一種基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，步驟如下：(1)用聚苯乙烯/聚乙二醇的甲苯溶液為母液，將核酸適配體、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉與母液混合，水浴20～40分鐘，得成膜液；(2)將制得的成膜液于相對濕度為50％～80％的條件下，在固體基底上制備蜂窩狀多孔薄膜；(3)將蜂窩狀多孔薄膜從固體基底上剝離并置于熒光標(biāo)記配對鏈溶液中，于3～5℃恒溫條件下振蕩孵化反應(yīng)60～80分鐘，然后用水沖洗3～5次，用氮氣吹干，即得。本發(fā)明基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法操作簡單，成本低廉，尺度可控，解決了常規(guī)方法一般需要較昂貴的儀器設(shè)備、特殊的掩膜或印章材料的問題。
【專利說明】—種基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]自1994年Frangois等通過呼吸圖案法(又稱水滴模板法)成功制備蜂窩狀薄膜以來，蜂窩狀有序多孔薄膜的制備和理論研究發(fā)展迅速。蜂窩狀有序多孔薄膜是指孔徑大小均一且排列有序的薄膜材料。通過對濕度、氣溫、溶劑、成膜材料的選擇可制備孔徑從幾個納米到幾十個微米的薄膜。眾所周知，有序空間結(jié)構(gòu)材料通常比無序結(jié)構(gòu)具有更優(yōu)良的性能，如單晶硅在半導(dǎo)體方面的應(yīng)用，石墨烯材料的開發(fā)以及超順磁性在超導(dǎo)材料方面的應(yīng)用等。
[0003]突光分析法(fluorescence analysis)是某些物質(zhì)的分子能吸收能量而發(fā)射出突光，根據(jù)熒光的光譜和熒光強度，對物質(zhì)進(jìn)行定性或定量的方法。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強、需樣量少、可測參數(shù)多和方法簡便等優(yōu)點，它在生化分析中的應(yīng)用較廣泛。在此基礎(chǔ)上，與生物免疫學(xué)結(jié)合，熒光免疫傳感器獲得迅猛發(fā)展。熒光免疫傳感器是利用免疫試劑作為分子識別單元，以熒光試劑或酶為標(biāo)記物，通過抗體與抗原之間的特異性反應(yīng)從而達(dá)到對抗原或抗體的測定。
[0004]適配體具有與抗體相類似的性質(zhì)，但是在許多方面還體現(xiàn)出了優(yōu)于抗體的特點。由于其分子量較小，可化學(xué)合成、穩(wěn)定性好、沒有毒性等優(yōu)點，在許多方面體現(xiàn)了傳統(tǒng)的免疫學(xué)與化學(xué)分子識別無可比擬的優(yōu)勢，近年來受到化學(xué)家的廣泛關(guān)注。尤其在分析化學(xué)學(xué)科，核酸適配體的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用研究均呈現(xiàn)了快速發(fā)展的趨勢，已成為分析化學(xué)進(jìn)展最迅速的學(xué)科前沿之一。經(jīng)過20多年的研究發(fā)展，它在國內(nèi)外化學(xué)、生物學(xué)、納米材料、蛋白質(zhì)科學(xué)、物理和數(shù)學(xué)等多種研究領(lǐng)域得到極大的發(fā)展。尤其在生物學(xué)領(lǐng)域，適配體作為一種識別元素，對蛋白質(zhì)(抗原、腫瘤標(biāo)志物)檢測，重金屬離子檢測，細(xì)胞成像，小分子檢測等方面，有其特殊貢獻(xiàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法。
[0006]術(shù)語說明:
[0007]水滴模板法:利用凝結(jié)并自組織有序排列的水滴為模板，從而構(gòu)筑有序蜂窩狀多孔薄膜的一種方法，此方法具有方便、快速和廉價等優(yōu)點，作為模板的水滴可以自然蒸發(fā)而除去，且孔洞的尺寸可以通過改變相關(guān)的實驗參數(shù)進(jìn)行方便地調(diào)控，所以，水滴模板法在多孔薄膜材料的構(gòu)筑中被廣泛應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]一種基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，步驟如下:
[0010](I)用聚苯乙烯/聚乙二醇的甲苯溶液為母液，將核酸適配體、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉與母液混合，在60?80°C條件下水浴20?40分鐘，得成膜液；
[0011]成膜液中，所述的聚苯乙烯濃度為1.0?5.0mg.ml/1,所述的聚乙二醇濃度為0.1?2.0mg.mL—1,所述的二(2-乙基己基)琥拍酸酯磺酸鈉濃度為0.1?5mg.mL—1,所述的核酸適配體濃度為5?50 μ mo I.L-1 ；
[0012](2)將步驟(I)制得的成膜液于相對濕度為50%?80%的條件下，利用水滴模板法在固體基底上制備蜂窩狀多孔薄膜；
[0013](3)將步驟(2)制得的蜂窩狀多孔薄膜從固體基底上剝離并置于熒光標(biāo)記配對鏈溶液中，于3?5°C恒溫條件下振蕩孵化反應(yīng)60?80分鐘，然后用水沖洗3?5次，用氮氣吹干，即得基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器；
[0014]所述的熒光標(biāo)記配對鏈溶液的濃度為0.01?0.1 μ mo I.L—1，ρΗ6.9?7.I ;
[0015]所述的熒光標(biāo)記配對鏈為經(jīng)熒光素標(biāo)記后的與步驟(I)中核酸適配體相配對的鏈。
[0016]本發(fā)明制備的核酸適配體薄膜外觀呈薄膜狀態(tài)。
[0017]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(I)中所述的聚苯乙烯的分子量為150000?500000，所述的聚乙二醇的分子量為200?400 ；
[0018]所述的核酸適配體為凝血酶適配體、可卡因適配體、腺苷適配體、血紅素適配體或赭曲霉素適配體。
[0019]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(2)中所述的固體基底為硅片、玻璃片、鋼鐵片或聚對苯二甲酸乙二醇酯薄片(PET)。
[0020]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(3)中所述的熒光標(biāo)記配對鏈溶液的溶劑為pH 7.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液。
[0021]根據(jù)本發(fā)明，一種利用上述基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器對生物及無機小分子進(jìn)行檢測的方法，所述的生物及無機小分子為凝血酶、可卡因、腺苷、血紅素或赭曲霉素；
[0022]步驟如下:
[0023](I)配制不同濃度的檢測目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將核酸適配體薄膜加入到檢測目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液中，3?5°C恒溫條件下振蕩孵化60?80分鐘，然后倒入比色皿中，去除核酸適配體薄膜；
[0024](2)用熒光分光光度計掃描步驟(I)所得溶液的熒光強度，根據(jù)所得響應(yīng)信號與檢測目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制檢測目標(biāo)物濃度與熒光強度的對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；
[0025](3)將待測樣品超聲粉碎為樣品溶液，將核酸適配體薄膜加入到樣品溶液中，3?5°C恒溫條件下振蕩孵化60?80分鐘，然后倒入比色皿中，去除核酸適配體薄膜；
[0026](4)用熒光分光光度計掃描步驟(3)所得溶液的熒光強度，將得到的熒光強度對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到待測樣品的濃度。
[0027]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(I)中去除核酸適配體薄膜的方式為:傾倒振蕩孵化后的溶液，留核酸適配體薄膜于比色皿中。
[0028]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，步驟(2)中熒光分光光度計掃描的具體參數(shù)為:Ex = 440nm、狹縫寬 5nm, Em = 517.53nm、狹縫寬 18nm。
[0029]本發(fā)明檢測目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)工作曲線范圍的變化可通過調(diào)節(jié)檢測目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液中的核酸適配體的濃度來實現(xiàn)。同時可通過改變二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉的用量、相對濕度、溫度、溶液蒸發(fā)速度等條件來控制蜂窩狀多孔薄膜的孔徑的大小，實現(xiàn)在一個微區(qū)上的形貌調(diào)控。
[0030]本發(fā)明通過大量實驗對熒光標(biāo)記配對鏈與核酸適配體之間相互作用的條件進(jìn)行優(yōu)化選擇(pH和飽和時間)；通過熒光分析法，對待測目標(biāo)物與核酸適配體薄膜作用過程的條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，快速便捷的得到檢測目標(biāo)物濃度與熒光強度的線性范圍。
[0031]本發(fā)明突出的特點和有益效果是:
[0032]1、本發(fā)明基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法操作簡單，成本低廉，尺度可控，解決了常規(guī)方法一般需要較昂貴的儀器設(shè)備、特殊的掩膜或印章材料的問題。
[0033]2、本發(fā)明通過一步法合成了具有生物活性的核酸適配體蜂窩狀多孔薄膜，拓寬了蜂窩狀多孔薄膜的應(yīng)用領(lǐng)域。
[0034]3、本發(fā)明制得的基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器，可實現(xiàn)對多種目標(biāo)物的檢測，可在生物芯片、組織工程材料、細(xì)胞工程和生物傳感器等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為本發(fā)明實施例1制得的凝血酶核酸適配體薄膜的明場圖片。
[0036]圖2為本發(fā)明實施例1制得的凝血酶核酸適配體薄膜的熒光圖片。
[0037]圖3為本發(fā)明實施例2中凝血酶濃度與熒光強度對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

【具體實施方式】
[0038]下面通過具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不限于此。
[0039]實施例中所用原料均為常規(guī)原料，市購產(chǎn)品，所用設(shè)備均為常規(guī)設(shè)備。
[0040]其中，核酸適配體(Apt)、熒光標(biāo)記配對鏈(6-羧基熒光素[簡稱6-FAM]對部分配對的寡核苷酸片段進(jìn)行標(biāo)記得到)，色譜純，寶生物工程(大連)有限公司有售；二(2-乙基己基)琥拍酸酯磺酸鈉、凝血酶，Sigma中國有限公司有售。
[0041]實施例中水滴模板法制備蜂窩狀多孔薄膜的具體方法為:用聚苯乙烯/聚乙二醇的甲苯溶液為母液，將核酸適配體、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉與母液混合，在60?80°C條件下水浴20?40分鐘，得成膜液；待成膜液冷卻至室溫，在相對濕度為50%?80%的條件下，用微量注射器移取6 μ L成膜液滴加到處理干凈的基底材料上。溶劑揮發(fā)使成膜液表面的水蒸氣發(fā)生冷凝形成水滴進(jìn)入到溶液中，壓縮的水滴在對流和毛細(xì)管力等的作用下發(fā)生自組裝，在此過程中起到多孔結(jié)構(gòu)形成的模板，溶劑和水滴繼揮發(fā)完畢后，原來水滴所處的位置便形成空洞，最終導(dǎo)致有序多孔材料的形成。
[0042]實施例1、凝血酶核酸適配體薄膜熒光傳感器的制備
[0043]凝血酶適配體總鏈:H00C-GGTTGGTG TGG TTGG CTCT CTCT CTCT。
[0044]熒光標(biāo)記的配對鏈-.CCkk GGTG TGG AACC_6_FAM。其中，熒光標(biāo)記的配對鏈?zhǔn)遣糠峙鋵Γㄟ^互補配對作用對凝血酶適配體薄膜進(jìn)行熒光標(biāo)記，在對凝血酶檢測過程中，部分配對的熒光標(biāo)記的配對鏈由于不如凝血酶與凝血酶適配體的作用強烈從而被取得發(fā)生脫落，繼而導(dǎo)致溶液中熒光標(biāo)記配對鏈變化，熒光分析表現(xiàn)為熒光強度的變化，通過凝血酶濃度與溶液熒光強度的關(guān)系來檢測凝血酶。
[0045]一種基于凝血酶核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，步驟如下:
[0046](I)用聚苯乙烯(分子量為150000)/聚乙二醇(分子量為200)的甲苯溶液為母液，將凝血酶核酸適配體、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉與母液混合，在80°C條件下水浴30分鐘，得成膜液；
[0047]成膜液中，所述的聚苯乙烯濃度為2.0mg.πι?Λ所述的聚乙二醇濃度為0.5mg.ml/1,所述的二(2-乙基己基)琥拍酸酯磺酸鈉濃度為0.1mg.ml/1,所述的凝血酶核酸適配體濃度為10 μ mo I.L—1 ；
[0048](2)將步驟⑴制得的成膜液于相對濕度為60%的條件下，利用水滴模板法在硅片基底上制備蜂窩狀多孔薄膜；
[0049](3)將步驟(2)制得的蜂窩狀多孔薄膜從硅片基底上剝離并置于2mL、pH7.0、
0.05 μ mo 1-Γ1熒光標(biāo)記配對鏈溶液中振蕩孵化反應(yīng)70分鐘，恒溫4°C，然后用水沖洗5次，用氮氣吹干，即得基于凝血酶核酸適配體薄膜的熒光傳感器；
[0050]所述的熒光標(biāo)記配對鏈為經(jīng)熒光素標(biāo)記后的與步驟(I)中凝血酶核酸適配體相配對的鏈。
[0051]本實施例制得的凝血酶核酸適配體薄膜的熒光顯微鏡明場圖片，如圖1所示，由圖1可知，本實施例成功制備了凝血酶核酸適配體蜂窩狀薄膜材料；如圖2所示，經(jīng)凝血酶核酸適配體的熒光標(biāo)記配對鏈孵化后，由于堿基互補相互作用，適配體與配對鏈特異性結(jié)合，從而得到了熒光多孔薄膜材料。
[0052]實施例2、凝血酶的檢測
[0053]一種利用實施例1制得的基于凝血酶核酸適配體薄膜的熒光傳感器對凝血酶進(jìn)行檢測的方法，步驟如下:
[0054](I)配制濃度為 0mol/L、0.43 X 10 10mol/L、0.85 X 10 10mol/L、1.7 X 10 10mol/L、
2.55X l(Tlclmol/L、3.4X l(Tlclmol/L、4.25X l(Tlclmol/L、5.1 X l(Tlclmol/L、6.8X l(T10mol/L、
8.5X10-10mol/L的凝血酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將實施例1制得的凝血酶核酸適配體薄膜加入到SmL凝血酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，振蕩孵化70分鐘，恒溫4°C，然后倒入比色皿中，去除核酸適配體薄膜；
[0055](2)用熒光分光光度計掃描步驟(I)所得溶液的熒光強度，根據(jù)所得響應(yīng)信號與凝血酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制凝血酶濃度與熒光強度的對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖3所示；凝血酶濃度在0.85X 10_1QmOl/L?5.1 X 10?I/L范圍內(nèi)孵化溶液的熒光強度與凝血酶濃度呈正線性相關(guān)，其檢測限為0.28 X 1^moI/L ；
[0056](3)將凝血酶待測樣品超聲粉碎為樣品溶液，將凝血酶核酸適配體薄膜加入到樣品溶液中，振蕩孵化70分鐘，恒溫4°C，然后倒入比色皿中，去除凝血酶核酸適配體薄膜；
[0057](4)用熒光分光光度計掃描步驟(3)所得溶液的熒光強度，將得到的熒光強度對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到待測樣品的濃度。
[0058]因此，凝血酶濃度的檢測范圍為0.85X 10-1Qmol/L?5.1 X 10-lclmol/L，其檢測限為
0.28 X I(TicW)I/L。
[0059]實施例3、可卡因核酸適配體薄膜熒光傳感器的制備
[0060]一種基于可卡因核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，步驟如下:
[0061](I)用聚苯乙烯(分子量為200000)/聚乙二醇(分子量為400)的甲苯溶液為母液，將可卡因核酸適配體、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉與母液混合，在75°C條件下水浴20分鐘，得成膜液；
[0062]成膜液中，所述的聚苯乙烯濃度為1.0mg.ι?ΙΛ所述的聚乙二醇濃度為
0.1mg.ml/1,所述的二(2-乙基己基)琥拍酸酯磺酸鈉濃度為0.2mg.ml/1,所述的可卡因核酸適配體濃度為20 μ mo I.L—1 ；
[0063](2)將步驟(I)制得的成膜液于相對濕度為60%的條件下，利用水滴模板法在玻璃片基底上制備蜂窩狀多孔薄膜；
[0064](3)將步驟⑵制得的蜂窩狀多孔薄膜從玻璃片基底上剝離并置于2mL、pH6.9、
0.05 μ mo 1-Γ1熒光標(biāo)記配對鏈溶液中振蕩孵化反應(yīng)70分鐘，恒溫4°C，然后用水沖洗5次，用氮氣吹干，即得基于可卡因核酸適配體薄膜的熒光傳感器；
[0065]所述的熒光標(biāo)記配對鏈溶液為經(jīng)熒光素標(biāo)記后的與步驟(I)中可卡因核酸適配體相配對的鏈。
[0066]實施例4、血紅素核酸適配體薄膜熒光傳感器的制備
[0067]一種基于血紅素核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，步驟如下:
[0068](I)用聚苯乙烯(分子量為200000)/聚乙二醇(分子量為400)的甲苯溶液為母液，將血紅素核酸適配體、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉與母液混合，在85°C條件下水浴40分鐘，得成膜液；
[0069]成膜液中，所述的聚苯乙烯濃度為3.0mg 所述的聚乙二醇濃度為Img *mL_1,所述的二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉濃度為Img 所述的血紅素核酸適配體濃度為 40 μ mo I.L-1 ；
[0070](2)將步驟⑴制得的成膜液于相對濕度為50%的條件下，利用水滴模板法在玻璃片基底上制備蜂窩狀多孔薄膜；
[0071](3)將步驟⑵制得的蜂窩狀多孔薄膜從玻璃片基底上剝離并置于2mL、pH7.1、
0.05 μ mo 1-Γ1熒光標(biāo)記配對鏈溶液中振蕩孵化反應(yīng)75分鐘，恒溫5°C，然后用水沖洗5次，用氮氣吹干，即得基于血紅素核酸適配體薄膜的熒光傳感器；
[0072]所述的熒光標(biāo)記配對鏈為經(jīng)熒光素標(biāo)記后的與步驟(I)中血紅素核酸適配體相配對的鏈。
[0073]實施例5、腺苷核酸適配體薄膜突光傳感器的制備
[0074]一種基于腺苷核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，步驟如下:
[0075](I)用聚苯乙烯(分子量為250000)/聚乙二醇(分子量為400)的甲苯溶液為母液，將腺苷核酸適配體、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉與母液混合，在80°C條件下水浴30分鐘，得成膜液；
[0076]成膜液中，所述的聚苯乙烯濃度為5.0mg iL4,所述的聚乙二醇濃度為2mg *mL_1,所述的二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉濃度為3mg 所述的腺苷核酸適配體濃度為30 μ mol.L 1 ；
[0077](2)將步驟(I)制得的成膜液于相對濕度為80%的條件下，利用水滴模板法在鋼鐵片基底上制備蜂窩狀多孔薄膜；
[0078](3)將步驟(2)制得的蜂窩狀多孔薄膜從鋼鐵片基底上剝離并置于2mL、pH7.0、
0.05 μ mol.ml/1熒光標(biāo)記配對鏈溶液中振蕩孵化反應(yīng)70分鐘，恒溫4°C，然后用水沖洗4次，用氮氣吹干，即得基于腺苷核酸適配體薄膜的熒光傳感器；
[0079]所述的熒光標(biāo)記配對鏈為經(jīng)熒光素標(biāo)記后的與步驟(I)中腺苷核酸適配體相配對的鏈。
[0080]實施例6、赭曲霉素核酸適配體薄膜熒光傳感器的制備
[0081]一種基于赭曲霉素核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，步驟如下:
[0082](I)用聚苯乙烯(分子量為500000)/聚乙二醇(分子量為300)的甲苯溶液為母液，將赭曲霉素核酸適配體、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉與母液混合，在80°C條件下水浴30分鐘，得成膜液；
[0083]成膜液中，所述的聚苯乙烯濃度為3.0mg.πι?Λ所述的聚乙二醇濃度為
0.8mg.ml/1,所述的二(2-乙基己基)琥拍酸酯磺酸鈉濃度為4mg.ml/1,所述的赭曲霉素核酸適配體濃度為50 μ mol.L—1 ；
[0084](2)將步驟(I)制得的成膜液于相對濕度為60%的條件下，利用水滴模板法在硅片基底上制備蜂窩狀多孔薄膜；
[0085](3)將步驟⑵制得的蜂窩狀多孔薄膜從硅片基底上剝離并置于2mL、pH7.0、
0.05 μ mol -Γ1熒光標(biāo)記配對鏈溶液中振蕩孵化反應(yīng)70分鐘，恒溫4°C，然后用水沖洗4次，用氮氣吹干，即得基于赭曲霉素核酸適配體薄膜的熒光傳感器；
[0086]所述的熒光標(biāo)記配對鏈為經(jīng)熒光素標(biāo)記后的與步驟(I)中赭曲霉素核酸適配體相配對的鏈。
【權(quán)利要求】
1.一種基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，步驟如下: (1)用聚苯乙烯/聚乙二醇的甲苯溶液為母液，將核酸適配體、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉與母液混合，在75?85°C條件下水浴20?40分鐘，得成膜液； 成膜液中，所述的聚苯乙烯濃度為1.0?5.0mg.ml/1,所述的聚乙二醇濃度為0.1?2.0mg.ml/1,所述的二(2-乙基己基)琥拍酸酯磺酸鈉濃度為0.1?5mg.ml/1,所述的核酸適配體濃度為5?50 μ mo I.L—1 ； (2)將步驟(I)制得的成膜液于相對濕度為50%?80%的條件下，利用水滴模板法在固體基底上制備蜂窩狀多孔薄膜； (3)將步驟(2)制得的蜂窩狀多孔薄膜從固體基底上剝離并置于熒光標(biāo)記配對鏈溶液中，于3?5°C恒溫條件下振蕩孵化反應(yīng)60?80分鐘，然后用水沖洗3?5次，用氮氣吹干，即得基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器； 所述的熒光標(biāo)記配對鏈溶液的濃度為0.01?0.1 μ mo I.L—1，pH6.9?7.1 ; 所述的熒光標(biāo)記配對鏈為經(jīng)熒光素標(biāo)記后的與步驟(I)中核酸適配體相配對的鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所述的聚苯乙烯的分子量為150000?500000，所述的聚乙二醇的分子量為200 ?400。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所述的核酸適配體為凝血酶適配體、可卡因適配體、腺苷適配體、血紅素適配體或赭曲霉素適配體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的固體基底為硅片、玻璃片、鋼鐵片或聚對苯二甲酸乙二醇酯薄片。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于核酸適配體薄膜的熒光傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的熒光標(biāo)記配對鏈溶液的溶劑為pH 7.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液。
6.—種利用權(quán)利要求1-5任一項所述的基于核酸適配體薄膜的突光傳感器對生物及無機小分子進(jìn)行檢測的方法，所述的生物及無機小分子為凝血酶、可卡因、腺苷、血紅素或赫曲霉素； 步驟如下: (1)配制不同濃度的檢測目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將核酸適配體薄膜加入到檢測目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液中，3?5°C恒溫條件下振蕩孵化60?80分鐘，然后倒入比色皿中，去除核酸適配體薄膜； (2)用熒光分光光度計掃描步驟(I)所得溶液的熒光強度，根據(jù)所得響應(yīng)信號與檢測目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制檢測目標(biāo)物濃度與熒光強度的對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線.-^4 ， (3)將待測樣品超聲粉碎為樣品溶液，將核酸適配體薄膜加入到樣品溶液中，3?5°C恒溫條件下振蕩孵化60?80分鐘，然后倒入比色皿中，去除核酸適配體薄膜； (4)用熒光分光光度計掃描步驟(3)所得溶液的熒光強度，將得到的熒光強度對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到待測樣品的濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，步驟(I)中去除核酸適配體薄膜的方式為:傾倒振蕩孵化后的溶液，留核酸適配體薄膜于比色皿中。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中熒光分光光度計掃描的具體參數(shù)為:Ex = 440nm、狹縫寬 5nm, Em = 517.53nm、狹縫寬 18nm。
【文檔編號】G01N21/64GK104198455SQ201410475213
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】范大偉, 夏秀龍, 魏琴 申請人:濟南大學(xué)