、Hg+、Cr3+、Ca2+、Na+、K+,結(jié)果表明本方法抗陽離子干擾能力強。
[0036]實例9:
0.2毫升實例I所制得的金納米團簇溶液與0.2毫升濃度為10 U/mL的脲酶溶液(pH=6.0)混合均勻后，將0.05毫升(pH=6.0)濃度為0.01 mmol/L的不同陰離子加入到上述混合液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40分鐘，測定發(fā)射光強度值F65tlt5如圖8所示，0?18 依次為空白、S2O32' NO2' SO32' F' SCN' S2' H2PO4' Br072\ 13' Br03\ SO42' NO3' S2O82'C104_、Γ、Br'CO廣、Ac_，結(jié)果表明本方法抗陰離子干擾能力強。
[0037]實例10:
取新鮮人尿液，用pH=6.0的醋酸鹽緩沖液稀釋200倍，取0.05 mL稀釋液加入到由實例I所制得的0.2 mL金納米團簇溶液和0.2 mL脲酶溶液(濃度為10 U/mL)組成的混合液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40分鐘，測定發(fā)射光強度值F65tlt5通過標準曲線進行定量，獲得尿樣中的尿素含量。與標準方法測定結(jié)果進行比較，結(jié)果表明本發(fā)明所使用的方法與標準方法無顯著性差異(表1)。
[0038]表 I

【權(quán)利要求】
1.一種以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，其特征是利用脲酶特異性催化尿素生成氨和二氧化碳的體系，新生成的氨能提高所述體系的PH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇的熒光發(fā)生猝滅，從而表現(xiàn)出熒光發(fā)射光譜特征的變化，能直接用于尿素的含量測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，其特征是所述金納米團簇溶液，脲酶溶液和尿素測定液按體積比為4:4:1混合，25° C反應(yīng)40分鐘測定發(fā)射光強度值F65tl以判斷尿素的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，其特征是所使用的脲酶濃度為10 U/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法制備:將濃度為0.02、.18 mo I/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和濃度為0.Γθ.8 mo I/L的氫氧化鈉溶液加入到濃度為0.0f0.1 g/L的氯金酸溶液中，混勻，置于2(T70° C水浴恒溫反應(yīng)(Γ3.5小時，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進行透析純化處理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金納米團簇熒光材料水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法制備:將0.6 mL濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0.4 mL濃度為0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置于37° C恒溫水浴槽中反應(yīng)2.5 h，反應(yīng)液由淺黃色變?yōu)闊o色，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進行純化處理得到N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，其特征是利用N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇在650 nm處的發(fā)射光強度值(F65tl)以判斷尿素含量，所使用的激發(fā)波長為355 nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，其特征是將金納米團簇溶液和脲酶溶液混合均勻后，將不同濃度尿素溶液加入到上述混合液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)后，測定發(fā)射光強度值F65tl，在尿素濃度為0.055、.55mmol/L的范圍內(nèi)F65tl與尿素濃度呈線性關(guān)系，檢測限為0.055mmol/Lo
8.一種以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，包括如下步驟:取新鮮人尿液，用pH=6.0的緩沖液稀釋，取0.05 mL稀釋液加入到由0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇溶液和0.2 mL、濃度為10 U/mL的脲酶溶液組成的混合液中，在25° C的恒溫水浴槽中反應(yīng)40分鐘，測定發(fā)射光強度值F65tl，通過標準曲線進行定量，獲得尿液中的尿素含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護的金納米團簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法制備:將0.6 mL濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液與0.4 mL濃度為0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置于37° C恒溫水浴槽中反應(yīng)2.5 h，反應(yīng)液由淺黃色變?yōu)闊o色，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進行純化處理，純化后的金納米團簇溶液放置于4° C冰箱避光保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的以熒光金納米團簇為探針的尿素測定方法，其特征是所述的新鮮人尿液為用pH=6.0的醋酸鹽緩沖液稀釋200倍后選取的0.05 mL稀釋液。
【文檔編號】G01N21/64GK104198454SQ201410468937
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月13日
【發(fā)明者】陳偉, 鄧豪華, 林逢林, 何少斌, 彭花萍 申請人:福建醫(yī)科大學