肺癌生物標(biāo)記及其用途
【專(zhuān)利摘要】本申請(qǐng)包括檢測(cè)和診斷肺癌的生物標(biāo)記、方法、裝置、試劑、系統(tǒng)和試劑盒。在一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝松飿?biāo)記，其可以單獨(dú)使用或以各種組合使用來(lái)診斷肺癌或允許區(qū)分診斷肺小結(jié)為良性或惡性的。在另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝嗽\斷個(gè)體的肺癌的方法，其中所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)至少一個(gè)生物標(biāo)記值，所述至少一個(gè)生物標(biāo)記值對(duì)應(yīng)于選自表1第2列提供的生物標(biāo)記的組的至少一個(gè)生物標(biāo)記，其中基于所述至少一個(gè)生物標(biāo)記值，所述個(gè)體分類(lèi)為患有肺癌，或者確定所述個(gè)體患有肺癌的似然性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】肺癌生物標(biāo)記及其用途
[0001]本申請(qǐng)是2009年9月9日提交的題為“肺癌生物標(biāo)記及其用途”的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200980144620.X的分案申請(qǐng)。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)
[0003]本申請(qǐng)要求于2008年9月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/095，593號(hào)以及于2009年2月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/152，837號(hào)的權(quán)益，這兩個(gè)臨時(shí)申請(qǐng)的題目均為“肺癌樣品的多重分析”并且這兩個(gè)臨時(shí)申請(qǐng)的全文通過(guò)引用的方式并入本文以用于所有目的。
發(fā)明領(lǐng)域
[0004]本申請(qǐng)一般地涉及個(gè)體中生物標(biāo)記的檢測(cè)及癌癥的診斷，更具體地涉及用于診斷個(gè)體的癌癥，更特別是肺癌的一種或多種生物標(biāo)記、方法、裝置、試劑、系統(tǒng)和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0005]下面的描述提供了本申請(qǐng)相關(guān)信息的概述，并非承認(rèn)本文提供的信息或者引用的出版物是本申請(qǐng)的現(xiàn)有技術(shù)。
[0006]更多的人死于肺癌而非其他癌癥類(lèi)型。這對(duì)于男性和女性都是如此。2005年在美國(guó)(目前有統(tǒng)計(jì)數(shù)字的最近年份)，肺癌死亡比乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌死亡的組合還多。在那一年，107，416名男性和89，271名女性診斷患有肺癌，并且90，139名男性和69，078女性死于肺癌。在美國(guó)男性中，肺癌是白人男性、黑人男性、亞裔/太平洋島男性、美國(guó)印第安男性/阿拉斯加土著男性以及西班牙裔男性中第二常見(jiàn)的癌癥。在美國(guó)女性中，肺癌是白人女性、黑人女性、美國(guó)印第安女性/阿拉斯加土著女性中第二常見(jiàn)的癌癥，并且是亞裔/太平洋島女性和西班牙裔女性中第三常見(jiàn)的癌癥。對(duì)于不戒煙的人，肺癌死亡率為15%，甚至對(duì)于50-59歲的戒煙的人仍為5%以上。僅美國(guó)在肺癌上每年保健費(fèi)用就為950億美元。
[0007]91%由吸煙所致的肺癌是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其占所有肺癌的約87%。所有肺癌中剩余的13%是小細(xì)胞肺癌，雖然混合細(xì)胞肺癌確有發(fā)生。因?yàn)樾〖?xì)胞肺癌罕見(jiàn)且迅速致死，所以早期檢測(cè)機(jī)會(huì)不大。
[0008]NSCLC有三種主要類(lèi)型:鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和腺癌。腺癌是最常見(jiàn)形式的肺癌(30% _40%，且據(jù)報(bào)道高達(dá)50% )，并且是在吸煙者和非吸煙者中最常發(fā)現(xiàn)的肺癌。鱗狀細(xì)胞癌占所有肺癌的25-30%，并且通常在近端支氣管中發(fā)現(xiàn)。早期NSCLC傾向于局部化，如果早期檢測(cè)到，其通?？梢允中g(shù)治療，并且結(jié)果有利且存活率改善。其他治療選擇包括放療、藥物療法和這些方法的組合。
[0009]NSCLC根據(jù)腫瘤大小及其在包括淋巴結(jié)在內(nèi)的其他組織中的存在來(lái)分期。在隱藏期，癌細(xì)胞在痰樣品或灌洗樣品中發(fā)現(xiàn)，在肺中檢測(cè)不到腫瘤。在O期，僅肺最深的內(nèi)襯(lining)表現(xiàn)出癌細(xì)胞，腫瘤沒(méi)有生長(zhǎng)通過(guò)內(nèi)襯。在IA期，癌癥被認(rèn)為是侵襲性的，并且已生長(zhǎng)深入肺組織，但是腫瘤橫向(across)小于3cm。在這個(gè)時(shí)期，在支氣管或淋巴結(jié)中未發(fā)現(xiàn)腫瘤。在IB期，腫瘤橫向大于3cm或者已生長(zhǎng)入支氣管或胸膜，但是尚未生長(zhǎng)入淋巴結(jié)。在IIA期，腫瘤橫向大于3cm，并且已生長(zhǎng)入淋巴結(jié)。在IIB期，腫瘤在淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)并且橫向大于3cm，或者已生長(zhǎng)入支氣管或胸膜；或者癌癥不在淋巴結(jié)中但是在胸壁、膈、胸膜、支氣管或圍繞心臟的組織中發(fā)現(xiàn)。在IIIA期，癌細(xì)胞在肺和支氣管附近的淋巴結(jié)中以及肺之間的淋巴結(jié)中，不在在腫瘤所位于的胸的一側(cè)上。在IIIB期，癌細(xì)胞位于胸的腫瘤的對(duì)側(cè)及在頸中。肺附近的其他器官也可以具有癌細(xì)胞，并且在一個(gè)肺葉中可以發(fā)現(xiàn)多個(gè)腫瘤。在IV期，腫瘤在相同肺或兩個(gè)肺多于一個(gè)的肺葉中發(fā)現(xiàn)，并且癌細(xì)胞在身體其他部分發(fā)現(xiàn)。
[0010]目前肺癌診斷方法包括測(cè)試痰的癌細(xì)胞、胸部X-射線(xiàn)、呼吸道的纖維光學(xué)評(píng)價(jià)和低劑量螺旋計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)。痰細(xì)胞學(xué)的靈敏性非常低。胸X-射線(xiàn)也較不靈敏，而且要求病灶的大小大于Icm以可見(jiàn)。支氣管鏡檢查要求腫瘤在支氣管鏡可及的呼吸道內(nèi)可見(jiàn)。最廣泛認(rèn)可的診斷方法是CT，但是常與X-射線(xiàn)一起，CT的應(yīng)用涉及電離輻射，其本身可以導(dǎo)致癌癥。CT還有明顯的限制:掃描需要高技術(shù)水平以解釋?zhuān)⑶以S多觀(guān)測(cè)的異常事實(shí)上不是肺癌，在跟蹤C(jī)T發(fā)現(xiàn)中產(chǎn)生很大保健花費(fèi)。最常見(jiàn)伴隨發(fā)現(xiàn)是良性肺小結(jié)。
[0011]肺小結(jié)是較圓的病灶或異常組織區(qū)域，其位于肺中且大小可變。肺小結(jié)可以是良性或癌性的，但是大多數(shù)是良性的。如果小結(jié)小于4mm，則發(fā)病率僅為1.5%，如果小結(jié)為4_8mm，則發(fā)病率為約6%，如果超過(guò)20mm，則發(fā)病率為約20%。對(duì)于小和中等大小的小結(jié)，建議患者在3個(gè)月至I年內(nèi)重復(fù)掃描。對(duì)于許多大小結(jié)，患者接受生物活檢(其是侵入性的并且可能導(dǎo)致并發(fā)癥)，即使大部分小結(jié)是良性的。
[0012]因此，亟需可以替代或補(bǔ)充CT的診斷方法以減少進(jìn)行的手術(shù)數(shù)量及降低手術(shù)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。另外，甚至當(dāng)不存在或未知肺小結(jié)時(shí)，需要在早期檢測(cè)肺癌的方法以改善患者的結(jié)局。僅16%的肺癌病例診斷為局部早期癌癥，其中5年存活率為46%，相比之下，在晚期診斷的為84%，其中5年存活率僅為13%。這證實(shí)依賴(lài)于癥狀診斷是無(wú)用的，因?yàn)樗鼈冎械脑S多是其他肺疾病常見(jiàn)的。這些癥狀包括久咳、血痰、胸痛和復(fù)發(fā)性支氣管炎或肺炎。
[0013]當(dāng)存在癌癥早期診斷方法時(shí)，益處通常是醫(yī)療行業(yè)所接受的。廣泛使用篩查方案的癌癥具有最高5年的存活率，如乳腺癌(88% )和結(jié)腸癌(65% )，相比之下肺癌為16%。但是，如果癌癥在I期通過(guò)篩查診斷，則88%的肺癌患者存活10年或更長(zhǎng)。這證實(shí)明顯亟需可以可靠地檢測(cè)早期NSCLC的診斷方法。
[0014]特定疾病狀態(tài)的生物標(biāo)記的選擇首先涉及鑒定標(biāo)記，該標(biāo)記對(duì)特定醫(yī)療應(yīng)用在疾病群體中具有與對(duì)照群體相比可測(cè)量且統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異。生物標(biāo)記可以包括分泌或脫落(shed)的分子，其與疾病發(fā)展或進(jìn)程平行，并且容易從肺組織或遠(yuǎn)端組織對(duì)病灶響應(yīng)而擴(kuò)散入血流。鑒定的生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的集合(set)通常臨床上進(jìn)行驗(yàn)證，或者證實(shí)為對(duì)其所選的原始預(yù)期用途是可靠的指示物。生物標(biāo)記可以包括小分子、肽、蛋白和核酸。影響生物標(biāo)記鑒定的一些關(guān)鍵問(wèn)題包括可用數(shù)據(jù)的過(guò)擬合(over-fitting)及數(shù)據(jù)偏差。
[0015]已使用各種方法來(lái)試圖鑒定生物標(biāo)記及診斷疾病。對(duì)于基于蛋白的標(biāo)記，這些方法包括二維電泳、質(zhì)譜和免疫測(cè)定方法。對(duì)于核酸標(biāo)記，這些方法包括mRNA表達(dá)譜、微RNA譜、FISH、基因表達(dá)系列分析(SAGE)和大規(guī)?；虮磉_(dá)陣列。
[0016]二維電泳的應(yīng)用由于如下問(wèn)題而受限:低檢測(cè)靈敏度；與蛋白溶解性、電荷及疏水性相關(guān)的問(wèn)題；凝膠再現(xiàn)性；以及單個(gè)斑點(diǎn)代表多個(gè)蛋白的可能性。對(duì)于質(zhì)譜，取決于所用形式，限制圍繞樣品加工和分離、對(duì)低豐度蛋白的靈敏性、信噪比考慮及不能立即鑒定檢測(cè)的蛋白而出現(xiàn)。免疫測(cè)定方法發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記的限制集中在基于抗體的多重測(cè)定不能測(cè)量大量分析物。可以簡(jiǎn)單地印刷高質(zhì)量抗體的陣列，并且無(wú)需夾心而測(cè)量與這些抗體結(jié)合的分析物。(這會(huì)使用全基因組核酸序列經(jīng)雜交測(cè)量有機(jī)體或細(xì)胞中的全部DNA或RNA序列的方式上的等同物。因?yàn)殡s交可以是同一性的嚴(yán)緊測(cè)試，所以雜交實(shí)驗(yàn)可行。甚至非常好的抗體在選擇它們的結(jié)合配偶體中也并非足夠嚴(yán)緊來(lái)在血液或甚至是細(xì)胞提取物環(huán)境中工作，因?yàn)槟切┗|(zhì)中的蛋白總體(ensemble)具有極其不同的豐度。)因此，必須使用不同的基于免疫測(cè)定的方法以發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記一需要使用多重ELISA測(cè)定(即夾心)以獲得足夠嚴(yán)緊性來(lái)同時(shí)測(cè)量許多分析物從而決定哪些分析物確實(shí)是生物標(biāo)記。夾心免疫測(cè)定不放大到高含量，因此使用標(biāo)準(zhǔn)陣列形式不能用嚴(yán)緊夾心免疫測(cè)定發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記。最后，抗體試劑容易產(chǎn)生相當(dāng)大的批次差異和試劑不穩(wěn)定性。本發(fā)明的蛋白生物標(biāo)記發(fā)現(xiàn)平臺(tái)克服了這個(gè)問(wèn)題。
[0017]許多這些方法依賴(lài)或需要在分析前一些類(lèi)型的樣品的分級(jí)。因此進(jìn)行設(shè)計(jì)為在一系列良好限定的樣品群體中鑒定/發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)生物標(biāo)記的足夠有效的研究所需樣品制備是極其困難、昂貴和耗時(shí)的。在分級(jí)期間，大范圍的各種變異性可能被引入各種樣品。例如，一個(gè)潛在的標(biāo)記可能對(duì)于方法是不穩(wěn)定的，標(biāo)記的濃度可能變化，不合適的聚集或解聚可能發(fā)生，無(wú)意的樣品污染可能發(fā)生，并因此掩蓋預(yù)期在早期疾病中的微小變化。
[0018]廣泛接受的是使用這些技術(shù)的生物標(biāo)記發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)方法對(duì)于鑒定診斷性生物標(biāo)記具有嚴(yán)重限制。這些限制包括不能檢測(cè)低豐度生物標(biāo)記，不能持續(xù)覆蓋蛋白質(zhì)組的完整動(dòng)態(tài)范圍，樣品加工和分級(jí)中的不可再現(xiàn)性，以及方法的整體不可再現(xiàn)性和缺乏穩(wěn)健性(robustness)。另外，這些研究在數(shù)據(jù)中引入了偏差，針對(duì)鑒定和驗(yàn)證靶疾病群體內(nèi)的生物標(biāo)記所需的分布和隨機(jī)化方面，沒(méi)有充分解決包括合適的對(duì)照在內(nèi)的樣品群的復(fù)雜性，。
[0019]盡管意圖發(fā)現(xiàn)有效的新生物標(biāo)記的努力已進(jìn)行了幾十年，但是這些努力大部分是不成功的。針對(duì)各種疾病的生物標(biāo)記通常在實(shí)驗(yàn)室中鑒定，通常通過(guò)進(jìn)行一些疾病過(guò)程的基礎(chǔ)研究時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)?；谒霭l(fā)現(xiàn)及少量臨床數(shù)據(jù)，發(fā)表的論文提示鑒定了新的生物標(biāo)記。然而大多數(shù)這些建議的生物標(biāo)記未證實(shí)是真實(shí)或有用的生物標(biāo)記，這主要是因?yàn)闇y(cè)試的少量臨床樣品對(duì)于已確實(shí)發(fā)現(xiàn)有效的生物標(biāo)記僅提供弱統(tǒng)計(jì)學(xué)證據(jù)。也就是說(shuō)，最初的鑒定對(duì)于統(tǒng)計(jì)學(xué)基本元素是不嚴(yán)格的。在1994-2003年的每一年中，檢索科學(xué)文獻(xiàn)表明公開(kāi)了上千篇關(guān)于生物標(biāo)記的參考文獻(xiàn)。然而，在同時(shí)期內(nèi)，F(xiàn)DA—年最多批準(zhǔn)3種新蛋白生物標(biāo)記的診斷應(yīng)用，并且在若干年中沒(méi)有批準(zhǔn)新的蛋白生物標(biāo)記。
[0020]基于失敗的生物標(biāo)記發(fā)現(xiàn)努力的歷史，已建議了數(shù)學(xué)理論以進(jìn)一步促進(jìn)通常理解，即針對(duì)疾病的生物標(biāo)記很少且難以發(fā)現(xiàn)?；?D凝膠或質(zhì)譜的生物標(biāo)記研究支持這些觀(guān)點(diǎn)。通過(guò)這些方法鑒定了非常少的有用生物標(biāo)記。然而，通常忽視2D凝膠和質(zhì)譜測(cè)量血液中存在的約InM或更高濃度的蛋白，這種蛋白的總體很可能是最不可能隨疾病變化的。除了本發(fā)明的生物標(biāo)記發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)，尚不存在能夠精確測(cè)量低得多的濃度的蛋白表達(dá)水平的蛋白質(zhì)組生物標(biāo)記發(fā)現(xiàn)平臺(tái)。
[0021]關(guān)于復(fù)雜的人生物學(xué)的生物化學(xué)途徑已知許多。許多生物化學(xué)途徑以在病理學(xué)內(nèi)局部發(fā)揮作用的分泌的蛋白達(dá)到頂點(diǎn)或開(kāi)始，例如分泌生長(zhǎng)因子以刺激病理學(xué)中其他細(xì)胞的復(fù)制，分泌其他因子以避開(kāi)免疫系統(tǒng)等。盡管許多這些分泌的蛋白以旁分泌方式發(fā)揮作用，但是一些在身體的遠(yuǎn)端運(yùn)行。具有生物化學(xué)途徑基本了解的本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，許多病理學(xué)特異性蛋白應(yīng)當(dāng)以低于(甚至遠(yuǎn)低于)2D凝膠和質(zhì)譜檢測(cè)極限的濃度存在于血液中。在這種相對(duì)豐富數(shù)目的疾病生物標(biāo)記的鑒定之前必須有一種蛋白質(zhì)組平臺(tái)，其可以分析低于2D凝膠或質(zhì)譜可以檢測(cè)的濃度的蛋白。
[0022]因此，亟需生物標(biāo)記、方法、裝置、試劑、系統(tǒng)和試劑盒，其允許(a)區(qū)分良性肺小結(jié)與惡性肺小結(jié)；(b)檢測(cè)肺癌生物標(biāo)記；和(C)診斷肺癌。
[0023]發(fā)明概述
[0024]本申請(qǐng)包括用于檢測(cè)和診斷癌癥，更特別是肺癌的生物標(biāo)記、方法、試劑、裝置、系統(tǒng)和試劑盒。本申請(qǐng)的生物標(biāo)記使用實(shí)施例1詳述的基于多重適配體的測(cè)定鑒定。通過(guò)使用本文所述的基于適配體的生物標(biāo)記鑒定方法，本申請(qǐng)描述了可用于檢測(cè)和診斷肺癌的驚人的大量肺癌生物標(biāo)記。在鑒定這些生物標(biāo)記中，測(cè)量了來(lái)自幾百個(gè)個(gè)體樣品的超過(guò)800種蛋白，其中一些的濃度為低毫微微摩爾(femtomolar)范圍。這比用2D凝膠和/或質(zhì)譜進(jìn)行的生物標(biāo)記發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)低約4個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0025]盡管一些所述肺癌生物標(biāo)記可單獨(dú)用于檢測(cè)和診斷肺癌，但是本文所述的方法用于分組用作一組生物標(biāo)記的肺癌生物標(biāo)記的多個(gè)子集。一旦鑒定了單獨(dú)的生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的子集，則個(gè)體中肺癌的檢測(cè)或診斷可以用能夠測(cè)量生物學(xué)樣品中所選生物標(biāo)記或多個(gè)生物標(biāo)記的水平差異的任何測(cè)定平臺(tái)或者形式完成。
[0026]然而，僅僅通過(guò)使用本文所述的基于適配體的生物標(biāo)記鑒定方法，其中超過(guò)800個(gè)單獨(dú)的潛在生物標(biāo)記值從先前已經(jīng)診斷為患有或不患有肺癌的大量個(gè)體中逐個(gè)進(jìn)行了篩查，才可能鑒定本文公開(kāi)的肺癌生物標(biāo)記。這種發(fā)現(xiàn)方法與從條件培養(yǎng)基或裂解的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記截然相反，因?yàn)槠湓?xún)問(wèn)無(wú)需翻譯為人病理學(xué)的更加患者相關(guān)的系統(tǒng)。
[0027]因此，本申請(qǐng)一方面提供了一種或多種生物標(biāo)記以用于單獨(dú)或以各種組合來(lái)診斷肺癌或者允許將肺小結(jié)區(qū)分診斷為良性或惡性。示例性實(shí)施方案包括表I第2列提供的生物標(biāo)記，如上所述，這些生物標(biāo)記用實(shí)施例2所述的基于多重適配體的測(cè)定鑒定。表I第5列提供的標(biāo)記可以用于區(qū)分良性小節(jié)與癌性小結(jié)。表I第6列提供的標(biāo)記可以用于區(qū)分無(wú)癥狀吸煙者與患有肺癌的吸煙者。
[0028]盡管一些所述肺癌生物標(biāo)記可以單獨(dú)用于檢測(cè)和診斷肺癌，但是本文所述的方法也用于分組肺癌生物標(biāo)記的多個(gè)子集，其各自用作三個(gè)或更多個(gè)生物標(biāo)記的組。因此，本申請(qǐng)各個(gè)實(shí)施方案提供了包含N個(gè)生物標(biāo)記的組合，其中N是至少2個(gè)生物標(biāo)記。在其他實(shí)施方案中，N選自2-61個(gè)生物標(biāo)記的任意數(shù)。
[0029]仍然在其他實(shí)施方案中，N選自2-7、2-10、2-15、2-20、2-25、2-30、2-35、2-40、
2-45、2-50、2-55或2-61中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自3-7、3-10、3-15、3_20、
3-25、3-30、3-35、3-40、3-45、3-50、3-55或3-61中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自
4-7、4-10、4-15、4-20、4-25,4-30、4-35,4-40、4-45、4-50、4-55或 4_61 中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自 5-7、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55 或 5-61中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自6-10、6-15、6-20、6-25、6-30、6-35、6-40、6-45、
6-50、6-55或6-61中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自7-10、7-15、7-20、7-25、7_30、
7-35、7-40、7-45、7-50、7-55或7-61中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自8_10、8_15、
8-20、8-25、8-30、8-35、8-40、8-45、8-50、8-55或 8-61 中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自 9-15、9-20、9-25、9-30、9-35、9-40、9-45、9-50、9-55 或 9-61 中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自 10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55 或 10-61 中的任意數(shù)。應(yīng)理解N可以選自包含類(lèi)似但更高級(jí)(order)的范圍。
[0030]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷個(gè)體的肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)至少一個(gè)生物標(biāo)記值，所述至少一個(gè)生物標(biāo)記值對(duì)應(yīng)于選自表I第2列提供的生物標(biāo)記的組的至少一個(gè)生物標(biāo)記，其中所述個(gè)體基于所述至少一個(gè)生物標(biāo)記值分類(lèi)為患有肺癌。
[0031]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷個(gè)體的肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一，其中所述個(gè)體患有肺癌的似然性(likelihood)基于所述生物標(biāo)記值確定。
[0032]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷個(gè)體的肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一，其中所述個(gè)體基于所述生物標(biāo)記值分類(lèi)為患有肺癌，其中N = 2-10。
[0033]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷個(gè)體的肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一，其中所述個(gè)體患有肺癌的似然性基于所述生物標(biāo)記值確定，其中N= 2-10。
[0034]在另一方面，本發(fā)明提供了一種區(qū)分具有良性小結(jié)的個(gè)體與具有惡性小結(jié)的個(gè)體的方法,所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)至少一個(gè)生物標(biāo)記值,所述至少一個(gè)生物標(biāo)記值對(duì)應(yīng)于選自表I第5列所列的生物標(biāo)記的組的至少一個(gè)生物標(biāo)記，其中基于所述至少一個(gè)生物標(biāo)記值，所述個(gè)體分類(lèi)為具有惡性小結(jié)，或者確定所述個(gè)體具有惡性小結(jié)的似然性。
[0035]在另一方面，本發(fā)明提供了一種區(qū)分具有良性小結(jié)的個(gè)體與具有惡性小結(jié)的個(gè)體的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表I第5列所列的生物標(biāo)記的組的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一，其中基于所述生物標(biāo)記值，所述個(gè)體分類(lèi)為具有惡性小結(jié)，或者確定所述個(gè)體具有惡性小結(jié)的似然性，其中N=2-10。
[0036]在另一方面，本發(fā)明提供了一種篩查吸煙者的肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自吸煙者個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)至少一個(gè)生物標(biāo)記值，所述至少一個(gè)生物標(biāo)記值對(duì)應(yīng)于選自表I第6列所列的生物標(biāo)記的組的至少一個(gè)生物標(biāo)記，其中基于所述至少一個(gè)生物標(biāo)記值，所述個(gè)體分類(lèi)為患有肺癌，或者確定所述個(gè)體患有肺癌的似然性。
[0037]在另一方面，本發(fā)明提供了一種篩查吸煙者的肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自吸煙者個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表I第6列所列的生物標(biāo)記的組的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一，其中基于所述生物標(biāo)記值，所述個(gè)體分類(lèi)為患有肺癌，或者確定所述個(gè)體患有肺癌的似然性，其中N = 2-10。
[0038]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷個(gè)體不患有肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)至少一個(gè)生物標(biāo)記值，所述至少一個(gè)生物標(biāo)記值對(duì)應(yīng)于選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組的至少一個(gè)生物標(biāo)記，其中基于所述至少一個(gè)生物標(biāo)記值，所述個(gè)體分類(lèi)為不患有肺癌。
[0039]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷個(gè)體不患有肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一，其中基于所述生物標(biāo)記值，所述個(gè)體分類(lèi)為不患有肺癌，其中N = 2-10。
[0040]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于一組N個(gè)生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組，其中所述生物標(biāo)記值的分類(lèi)指示所述個(gè)體患有肺癌，其中N = 3-10。
[0041]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于一組N個(gè)生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組，其中所述生物標(biāo)記值的分類(lèi)指示所述個(gè)體患有肺癌，其中N = 3-15。
[0042]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表2-27所列組的集合的一組生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記值的分類(lèi)指示所述個(gè)體患有肺癌。
[0043]在另一方面，本發(fā)明提供了一種區(qū)分具有良性小結(jié)的個(gè)體與具有惡性小結(jié)的個(gè)體的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于一組N個(gè)生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記選自表I第5列所列的生物標(biāo)記的組，其中基于所述生物標(biāo)記值，所述個(gè)體分類(lèi)為具有惡性小結(jié)，或者確定所述個(gè)體具有惡性小結(jié)的似然性,其中N = 3-10。
[0044]在另一方面，本發(fā)明提供了一種區(qū)分具有良性小結(jié)的個(gè)體與具有惡性小結(jié)的個(gè)體的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于一組N個(gè)生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記選自表I第5列所列的生物標(biāo)記的組，其中基于所述生物標(biāo)記值，所述個(gè)體分類(lèi)為具有惡性小結(jié)，或者確定所述個(gè)體具有惡性小結(jié)的似然性，其中N = 3-15。
[0045]在另一方面，本發(fā)明提供了一種篩查吸煙者的肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自吸煙者個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于一組N個(gè)生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記選自表I第6列所列的生物標(biāo)記的組，其中基于所述生物標(biāo)記值，所述個(gè)體分類(lèi)為患有肺癌，或者確定所述個(gè)體患有肺癌的似然性，其中N =3-10。
[0046]在另一方面，本發(fā)明提供了一種篩查吸煙者的肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自吸煙者個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于一組N個(gè)生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記選自表I第6列所列的生物標(biāo)記的組，其中基于所述生物標(biāo)記值，所述個(gè)體分類(lèi)為患有肺癌，或者確定所述個(gè)體患有肺癌的似然性，其中N =
3-15。
[0047]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷肺癌不存在的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值,所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于一組N個(gè)生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組，其中所述生物標(biāo)記值的分類(lèi)指示所述個(gè)體中不存在肺癌，其中N = 3-10。
[0048]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷肺癌不存在的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值,所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于一組N個(gè)生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組，其中所述生物標(biāo)記值的分類(lèi)指示所述個(gè)體中不存在肺癌，其中N = 3-15。
[0049]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷肺癌不存在的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表2-27提供的組的集合的一組生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記值的分類(lèi)指示所述個(gè)體中不存在肺癌。
[0050]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷個(gè)體的肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值對(duì)應(yīng)于選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一，其中基于偏離預(yù)定閾值的分類(lèi)評(píng)分，所述個(gè)體分類(lèi)為患有肺癌，其中N= 2-10。
[0051]在另一方面，本發(fā)明提供了一種區(qū)分具有良性小結(jié)的個(gè)體與具有惡性小結(jié)的個(gè)體的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于一組N個(gè)生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記選自表I第5列所列的生物標(biāo)記的組，其中基于偏離預(yù)定閾值的分類(lèi)評(píng)分，所述個(gè)體分類(lèi)為具有惡性小結(jié)，或者確定所述個(gè)體具有惡性小結(jié)的似然性，其中N = 3-10。
[0052]在另一方面，本發(fā)明提供了一種區(qū)分具有良性小結(jié)的個(gè)體與具有惡性小結(jié)的個(gè)體的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于一組N個(gè)生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記選自表I第5列所列的生物標(biāo)記的組，其中基于偏離預(yù)定閾值的分類(lèi)評(píng)分，所述個(gè)體分類(lèi)為具有惡性小結(jié)，或者確定所述個(gè)體具有惡性小結(jié)的似然性，其中N = 3-15。
[0053]在另一方面，本發(fā)明提供了一種篩查吸煙者的肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自吸煙者個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于一組N個(gè)生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記選自表I第6列所列的生物標(biāo)記的組，其中基于偏離預(yù)定閾值的分類(lèi)評(píng)分，所述個(gè)體分類(lèi)為患有肺癌，或者確定所述個(gè)體患有肺癌的似然性，其中N = 3-10。
[0054]在另一方面，本發(fā)明提供了一種篩查吸煙者的肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自吸煙者個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于一組N個(gè)生物標(biāo)記中的生物標(biāo)記，其中所述生物標(biāo)記選自表I第6列所列的生物標(biāo)記的組，其中基于偏離預(yù)定閾值的分類(lèi)評(píng)分，所述個(gè)體分類(lèi)為患有肺癌，或者確定所述個(gè)體患有肺癌的似然性，其中N = 3-15。
[0055]在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷個(gè)體中不存在肺癌的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值對(duì)應(yīng)于選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一，其中基于偏離預(yù)定閾值的分類(lèi)評(píng)分，所述個(gè)體分類(lèi)為不患有肺癌，其中N = 2-10。
[0056]在另一方面，本發(fā)明提供了一種指示肺癌的似然性的計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法。所述方法包括:在計(jì)算機(jī)上檢索個(gè)體的生物標(biāo)記信息，其中所述生物標(biāo)記信息包括生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一，其中N如上定義；用計(jì)算機(jī)對(duì)每個(gè)所述生物標(biāo)記值進(jìn)行分類(lèi)；以及基于多個(gè)分類(lèi)指示所述個(gè)體患有肺癌的似然性。
[0057]在另一方面，本發(fā)明提供了一種將個(gè)體分類(lèi)為患有或不患有肺癌的計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法。所述方法包括:在計(jì)算機(jī)上檢索個(gè)體的生物標(biāo)記信息，其中所述生物標(biāo)記信息包括生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表I第2列提供的生物標(biāo)記的組的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一；用計(jì)算機(jī)對(duì)每個(gè)所述生物標(biāo)記值進(jìn)行分類(lèi)；以及基于多個(gè)分類(lèi)指示所述個(gè)體是否患有肺癌。
[0058]在另一方面，本發(fā)明提供了一種指示肺癌的似然性的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。所述計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品包括包含程序代碼的計(jì)算機(jī)可讀取介質(zhì)，所述程序代碼可由計(jì)算裝置或系統(tǒng)的處理器執(zhí)行，所述程序代碼包括:檢索歸因于來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品的數(shù)據(jù)的代碼，其中所述數(shù)據(jù)包括生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于所述生物學(xué)樣品中選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一，其中N如上定義；以及執(zhí)行分類(lèi)方法的代碼，所述分類(lèi)方法指示作為所述生物標(biāo)記值的函數(shù)的所述個(gè)體患有肺癌的似然性。
[0059]在另一方面，本發(fā)明提供了一種指示個(gè)體的肺癌狀態(tài)的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。所述計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品包括包含程序代碼的計(jì)算機(jī)可讀取介質(zhì)，所述程序代碼可由計(jì)算裝置或系統(tǒng)的處理器執(zhí)行，所述程序代碼包括:檢索歸因于來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品的數(shù)據(jù)的代碼，其中所述數(shù)據(jù)包括生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于所述生物學(xué)樣品中選自表I第2列提供的生物標(biāo)記的組的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一；以及執(zhí)行分類(lèi)方法的代碼，所述分類(lèi)方法指示作為所述生物標(biāo)記值的函數(shù)的所述個(gè)體的肺癌狀態(tài)。
[0060]在另一方面，本發(fā)明提供了一種指示肺癌的似然性的計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法。所述方法包括:在計(jì)算機(jī)上檢索個(gè)體的生物標(biāo)記信息，其中所述生物標(biāo)記信息包括生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值對(duì)應(yīng)于選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組的生物標(biāo)記；用計(jì)算機(jī)對(duì)所述生物標(biāo)記值進(jìn)行分類(lèi)；以及基于所述分類(lèi)指示所述個(gè)體患有肺癌的似然性。
[0061]在另一方面，本發(fā)明提供了一種將個(gè)體分類(lèi)為患有或不患有肺癌的計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法。所述方法包括:從計(jì)算機(jī)檢索個(gè)體的生物標(biāo)記信息，其中所述生物標(biāo)記信息包括生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值對(duì)應(yīng)于選自表I第2列提供的生物標(biāo)記的組的生物標(biāo)記；用計(jì)算機(jī)對(duì)所述生物標(biāo)記值進(jìn)行分類(lèi)；以及基于所述分類(lèi)指示所述個(gè)體是否患有肺癌。
[0062]在另一方面，本發(fā)明提供了一種指示肺癌的似然性的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。所述計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品包括包含程序代碼的計(jì)算機(jī)可讀取介質(zhì)，所述程序代碼可由計(jì)算裝置或系統(tǒng)的處理器執(zhí)行，所述程序代碼包括:檢索歸因于來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品的數(shù)據(jù)的代碼，其中所述數(shù)據(jù)包括生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值對(duì)應(yīng)于所述生物學(xué)樣品中選自表I第2列所列的生物標(biāo)記的組的生物標(biāo)記；以及執(zhí)行分類(lèi)方法的代碼，所述分類(lèi)方法指示作為所述生物標(biāo)記值的函數(shù)的所述個(gè)體患有肺癌的似然性。
[0063]在另一方面，本發(fā)明提供了一種指示個(gè)體的肺癌狀態(tài)的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。所述計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品包括包含程序代碼的計(jì)算機(jī)可讀取介質(zhì)，所述程序代碼可由計(jì)算裝置或系統(tǒng)的處理器執(zhí)行，所述程序代碼包括:檢索歸因于來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品的數(shù)據(jù)的代碼，其中所述數(shù)據(jù)包括生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值對(duì)應(yīng)于所述生物學(xué)樣品中選自表I第2列提供的生物標(biāo)記的組的生物標(biāo)記；以及執(zhí)行分類(lèi)方法的代碼，所述分類(lèi)方法指示作為所述生物標(biāo)記值的函數(shù)的所述個(gè)體的肺癌狀態(tài)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0064]圖1A是檢測(cè)生物學(xué)樣品中的肺癌的示例方法的流程圖。
[0065]圖1B是用樸素貝葉斯(na’ive Bayes)分類(lèi)方法檢測(cè)生物學(xué)樣品中的肺癌的示例方法的流程圖。
[0066]圖2示出單個(gè)生物標(biāo)記SCFsR的ROC曲線(xiàn)，其使用用于檢測(cè)無(wú)癥狀吸煙者中的肺癌的測(cè)試的樸素貝葉斯分類(lèi)器(classifier)。
[0067]圖3示出I至10個(gè)生物標(biāo)記的生物標(biāo)記組的ROC曲線(xiàn)，其使用用于檢測(cè)無(wú)癥狀吸煙者中的肺癌的測(cè)試的樸素貝葉斯分類(lèi)器。
[0068]圖4示出隨生物標(biāo)記的數(shù)目從I增加到10的分類(lèi)評(píng)分(特異性+靈敏性)的增力口，其使用用于良性小結(jié)-肺癌組的樸素貝葉斯分類(lèi)。
[0069]圖5示出對(duì)于良性小結(jié)對(duì)照組(實(shí)線(xiàn))和肺癌疾病組(虛線(xiàn))，作為log轉(zhuǎn)化的RFU形式的累積分布函數(shù)(cdf)的SCFsR的測(cè)量的生物標(biāo)記分布，以及它們的曲線(xiàn)擬合為正態(tài)cdf (短劃線(xiàn))，以用于訓(xùn)練(train)樸素貝葉斯分類(lèi)器。
[0070]圖6示出與本文所述的各種計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法一起使用的示例計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。
[0071]圖7是一實(shí)施方案的指示個(gè)體患有肺癌的似然性的方法的流程圖。
[0072]圖8是一實(shí)施方案的指示個(gè)體患有肺癌的似然性的方法的流程圖。
[0073]圖9示出可以用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中一個(gè)或多個(gè)肺癌生物標(biāo)記的示例適配體測(cè)定。
[0074]圖10示出從聚集的潛在生物標(biāo)記的集合使用哪些生物標(biāo)記來(lái)構(gòu)建分類(lèi)器以區(qū)分NSCLC與良性小結(jié)的頻率的柱狀圖。
[0075]圖11示出從聚集的潛在生物標(biāo)記的集合使用哪些生物標(biāo)記來(lái)構(gòu)建分類(lèi)器以區(qū)分NSCLC與無(wú)癥狀吸煙者的頻率的柱狀圖。
[0076]圖12示出從位點(diǎn)一致(site-consistent)的潛在生物標(biāo)記的集合使用哪些生物標(biāo)記來(lái)構(gòu)建分類(lèi)器以區(qū)分NSCLC與良性小結(jié)的頻率的柱狀圖。
[0077]圖13示出從位點(diǎn)一致的潛在生物標(biāo)記的集合使用哪些生物標(biāo)記來(lái)構(gòu)建分類(lèi)器以區(qū)分NSCLC與無(wú)癥狀吸煙者的頻率的柱狀圖。
[0078]圖14示出從得自聚集和位點(diǎn)一致的標(biāo)記組合的潛在生物標(biāo)記的集合使用哪些生物標(biāo)記來(lái)構(gòu)建分類(lèi)器以區(qū)分NSCLC與良性小結(jié)的頻率的柱狀圖。
[0079]圖15示出從得自聚集和位點(diǎn)一致的標(biāo)記組合的潛在生物標(biāo)記的集合使用哪些生物標(biāo)記來(lái)構(gòu)建分類(lèi)器以區(qū)分NSCLC與無(wú)癥狀吸煙者的頻率的柱狀圖。
[0080]圖16示出得自pull-down實(shí)驗(yàn)的凝膠圖像，其示出作為蛋白LBP、C9和IgM的捕獲劑的適配體的特異性。對(duì)于每個(gè)凝膠，泳道I是來(lái)自鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖珠的洗脫物，泳道2是最終洗脫物，泳道是欄標(biāo)記泳道(主要條帶從上至下是110、50、30、15和
3.5kDa)。
[0081]圖17A示出一對(duì)柱狀圖，其總結(jié)了使用表I第5列(實(shí)線(xiàn))所列的生物標(biāo)記和隨機(jī)標(biāo)記的集合(虛線(xiàn))的所有可能的單蛋白樸素貝葉斯分類(lèi)器評(píng)分(靈敏性+特異性)。
[0082]圖17B示出一對(duì)柱狀圖，其總結(jié)了使用表I第5列(實(shí)線(xiàn))所列的生物標(biāo)記和隨機(jī)標(biāo)記的集合(虛線(xiàn))的所有可能的二蛋白樸素貝葉斯分類(lèi)器評(píng)分(靈敏性+特異性)。
[0083]圖17C示出一對(duì)柱狀圖，其總結(jié)了使用表I第5列(實(shí)線(xiàn))所列的生物標(biāo)記和隨機(jī)標(biāo)記的集合(虛線(xiàn))的所有可能的三蛋白樸素貝葉斯分類(lèi)器評(píng)分(靈敏性+特異性)。
[0084]圖18A示出一對(duì)柱狀圖，其總結(jié)了使用表I第6列(實(shí)線(xiàn))所列的生物標(biāo)記和隨機(jī)標(biāo)記的集合(虛線(xiàn))的所有可能的單蛋白樸素貝葉斯分類(lèi)器評(píng)分(靈敏性+特異性)。
[0085]圖18B示出一對(duì)柱狀圖，其總結(jié)了使用表I第6列(實(shí)線(xiàn))所列的生物標(biāo)記和隨機(jī)標(biāo)記的集合(虛線(xiàn))的所有可能的二蛋白樸素貝葉斯分類(lèi)器評(píng)分(靈敏性+特異性)。
[0086]圖18C示出一對(duì)柱狀圖，其總結(jié)了使用表I第6列(實(shí)線(xiàn))所列的生物標(biāo)記和隨機(jī)標(biāo)記的集合(虛線(xiàn))的所有可能的三蛋白樸素貝葉斯分類(lèi)器評(píng)分(靈敏性+特異性)。
[0087]圖19A示出使用選自完全組(?)的2-10個(gè)標(biāo)記的樸素貝葉斯分類(lèi)器的靈敏性+特異性評(píng)分，以及通過(guò)在用于良性小結(jié)對(duì)照組的分類(lèi)器產(chǎn)生期間放棄最好的5個(gè)(■)、10個(gè)(▲)和15個(gè)(X)標(biāo)記獲得的評(píng)分。
[0088]圖19B示出使用選自完全組(?)的2-10個(gè)標(biāo)記的樸素貝葉斯分類(lèi)器的靈敏性+特異性評(píng)分，以及通過(guò)在用于吸煙者對(duì)照組的分類(lèi)器產(chǎn)生期間放棄最好的5個(gè)(■ )、10個(gè)(▲)和15個(gè)(X)標(biāo)記獲得的評(píng)分。
[0089]圖20A示出一組ROC曲線(xiàn)，其從表38和39中的數(shù)據(jù)對(duì)I至5個(gè)標(biāo)記的組建模。
[0090]圖20B示出一組ROC曲線(xiàn)，其從對(duì)圖19A的I至5個(gè)標(biāo)記的組訓(xùn)練數(shù)據(jù)計(jì)算。
[0091]發(fā)明詳述
[0092]現(xiàn)在詳細(xì)描述本發(fā)明的代表性實(shí)施方案。雖然本發(fā)明結(jié)合列舉的實(shí)施方案進(jìn)行描述，但是應(yīng)理解本發(fā)明并不限于這些實(shí)施方案。相反，本發(fā)明旨在涵蓋可包含在如權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明范圍內(nèi)的所有替代、修飾和等價(jià)物。
[0093]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識(shí)到與本文所述的方法和材料相似或等價(jià)的許多方法和材料可用于或在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明決不限于本文描述的方法和材料。
[0094]除非特別說(shuō)明，本文所用技術(shù)和學(xué)術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常了解的相同含義。盡管與本文所述的方法、裝置和材料相似或等價(jià)的任何方法、裝置和材料可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但是現(xiàn)在描述一些優(yōu)選的方法、裝置和材料。
[0095]本申請(qǐng)書(shū)中列舉的所有出版物、公開(kāi)的專(zhuān)利文件和專(zhuān)利申請(qǐng)均表示本申請(qǐng)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。本文列舉的所有出版物、公開(kāi)的專(zhuān)利文件和專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖艘匀缤總€(gè)單獨(dú)的出版物、公開(kāi)的專(zhuān)利文件或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e且單獨(dú)指示相同的程度并入本文作參考。
[0096]如在包括所附權(quán)利要求書(shū)在內(nèi)的本申請(qǐng)中所用，除非特別說(shuō)明，單數(shù)形式“一個(gè)(a)”、“一個(gè)(an)”和“這個(gè)(the) ”包括復(fù)數(shù)形式，且與“至少一個(gè)”和“一個(gè)或多個(gè)”可以互換使用。因此，提及的“一個(gè)適配體”包括適配體的混合物，提及的“探針”包括探針的混合物等。
[0097]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“約”表示數(shù)值的不明顯更改或變化，由此該數(shù)值所涉及的項(xiàng)目的基本功能未改變。
[0098]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包含(comprises) ”、“包含(comprising) ”、“包括(includes) ”、“包括(including) ”、“含有(contains) ”、“含有(containing) ”及它們的任何變體意圖覆蓋非排他的包含，由此包含、包括或含有一個(gè)元件或者一系列元件的過(guò)程、方法、方法限定產(chǎn)品或組成(composit1n of matter)不僅包括這些元件,而且可以包括未明確列舉或這樣的過(guò)程、方法、方法限定產(chǎn)品或組成固有的其他元件。
[0099]本發(fā)明包括用于檢測(cè)和診斷肺癌的生物標(biāo)記、方法、裝置、試劑、系統(tǒng)和試劑盒。
[0100]在一方面，本發(fā)明提供了一種或多種生物標(biāo)記，其單獨(dú)或以各種組合用于診斷肺癌，允許區(qū)分診斷肺小結(jié)是良性或惡性的，監(jiān)測(cè)肺癌復(fù)發(fā)或?qū)ぶ?address)其他臨床指征。如下文詳細(xì)描述，示例性實(shí)施方案包括表I第2列提供的生物標(biāo)記，這些生物標(biāo)記使用基于多重適配體的測(cè)定來(lái)鑒定，所述測(cè)定在實(shí)施例1中，更特別是在實(shí)施例2中描述。
[0101]表I第2列列出得自以下分析的發(fā)現(xiàn):來(lái)自NSCLC癌癥病例的幾百個(gè)個(gè)體血液樣品以及來(lái)自吸煙者和來(lái)自診斷為具有良性肺小結(jié)的個(gè)體的幾百個(gè)等價(jià)個(gè)體血液樣品。吸煙者和良性小結(jié)組的設(shè)計(jì)使得肺癌診斷測(cè)試與群體匹配可以具有最大益處。(這些病例和對(duì)照得自多個(gè)臨床場(chǎng)所以模擬這樣的測(cè)試可以應(yīng)用的真實(shí)世界條件的范圍)。潛在的生物標(biāo)記在單獨(dú)的樣品而不是在混合疾病和對(duì)照血液中測(cè)量；這允許更好地理解與疾病(在這種情況下是肺癌)的存在和不存在相關(guān)的表型中個(gè)體和組的變化。由于對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行800個(gè)以上的蛋白測(cè)量，并且單獨(dú)測(cè)量來(lái)自每個(gè)疾病和對(duì)照群體的幾百個(gè)樣品，所以表I第2列得自非常大的數(shù)據(jù)集合的分析。使用本文“生物標(biāo)記的分類(lèi)和疾病評(píng)分計(jì)算”章節(jié)中描述的方法分析測(cè)量結(jié)果。
[0102]表I第2列列出了發(fā)現(xiàn)可用于區(qū)分得自NSCLC個(gè)體的樣品與得自吸煙者和良性肺小結(jié)個(gè)體的“對(duì)照”樣品的生物標(biāo)記。使用本文所述的多重適配體測(cè)定，發(fā)現(xiàn)了 38個(gè)生物標(biāo)記，其區(qū)分得自患有肺癌的個(gè)體的樣品與得自吸煙者對(duì)照組中個(gè)體的樣品(見(jiàn)表I第6列)。相似地，使用多重適配體測(cè)定，發(fā)現(xiàn)了 40個(gè)生物標(biāo)記，其區(qū)分得自NSCLC個(gè)體的樣品與得自具有良性肺小結(jié)的人的樣品(見(jiàn)表I第5列)?？傊@兩列38和40個(gè)生物標(biāo)記由61個(gè)獨(dú)特的生物標(biāo)記組成，因?yàn)閰^(qū)分NSCLC與良性小結(jié)的生物標(biāo)記的列表與區(qū)分NSCLC與不患有肺癌的吸煙者的生物標(biāo)記的列表之間有相當(dāng)大的重疊。
[0103]雖然某些所述肺癌生物標(biāo)記可單獨(dú)用于檢測(cè)和診斷肺癌，但是本文還描述了肺癌生物標(biāo)記的多個(gè)子集的分組，其中每個(gè)分組或者子集選擇可作為一組三個(gè)或更多個(gè)生物標(biāo)記使用，這在本文中互換地稱(chēng)為“生物標(biāo)記組”和一組。因此，本申請(qǐng)的各種實(shí)施方案提供了包含N個(gè)生物標(biāo)記的組合，其中N是至少兩個(gè)生物標(biāo)記。在其他實(shí)施方案中，N選自2-61個(gè)生物標(biāo)記。
[0104]仍然在其他實(shí)施方案中，N選自2-7、2-10、2-15、2-20、2-25、2-30、2-35、2-40、
2-45、2-50、2-55或2-61中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自3-7、3-10、3-15、3_20、
3-25、3-30、3-35、3-40、3-45、3-50、3-55或3-61中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自
4-7、4-10、4-15、4-20、4-25,4-30、4-35,4-40、4-45、4-50、4-55或 4_61 中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自 5-7、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55 或 5-61中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自6-10、6-15、6-20、6-25、6-30、6-35、6-40、6-45、
6-50、6-55或6-61中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自7-10、7-15、7-20、7-25、7_30、
7-35、7-40、7-45、7-50、7-55或7-61中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自8_10、8_15、
8-20、8-25、8-30、8-35、8-40、8-45、8-50、8-55或 8-61 中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自 9-15、9-20、9-25、9-30、9-35、9-40、9-45、9-50、9-55 或 9-61 中的任意數(shù)。在其他實(shí)施方案中，N選自 10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55 或 10-61 中的任意數(shù)。應(yīng)理解N可以選自包含類(lèi)似但更高級(jí)的范圍。
[0105]在一實(shí)施方案中，可用于生物標(biāo)記子集或者組的生物標(biāo)記的數(shù)目基于生物標(biāo)記值特定組合的靈敏性和特異性值。本文所用術(shù)語(yǔ)“靈敏性”和“特異性”是關(guān)于基于在個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記值來(lái)正確分類(lèi)個(gè)體患有肺癌或不患有肺癌的能力?！办`敏性”指生物標(biāo)記或多個(gè)生物標(biāo)記關(guān)于正確分類(lèi)患有肺癌的個(gè)體的性能?！疤禺愋浴敝干飿?biāo)記或多個(gè)生物標(biāo)記關(guān)于正確分類(lèi)不患有肺癌的個(gè)體的性能。例如，用于測(cè)試一組對(duì)照樣品和肺癌樣品的一組標(biāo)記的85%特異性和90%靈敏性指85%的對(duì)照樣品由該組正確分類(lèi)為對(duì)照樣品，并且90%的肺癌樣品由該組正確分類(lèi)為肺癌樣品。期望或優(yōu)選的最小值可以如實(shí)施例3所述確定。代表性標(biāo)記組在表2-27中示出，其列出了一系列100個(gè)不同的3-15個(gè)生物標(biāo)記的組，其具有每組的特異性和靈敏性的標(biāo)示水平。這些組中每一個(gè)的每個(gè)標(biāo)記出現(xiàn)的總數(shù)在每個(gè)表的底部示出。
[0106]在一方面，在個(gè)體中通過(guò)以下方法檢測(cè)或診斷肺癌:對(duì)來(lái)自所述個(gè)體的生物學(xué)樣品進(jìn)行測(cè)定，并檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)記ERBB1、LRIG3或SCFsR的至少一個(gè)和選自表I第2列的生物標(biāo)記列表的至少N個(gè)額外的生物標(biāo)記，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在另一方面，在個(gè)體中通過(guò)以下方法檢測(cè)或診斷肺癌:對(duì)來(lái)自所述個(gè)體的生物學(xué)樣品進(jìn)行測(cè)定，并檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)記ERBBl、LRIG3和SCFsR和選自表I第2列的生物標(biāo)記列表的至少N個(gè)額外的生物標(biāo)記之一，其中N等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13。在另一方面，在個(gè)體中通過(guò)以下方法檢測(cè)或診斷肺癌，對(duì)來(lái)自所述個(gè)體的生物學(xué)樣品進(jìn)行測(cè)定，并檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)記ERBBl和選自表I第2列的生物標(biāo)記列表的至少N個(gè)額外的生物標(biāo)記之一，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在另一方面，在個(gè)體中通過(guò)以下方法檢測(cè)或診斷肺癌:對(duì)來(lái)自所述個(gè)體的生物學(xué)樣品進(jìn)行測(cè)定，并檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)記LRIG3和選自表I第2列的生物標(biāo)記列表的至少N個(gè)額外的生物標(biāo)記之一，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在另一方面，在個(gè)體中通過(guò)以下方法檢測(cè)或診斷肺癌:對(duì)來(lái)自所述個(gè)體的生物學(xué)樣品進(jìn)行測(cè)定，并檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)記SCFsR和選自表I第2列的生物標(biāo)記列表的至少N個(gè)額外的生物標(biāo)記之一，其中N等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15。
[0107]本文鑒定的肺癌生物標(biāo)記表示較大數(shù)目的可用于有效檢測(cè)或診斷肺癌的生物標(biāo)記的子集或組的選擇。期望數(shù)目的這類(lèi)生物標(biāo)記的選擇取決于所選生物標(biāo)記的特定組合。重要的是記住:用于檢測(cè)或診斷肺癌的生物標(biāo)記的組也可以包含在表I第2列中未發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)記，并且包含在表I第2列中未發(fā)現(xiàn)的額外的生物標(biāo)記可以減少選自表I第2列的特定子集或組中生物標(biāo)記的數(shù)目。如果額外的生物醫(yī)學(xué)信息與生物標(biāo)記值聯(lián)合用于建立對(duì)于給定測(cè)定可接受的靈敏性和特異性值，則用于子集或組的來(lái)自表I第2列的生物標(biāo)記的數(shù)目也可以減少。
[0108]可能影響用于生物標(biāo)記的子集或組的生物標(biāo)記數(shù)目的另一因素是用于從進(jìn)行肺癌診斷的個(gè)體中獲得生物學(xué)樣品的方法。在精心控制的樣品獲取環(huán)境中，符合期望的靈敏性和特異性值必需的生物標(biāo)記的數(shù)目會(huì)低于在樣品收集、處理和貯存中可以存在更多變化的情況中的數(shù)目。在研究表I第2列所列的生物標(biāo)記列表中，利用多個(gè)樣品收集位點(diǎn)來(lái)收集數(shù)據(jù)以進(jìn)行分類(lèi)器訓(xùn)練。這提供了更穩(wěn)健的生物標(biāo)記，其對(duì)于樣品收集、處理和貯存中的變化較不敏感，但是如果訓(xùn)練數(shù)據(jù)都在非常相似條件下獲得，則還可以要求子集或組中更大的生物標(biāo)記數(shù)目。
[0109]本申請(qǐng)的一方面可以參考圖1A和B來(lái)一般性描述。生物學(xué)樣品獲得自所關(guān)注的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體。然后測(cè)定該生物學(xué)樣品以檢測(cè)所關(guān)注的一個(gè)或多個(gè)(N個(gè))生物標(biāo)記的存在，并確定所述N個(gè)生物標(biāo)記的每一個(gè)的生物標(biāo)記值(在圖1B中稱(chēng)為標(biāo)記RFU)。一旦檢測(cè)生物標(biāo)記并指定生物標(biāo)記值，則如本文詳細(xì)描述地對(duì)每個(gè)標(biāo)記進(jìn)行評(píng)分或者分類(lèi)。然后組合標(biāo)記評(píng)分以提供總診斷評(píng)分，其表示獲取樣品的個(gè)體患有肺癌的似然性。
[0110]如本文所用，“肺(lung) ”與“肺(pulmonary) ”可互換使用。
[0111]如本文所用，“吸煙者”指具有吸煙歷史的個(gè)體。
[0112]“生物學(xué)樣品”、“樣品”和“測(cè)試樣品”在本文可互換使用，指獲得自或以另外的方式源自個(gè)體的任何材料、生物液體、組織或者細(xì)胞。這包括血液(包括全血、白細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、血沉棕黃層(buffy coat)、血漿和血清)、痰液、淚液、粘液、洗鼻液(wash)、鼻抽吸物(aspirate)、呼吸物(breath)、尿液、精液、唾液、腦膜液(meningeal fluid)、羊水、腺體液(glandular fluid)、淋巴液、乳頭抽吸物、支氣管抽吸物、滑液、關(guān)節(jié)抽吸物、細(xì)胞、細(xì)胞提取物和腦脊液。其還包括上述所有材料的實(shí)驗(yàn)分離級(jí)分。例如，血液樣品可以分級(jí)分離為血清或含有諸如紅細(xì)胞或白細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)的特定類(lèi)型血細(xì)胞的級(jí)分。如果需要，樣品可以是來(lái)自個(gè)體的樣品的組合，如組織與液體樣品的組合。術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)樣品”也包括含有均質(zhì)固體材料的材料，如來(lái)自糞便樣品、組織樣品或組織活檢樣品的材料。術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)樣品”也包括源自組織培養(yǎng)或者細(xì)胞培養(yǎng)的材料。可以使用獲得生物學(xué)樣品的任何合適方法；示例性方法包括如靜脈切開(kāi)放血術(shù)、拭子(如口腔拭子)以及細(xì)針抽吸活檢方法。易受細(xì)針抽吸影響的示例性組織包括淋巴結(jié)、肺、肺洗液、BAL(支氣管肺泡灌洗液)、甲狀腺、乳腺和肝。樣品也可以通過(guò)顯微切割(如激光捕獲顯微切割(LCM)或激光顯微切割(LMD))、膀胱沖洗、涂片(如PAP涂片)或?qū)Ч芄嘞词占?。獲得自或源自個(gè)體的“生物學(xué)樣品”包括在獲得自所述個(gè)體之后已經(jīng)通過(guò)任何合適方式處理的任何此類(lèi)樣品。
[0113]此外，應(yīng)認(rèn)識(shí)到生物學(xué)樣品可以通過(guò)從多個(gè)體中取得生物學(xué)樣品并將它們混合或混合每個(gè)個(gè)體的生物學(xué)樣品的等份而獲得?；旌系臉悠房梢宰鳛閬?lái)自單個(gè)個(gè)體的樣品進(jìn)行處理，并且如果在混合的樣品中確定癌癥的存在，則可以將每個(gè)個(gè)體的生物學(xué)樣品再進(jìn)行測(cè)試以確定哪個(gè)/哪些個(gè)體患有肺癌。
[0114]對(duì)于本說(shuō)明書(shū)的目的，短語(yǔ)“歸因于來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品的數(shù)據(jù)”指所述數(shù)據(jù)以某種形式源自所述個(gè)體的生物學(xué)樣品或利用所述個(gè)體的生物學(xué)樣品產(chǎn)生。數(shù)據(jù)在產(chǎn)生后可以被重新格式化、修改或以數(shù)學(xué)方式改變至某種程度，例如通過(guò)從一種測(cè)量系統(tǒng)中的單位轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粶y(cè)量系統(tǒng)中的單位；但是應(yīng)理解，數(shù)據(jù)源自所述生物學(xué)樣品或利用所述生物學(xué)樣品產(chǎn)生。
[0115]“靶標(biāo)”、“靶分子”和“分析物”在本文可互換使用，指可能存在于生物學(xué)樣品中的任何所關(guān)注的分子。“所關(guān)注的分子”包括特定分子的任何微小變化，如在蛋白的情況下，例如氨基酸序列的微小變化、二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙?；?、磷酸化或者任何其他操作或修飾，如與基本不改變分子同一性的標(biāo)記組分偶聯(lián)?！鞍蟹肿印薄ⅰ鞍袠?biāo)”或“分析物”是一種類(lèi)型或種類(lèi)的分子或多分子結(jié)構(gòu)的一組拷貝?！鞍蟹肿印?、“靶標(biāo)”和“分析物”指一組以上這樣的分子。示例性靶分子包括蛋白、多肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、affybodies、抗體模擬物(mimic)、病毒、病原體、毒性物質(zhì)、底物、代謝物、過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、營(yíng)養(yǎng)素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞、組織以及前述物質(zhì)的任何片段或部分。
[0116]如本文所用，“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可互換使用，指任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。聚合物可以是線(xiàn)性或支化的，其可以包含修飾的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中斷。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋已經(jīng)被天然修飾或者通過(guò)干預(yù)修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修飾，如與標(biāo)記組分偶聯(lián)。該定義還包括例如含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類(lèi)似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知的其他修飾的多肽。多肽可以是單鏈或締合(associated)鏈。該定義還包括前蛋白和完整的成熟蛋白；源生自成熟蛋白的肽或多肽；蛋白的片段；剪接變體；蛋白的重組形式；具有氨基酸修飾、缺失或取代的蛋白變體；消化；以及翻譯后修飾，如糖基化、乙酰化、磷酸化等。
[0117]如本文所用，“標(biāo)記”和“生物標(biāo)記”可互換使用，指指示個(gè)體中正常或異常過(guò)程或者個(gè)體中疾病或其他病癥的跡象或者是個(gè)體中正?；虍惓＿^(guò)程或者個(gè)體中疾病或其他病癥的跡象的的靶分子。更具體地，“標(biāo)記”或“生物標(biāo)記”是與無(wú)論正常與否的特定生理狀態(tài)或過(guò)程的存在相關(guān)的解剖學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)或分子參數(shù)，并且如果是異常的，則無(wú)論是慢性或急性的。生物標(biāo)記可以通過(guò)各種方法檢測(cè)和測(cè)量，包括實(shí)驗(yàn)室測(cè)定和醫(yī)學(xué)成像。當(dāng)生物標(biāo)記是蛋白時(shí)，也可以使用對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)作為生物學(xué)樣品中對(duì)應(yīng)蛋白生物標(biāo)記的量或存在或不存在或者編碼該生物標(biāo)記的基因或控制該生物標(biāo)記表達(dá)的蛋白的甲基化狀態(tài)的替代測(cè)量。
[0118]如本文所用，“生物標(biāo)記值”、“值”、“生物標(biāo)記水平”和“水平”在本文可互換使用，指使用任何分析方法來(lái)檢測(cè)生物學(xué)樣品中的生物標(biāo)記而進(jìn)行的測(cè)量，其示出所述生物學(xué)樣品中的生物標(biāo)記、對(duì)于所述生物標(biāo)記或?qū)?yīng)于所述生物標(biāo)記的存在、不存在、絕對(duì)量或濃度、相對(duì)量或濃度、效價(jià)、水平、表達(dá)水平、測(cè)量水平的比率等。所述“值”或“水平”的確切性質(zhì)取決于用于檢測(cè)生物標(biāo)記的特定分析方法的具體設(shè)計(jì)和組分。
[0119]當(dāng)生物標(biāo)記表示個(gè)體中異常過(guò)程或疾病或其他病癥或者是個(gè)體中異常過(guò)程或疾病或其他病癥的跡象時(shí)，該生物標(biāo)記通常描述為與表示個(gè)體中正常過(guò)程或不存在疾病或其他病癥或者是個(gè)體中正常過(guò)程或不存在疾病或其他病癥的跡象的生物標(biāo)記的表達(dá)水平或值相比時(shí)是過(guò)表達(dá)或低表達(dá)的。“上調(diào)”、“上調(diào)的”、“過(guò)表達(dá)”、“過(guò)表達(dá)的”及其任何變體在本文可互換使用，指生物學(xué)樣品中生物標(biāo)記的值或水平高于通常在來(lái)自健康或正常個(gè)體的相似生物學(xué)樣品中檢測(cè)的所述生物標(biāo)記的值或水平(或者值或水平的范圍)。該術(shù)語(yǔ)也可以指生物學(xué)樣品中生物標(biāo)記的值或水平高于在特定疾病的不同階段檢測(cè)的生物標(biāo)記的值或水平(或者值或水平的范圍)。
[0120]“下調(diào)”、“下調(diào)的”、“低表達(dá)”或“表達(dá)低的”及其任何變體在本文可互換使用，指生物學(xué)樣品中生物標(biāo)記的值或水平低于通常在來(lái)自健康或正常個(gè)體的相似生物學(xué)樣品中檢測(cè)的生物標(biāo)記的值或水平(或者值或水平的范圍)。該術(shù)語(yǔ)也指生物學(xué)樣品中生物標(biāo)記的值或水平低于在特定疾病的不同階段檢測(cè)的所述生物標(biāo)記的值或水平(或者值或水平的范圍)。
[0121]此外，過(guò)表達(dá)的或低表達(dá)的生物標(biāo)記也可以指與所述生物標(biāo)記的“正常”表達(dá)水平或值相比是“差異表達(dá)的”或具有“不同水平”或“不同值”，所述“正?！北磉_(dá)水平或值表示個(gè)體中正常過(guò)程或不存在疾病或其他病癥或者是個(gè)體中正常過(guò)程或不存在疾病或其他病癥的跡象。因此，生物標(biāo)記的“差異表達(dá)”也可以指與所述生物標(biāo)記的“正?！北磉_(dá)水平不同。
[0122]術(shù)語(yǔ)“不同的基因表達(dá)”和“差異表達(dá)”在本文可互換使用，指在患有指定疾病的對(duì)象中基因(或其對(duì)應(yīng)蛋白表達(dá)產(chǎn)物)的表達(dá)被激活至相對(duì)于其在正常或?qū)φ諏?duì)象中的表達(dá)較高或較低的水平。該術(shù)語(yǔ)還包括基因(或其對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)產(chǎn)物)的表達(dá)在相同疾病的不同各階段被激活至較高或較低水平。也應(yīng)理解差異表達(dá)的基因可以在核酸水平或蛋白水平激活或抑制，或者可以進(jìn)行可變剪接以獲得不同的多肽產(chǎn)物。這樣的差異可以通過(guò)許多改變證實(shí)，包括多肽的mRNA水平、表面表達(dá)、分泌或其他分配(partit1ning)。不同的基因表達(dá)可以包括比較兩個(gè)或更多個(gè)基因或者它們的基因產(chǎn)物之間的表達(dá)；或者比較兩個(gè)或更多個(gè)基因或者它們的基因產(chǎn)物之間的表達(dá)的比率；或者甚至比較相同基因的兩種不同的加工產(chǎn)物，其在正常對(duì)象與患病對(duì)象之間或者在相同疾病的不同階段之間是不同的。差異表達(dá)包括在例如正常和患病細(xì)胞或者經(jīng)歷不同疾病事件或疾病階段的細(xì)胞中的基因或其表達(dá)產(chǎn)物在時(shí)間或細(xì)胞表達(dá)模式中的定量以及定性的差異。
[0123]如本文所用，“個(gè)體”指測(cè)試對(duì)象或患者。個(gè)體可以是哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物個(gè)體可以是人或非人。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體是人。健康或正常個(gè)體是其中通過(guò)常規(guī)診斷方法未檢測(cè)出所關(guān)注的疾病或病癥(包括例如肺疾病、肺相關(guān)疾病或其他肺病癥)的個(gè)體。
[0124]“診斷(Diagnose) ”、“診斷(diagnosing) ”、“診斷(diagnosis) ”及其變體指基于個(gè)體相關(guān)的一種或多種跡象、癥狀、數(shù)據(jù)或其他信息對(duì)所述個(gè)體的健康狀況或病癥的檢測(cè)、確定或識(shí)別。個(gè)體的健康狀況可以診斷為健康/正常(即診斷為不存在疾病或病癥)或者診斷為患病/異常(即診斷為存在疾病或病癥或者對(duì)疾病或者病癥的特性的評(píng)價(jià))。對(duì)于特定疾病或病癥，術(shù)語(yǔ)“診斷(Diagnose) ”、“診斷(diagnosing) ”、“診斷(diagnosis) ”等涵蓋對(duì)疾病的初始檢測(cè)；對(duì)疾病的表征或分類(lèi)；疾病進(jìn)展、緩解或復(fù)發(fā)的檢測(cè)；以及在給予個(gè)體治療或療法后疾病應(yīng)答的檢測(cè)。肺癌的診斷包括區(qū)分患有癌癥與不患有癌癥的個(gè)體，包括吸煙者和非吸煙者。其還包括區(qū)分良性肺小結(jié)與癌性肺小結(jié)。
[0125]“預(yù)后(Prognose) ”、“預(yù)后(prognosing) ”、“預(yù)后(prognosis) ”及其變體指預(yù)測(cè)患有疾病或病癥的個(gè)體中所述疾病或病癥的未來(lái)進(jìn)程(如預(yù)測(cè)患者存活)，這個(gè)術(shù)語(yǔ)涵蓋在給予個(gè)體治療或療法后評(píng)價(jià)疾病的應(yīng)答。
[0126]“評(píng)價(jià)(Evaluate) ”、“評(píng)價(jià)(evaluating) ”、“評(píng)價(jià)(evaluat1n) ” 及其變體涵蓋“診斷”和“預(yù)后”，也涵蓋對(duì)不患病個(gè)體的疾病或病癥的未來(lái)進(jìn)程的確定或預(yù)測(cè)以及確定或者預(yù)測(cè)在表面上已經(jīng)治愈疾病的個(gè)體中所述疾病或病癥復(fù)發(fā)的似然性。術(shù)語(yǔ)“評(píng)價(jià)”還包括評(píng)價(jià)個(gè)體對(duì)療法的應(yīng)答，例如預(yù)測(cè)個(gè)體是否可能對(duì)治療劑順利地應(yīng)答，或者不大可能對(duì)治療劑應(yīng)答(或者會(huì)例如經(jīng)歷毒性或其他不期望的副作用)；選擇給予個(gè)體的治療劑；或者監(jiān)測(cè)或確定個(gè)體對(duì)已經(jīng)給予該個(gè)體的療法的應(yīng)答。因此，“評(píng)價(jià)”肺癌可以包括例如以下任何方面:預(yù)后個(gè)體中肺癌的未來(lái)進(jìn)程；預(yù)測(cè)表面上已經(jīng)治愈肺癌的個(gè)體中肺癌的復(fù)發(fā)；或者確定或預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)于肺癌治療的應(yīng)答；或者基于確定源自個(gè)體生物學(xué)樣品的生物標(biāo)記值來(lái)選擇給予該個(gè)體的肺癌治療。
[0127]任何如下實(shí)例均可以稱(chēng)作“診斷”或“評(píng)價(jià)”肺癌:最初檢測(cè)肺癌的存在或不存在；確定肺癌的具體階段、類(lèi)型或亞型或者其他分類(lèi)或特性；確定肺小結(jié)是良性病變或惡性肺腫瘤；或者檢測(cè)/監(jiān)測(cè)肺癌進(jìn)展(如監(jiān)測(cè)肺腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移擴(kuò)散)、緩解或復(fù)發(fā)。
[0128]如本文所用，“額外的生物醫(yī)學(xué)信息”指除了使用本文所述任何生物標(biāo)記之外的對(duì)個(gè)體所做的與肺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)評(píng)價(jià)?！邦~外的生物醫(yī)學(xué)信息”包括如下任何方面:個(gè)體的物理描述(physical descriptor)、通過(guò)CT成像觀(guān)察到的肺小結(jié)的物理描述、個(gè)體的身高和/或體重、個(gè)體的性別、個(gè)體的種族、吸煙史、職業(yè)史、暴露于已知致癌物(如暴露于任何石棉、氡氣、化學(xué)品、來(lái)自火的煙以及空氣污染，這可包括來(lái)自靜止或移動(dòng)來(lái)源的排放物，如工業(yè)/工廠(chǎng)或汽車(chē)/海運(yùn)/飛機(jī)排放物)、暴露于二手煙、肺癌(或其他癌癥)家族史、肺小結(jié)的存在、小結(jié)的大小、小結(jié)的部位、小結(jié)的形態(tài)學(xué)(如通過(guò)CT成像、磨玻璃影(GGO)觀(guān)察，實(shí)體、非實(shí)體)、小結(jié)的邊界特點(diǎn)(如平滑、分葉、銳利及光滑、針狀、浸潤(rùn))等。吸煙史通常以術(shù)語(yǔ)“包年(pack year)”量化，其指一個(gè)人吸煙的年數(shù)乘以每天吸煙的平均包數(shù)。例如，平均每天吸一包煙共35年的人稱(chēng)作吸煙史為35包年。額外的生物醫(yī)學(xué)信息可以通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)得自個(gè)體，如通過(guò)使用常規(guī)患者問(wèn)卷調(diào)查或健康史問(wèn)卷調(diào)查等得自個(gè)體自身，或者得自醫(yī)學(xué)從業(yè)人員等?；蛘?，額外的生物醫(yī)學(xué)信息可以得自常規(guī)成像技術(shù)，包括CT成像(如低劑量CT成像)和X-射線(xiàn)檢查。生物標(biāo)記水平的測(cè)試聯(lián)合任何額外的生物醫(yī)學(xué)信息的評(píng)價(jià)與單獨(dú)測(cè)試生物標(biāo)記或單獨(dú)評(píng)價(jià)額外的生物醫(yī)學(xué)信息的任何特定項(xiàng)目(如單獨(dú)的CT成像)相比，可以例如改善檢測(cè)肺癌(或其他肺癌相關(guān)用途)的靈敏性、特異性和/或AUC。
[0129]術(shù)語(yǔ)“曲線(xiàn)下面積”或“AUC”指接受者操作特性(ROC)曲線(xiàn)下的面積，這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)均為本領(lǐng)域所熟知。AUC測(cè)量可以用于比較完整數(shù)據(jù)范圍內(nèi)的分類(lèi)器的精確性。具有較大AUC的分類(lèi)器具有較大的能力來(lái)正確分類(lèi)兩個(gè)所關(guān)注的組(如肺癌樣品與正?；?qū)φ諛悠?之間的未知情況。ROC曲線(xiàn)可以用于對(duì)特定特征的性能作圖(如本文描述的任何生物標(biāo)記和/或任何額外的生物醫(yī)學(xué)信息項(xiàng)目)，以在兩個(gè)群體之間進(jìn)行區(qū)分(如患有肺癌的病例與無(wú)肺癌的對(duì)照)。通常，整個(gè)群體(如病例與對(duì)照)的特征數(shù)據(jù)基于單個(gè)特征的值遞增分類(lèi)。然后，對(duì)于該特征的每個(gè)值，計(jì)算數(shù)據(jù)的真陽(yáng)性率和假陽(yáng)性率。真陽(yáng)性率通過(guò)計(jì)數(shù)高于該特征值的病例數(shù)，然后除以病例總數(shù)而確定。假陽(yáng)性率通過(guò)計(jì)數(shù)高于該特征值的對(duì)照數(shù)，然后除以對(duì)照總數(shù)而確定。盡管這個(gè)定義指其中特征在病例中與在對(duì)照中相比升高的情況，但是這個(gè)定義也適用于其中特征在病例中與在對(duì)照中相比降低的情況(在這種情況下，計(jì)數(shù)低于該特征值的樣品)。ROC曲線(xiàn)可以對(duì)單個(gè)特征以及其他單個(gè)輸出產(chǎn)生，例如兩個(gè)或更多個(gè)特征的組合可以是數(shù)學(xué)組合(如加、減、乘等)以提供單個(gè)的和值，該單個(gè)的和值可以在ROC曲線(xiàn)中繪制。此外，其中組合產(chǎn)生單個(gè)輸出值的多個(gè)特征的任意組合可以在ROC曲線(xiàn)中繪制。這些特征的組合可以包括測(cè)試。ROC曲線(xiàn)是測(cè)試的真陽(yáng)性率(靈敏性)對(duì)測(cè)試的假陽(yáng)性率(1-特異性)的作圖。
[0130]如本文所用，“檢測(cè)”或者“確定”生物標(biāo)記值包括使用觀(guān)察和記錄對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)記值的信號(hào)所需的設(shè)備以及產(chǎn)生該信號(hào)所需的材料。在一些實(shí)施方案中，生物標(biāo)記值使用任何合適方法檢測(cè)，包括熒光、化學(xué)發(fā)光、表面等離子共振、表面聲波、質(zhì)譜、紅外線(xiàn)光譜、拉曼光譜、原子力顯微術(shù)、掃描隧道顯微術(shù)、電子化學(xué)檢測(cè)方法、核磁共振、量子點(diǎn)等。
[0131]“固體支持物”在本文指具有分子可以直接或間接，通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵附著的表面的任何支持物。“固體支持物”可以具有各種物理形式，可以包括例如膜;芯片(如蛋白芯片)；玻片(如載玻片或蓋玻片)；柱；空心、固體、半固體、有孔或有腔的顆粒，例如珠；凝膠；纖維，包括光學(xué)纖維材料；基質(zhì)；及樣品容器。示例性樣品容器包括樣品孔、管、毛細(xì)管、小瓶及能夠容納樣品的任何其他容器、溝槽或凹陷。樣品容器可以包含于多樣品平臺(tái)上，如微量滴定板、玻片、微流體裝置等。支持物可以由天然或合成材料、有機(jī)或無(wú)機(jī)材料組成。其上附著捕獲劑的固體支持物的成分通常取決于附著方法(如共價(jià)附著)。其他示例性容器包括微滴和微流體控制的或大量的油/水性乳液，在其中可以進(jìn)行測(cè)定和相關(guān)操作。合適的固體支持物包括例如塑料、樹(shù)脂、多糖、硅石或基于硅石的材料、官能化玻璃、改性的硅、碳、金屬、無(wú)機(jī)玻璃、膜、尼龍、天然纖維(例如絲、羊毛和棉)、聚合物等。包含固體支持物的材料可以包含反應(yīng)基團(tuán)，例如羧基、氨基或羥基以用于捕獲劑的附著。聚合固體支持物可以包括如聚苯乙烯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、丁基橡膠、苯乙烯丁二烯橡膠、天然橡膠、聚乙烯、聚丙烯、(聚)四氟乙烯、(聚)偏氟乙烯、聚碳酸酯和聚甲基戊烯?？梢允褂玫暮线m固體支持物顆粒包括如編碼的顆粒，如Luminex# -型編碼的顆粒、磁性顆粒以及玻璃顆粒。
[0132]生物標(biāo)記的示例性用途
[0133]在一些示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了診斷個(gè)體的肺癌的方法，所述方法通過(guò)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于個(gè)體循環(huán)如血清或血漿中存在的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記值進(jìn)行，并且通過(guò)任何數(shù)目的分析方法進(jìn)行，包括本文所述任何分析方法。這些生物標(biāo)記例如在肺癌個(gè)體中與在無(wú)肺癌個(gè)體中差異表達(dá)。生物標(biāo)記在個(gè)體中的差異表達(dá)的檢測(cè)可以用于例如早期診斷肺癌、區(qū)分良性與惡性肺小結(jié)(例如在計(jì)算機(jī)斷層(CT)掃描上觀(guān)察到的小結(jié))、監(jiān)測(cè)肺癌復(fù)發(fā)或者用于其他臨床指征。
[0134]本文所述的任何生物標(biāo)記可以用于肺癌的各種臨床指征，包括如下任何方面:檢測(cè)肺癌(如在高危個(gè)體或人群中)；表征肺癌(如確定肺癌類(lèi)型、亞型或階段)，如通過(guò)區(qū)分非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)與小細(xì)胞肺癌(SCLC)和/或區(qū)分腺癌與鱗狀細(xì)胞癌(或者促進(jìn)組織病理學(xué))；確定肺小結(jié)是良性小結(jié)或惡性肺腫瘤；確定肺癌預(yù)后；監(jiān)測(cè)肺癌進(jìn)展或緩解；監(jiān)測(cè)肺癌復(fù)發(fā)；監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移；治療選擇；監(jiān)測(cè)對(duì)治療劑或其他治療的應(yīng)答；對(duì)個(gè)體的計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)篩查進(jìn)行分層(stratificat1n)(如鑒定面臨較高肺癌風(fēng)險(xiǎn)的那些個(gè)體，從而更可能得益于螺旋CT篩查，因此增加CT的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值)；將生物標(biāo)記測(cè)試與諸如吸煙史等的額外的生物醫(yī)學(xué)信息組合，或者與小結(jié)大小、形態(tài)學(xué)等組合(如提供與單獨(dú)的CT測(cè)試或生物標(biāo)記測(cè)試相比具有增加的診斷性能的測(cè)定)；促進(jìn)診斷肺小結(jié)為惡性或良性；促進(jìn)在CT上觀(guān)察到肺小結(jié)就做出臨床決定(例如，如果小結(jié)被視為低風(fēng)險(xiǎn)的，例如如果基于生物標(biāo)記的測(cè)試是陰性的，有或無(wú)小結(jié)大小的歸類(lèi)，則要求重復(fù)CT掃描；或者，如果小結(jié)被視為中等至高風(fēng)險(xiǎn)的，例如如果基于生物標(biāo)記的測(cè)試是陽(yáng)性的，有或無(wú)小結(jié)大小的歸類(lèi)，則考慮進(jìn)行活組織檢查)；以及促進(jìn)決定臨床后續(xù)處理(如在CT上觀(guān)察到未鈣化小結(jié)后是否實(shí)施重復(fù)CT掃描、細(xì)針活組織檢查或胸廓切開(kāi)術(shù))。生物標(biāo)記測(cè)試可以改善單獨(dú)的CT篩查的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)。除了聯(lián)合CT篩查之外，本文所述的生物標(biāo)記也可以與用于與肺癌的任何其他成像方式如胸部X-射線(xiàn)檢查聯(lián)合使用。此外，所述生物標(biāo)記也可以用于在通過(guò)成像方式或其他臨床相關(guān)性檢測(cè)肺癌指征之前或者在癥狀出現(xiàn)之前允許這些應(yīng)用的某一些。
[0135]本文所述的生物標(biāo)記可以用于診斷肺癌的示例性方式是:未知患有肺癌的個(gè)體中一個(gè)或多個(gè)所述生物標(biāo)記的差異表達(dá)可以表明該個(gè)體患有肺癌，從而使得可以在治療最有效的疾病早期檢測(cè)肺癌，也許在通過(guò)其他方式檢測(cè)肺癌之前或者在癥狀出現(xiàn)之前檢測(cè)肺癌。肺癌期間一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記的過(guò)表達(dá)可以指示肺癌的進(jìn)展，如肺腫瘤生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移(因此表示不良預(yù)后)；而一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記差異表達(dá)程度的降低(即在隨后的生物標(biāo)記測(cè)試中，個(gè)體中的表達(dá)水平趨向或接近“正常”表達(dá)水平)可以指示肺癌的緩解，如肺腫瘤縮小(因此提示良好或較好的預(yù)后)。相似地，在肺癌治療期間一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記差異表達(dá)的程度增加(即在隨后的生物標(biāo)記測(cè)試中，個(gè)體中的表達(dá)水平進(jìn)一步遠(yuǎn)離“正?！北磉_(dá)水平)可以指示肺癌的進(jìn)展，并因此表示所述治療是無(wú)效的；而在肺癌治療期間一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記的差異表達(dá)降低可以指示肺癌的緩解，并因此表示該治療是成功的。此外，在個(gè)體看起來(lái)已經(jīng)治愈肺癌之后一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記的差異表達(dá)增加或降低可指示肺癌的復(fù)發(fā)。在這種情況下，例如可以在早期對(duì)個(gè)體重新啟動(dòng)治療(或者如果個(gè)體維持治療，則修改治療方案以增加劑量和/或頻率)，否則直至晚期還未檢測(cè)到肺癌的復(fù)發(fā)。此外，個(gè)體中一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記的差異表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)特定治療劑的應(yīng)答。在監(jiān)測(cè)肺癌復(fù)發(fā)或進(jìn)展中，生物標(biāo)記表達(dá)水平的改變可以指示需要重復(fù)成像(如重復(fù)CT掃描)，例如來(lái)確定肺癌活性或確定需要改變治療方案。
[0136]本文所述的任何生物標(biāo)記的檢測(cè)可以在肺癌治療后使用或者與肺癌治療聯(lián)合使用，如評(píng)價(jià)治療的成功或者監(jiān)測(cè)治療后肺癌的緩解、復(fù)發(fā)和/或進(jìn)展(包括轉(zhuǎn)移)。肺癌治療可以包括例如給予個(gè)體治療劑、進(jìn)行手術(shù)(如手術(shù)切除至少一部分肺腫瘤)、給予放療或本領(lǐng)域所用的任何其他類(lèi)型肺癌治療方法以及這些治療的任意組合。例如，任何生物標(biāo)記可以在治療后檢測(cè)至少一次，或者在治療后檢測(cè)多次(如定期檢測(cè))，或者可以在治療之前和之后檢測(cè)。個(gè)體中任何生物標(biāo)記隨時(shí)間的差異表達(dá)水平可以指示肺癌的進(jìn)展、緩解或復(fù)發(fā)，其實(shí)例包括如下方面:生物標(biāo)記的表達(dá)水平在治療后與治療前相比增加或降低；生物標(biāo)記的表達(dá)水平在治療后較晚時(shí)間點(diǎn)與治療后較早時(shí)間點(diǎn)相比增加或降低；以及生物標(biāo)記的表達(dá)水平在治療后的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)與該生物標(biāo)記的正常水平相比不同。
[0137]作為具體的實(shí)例，本文所述的任何生物標(biāo)記的生物標(biāo)記水平可以在手術(shù)前和手術(shù)后(例如手術(shù)后2-4周)的血清樣品中確定。手術(shù)后樣品與手術(shù)前樣品相比生物標(biāo)記表達(dá)水平的增加可以指示肺癌的進(jìn)展(如不成功的手術(shù))；而手術(shù)后樣品與手術(shù)前樣品相比生物標(biāo)記表達(dá)水平的降低可以指示肺癌的消退(如成功除去肺腫瘤的手術(shù))。生物標(biāo)記水平的類(lèi)似分析可以在其他形式治療之前和之后進(jìn)行，如在放療或者給予治療劑或癌癥疫苗之前和之后進(jìn)行。
[0138]除了作為獨(dú)立運(yùn)行的診斷測(cè)試的生物標(biāo)記水平測(cè)試之外，生物標(biāo)記水平也可以聯(lián)合SNP或者指示疾病易感性風(fēng)險(xiǎn)增加的其他遺傳病變或變異性的確定進(jìn)行(見(jiàn)例如Amoset al., Nature Genetics 40,616-622(2009))。
[0139]除了作為獨(dú)立運(yùn)行的診斷測(cè)試的生物標(biāo)記水平測(cè)試之外，生物標(biāo)記水平也可以聯(lián)合CT篩查進(jìn)行。例如，生物標(biāo)記可以促進(jìn)實(shí)施CT篩查的醫(yī)學(xué)和經(jīng)濟(jì)理由，例如篩查面臨肺癌風(fēng)險(xiǎn)的大量無(wú)臨床癥狀群體(如吸煙者)。例如，生物標(biāo)記水平的“CT前”測(cè)試可以用于分類(lèi)CT篩查的高危個(gè)體，如基于個(gè)體生物標(biāo)記水平來(lái)鑒定面臨肺癌最高危險(xiǎn)并且應(yīng)當(dāng)優(yōu)先進(jìn)行CT篩查的那些個(gè)體。如果實(shí)施CT測(cè)試，則可以測(cè)量一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記的生物標(biāo)記水平(如通過(guò)血清或血漿樣品的適配體測(cè)定確定)，并且可以聯(lián)合額外的生物醫(yī)學(xué)信息來(lái)評(píng)價(jià)診斷評(píng)分(如通過(guò)CT測(cè)試確定腫瘤參數(shù))，以增強(qiáng)單獨(dú)的CT或生物標(biāo)記測(cè)試的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)。確定生物標(biāo)記水平的“CT后”適配體組可以用于確定通過(guò)CT(或其他成像方式)觀(guān)察到的肺小結(jié)是惡性或良性的似然性。
[0140]本文所述的任何生物標(biāo)記的檢測(cè)可以用于CT后測(cè)試。例如，生物標(biāo)記測(cè)試可以顯著消除或降低單獨(dú)CT的測(cè)試假陽(yáng)性數(shù)目。此外，生物標(biāo)記檢測(cè)可以促進(jìn)患者的治療。例如，如果肺小結(jié)的大小小于5_，則生物標(biāo)記測(cè)試的結(jié)果可以使患者在更早的時(shí)間從“觀(guān)察和等待”進(jìn)展至活組織檢查；如果肺小結(jié)為5-9_，則生物標(biāo)記測(cè)試可以排除對(duì)假陽(yáng)性?huà)呙枋褂没罱M織檢查或胸廓切開(kāi)術(shù)；以及如果肺小結(jié)大于10_，則生物標(biāo)記測(cè)試可以排除具有良性小結(jié)的這些患者亞群的手術(shù)。基于生物標(biāo)記測(cè)試在一些患者中排除活組織檢查的需求是有益的，因?yàn)榇嬖谂c小結(jié)活組織檢查相關(guān)的顯著發(fā)病率以及難以根據(jù)小結(jié)的位置獲得小結(jié)組織。相似地，在一些患者中排除手術(shù)的需要，如其小結(jié)實(shí)際上是良性的那些患者，會(huì)避免與手術(shù)相關(guān)的不必要風(fēng)險(xiǎn)和花費(fèi)。
[0141]除了聯(lián)合CT篩查測(cè)試生物標(biāo)記水平之外(如聯(lián)合在CT掃描上觀(guān)察到的肺小結(jié)的大小或其他特征評(píng)價(jià)生物標(biāo)記水平)，關(guān)于生物標(biāo)記的信息也可以聯(lián)合其他類(lèi)型數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，特別是指示個(gè)體患有肺癌風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)據(jù)(如患者臨床史、癥狀、癌癥家族史、諸如個(gè)體是否是吸煙者的風(fēng)險(xiǎn)因素和/或其他生物標(biāo)記的狀況等)。這些不同數(shù)據(jù)可以通過(guò)自動(dòng)化方法評(píng)價(jià)，如計(jì)算機(jī)程序/軟件，其可以在計(jì)算機(jī)或其他設(shè)備/裝置中實(shí)施。
[0142]任何所述的生物標(biāo)記也可以用于成像測(cè)試中。例如，顯像劑可以與任何所述生物標(biāo)記偶聯(lián)，這可以用于輔助肺癌診斷、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展/緩解或轉(zhuǎn)移、監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)或者監(jiān)測(cè)對(duì)治療的應(yīng)答等。
[0143]生物標(biāo)記和生物標(biāo)記值的檢測(cè)和確定
[0144]本文所述的生物標(biāo)記的生物標(biāo)記值可以使用任何已知的分析方法檢測(cè)。在一實(shí)施方案中，生物標(biāo)記值使用捕獲試劑(capture agent)檢測(cè)。如本文所用，“捕獲劑(capturereagent) ”或“捕獲試劑”指能夠特異性結(jié)合生物標(biāo)記的分子。在一些實(shí)施方案中，捕獲劑可以在溶液中暴露于生物標(biāo)記，或者可以暴露于生物標(biāo)記，同時(shí)該捕獲劑固定在固體支持物上。在其他實(shí)施方案中，捕獲劑含有與固體支持物上的第二特征反應(yīng)的特征。在這些實(shí)施方案中，捕獲劑可以在溶液中暴露于生物標(biāo)記，然后該捕獲劑上的特征可以聯(lián)合固體支持物上的第二特征來(lái)將所述生物標(biāo)記固定在固體支持物上。捕獲劑基于進(jìn)行的分析類(lèi)型加以選擇。捕獲劑包括但不限于適配體、抗體、adnectin、錨蛋白、其他抗體模擬物(mimetic)及其他蛋白支架、自身抗體、嵌合物、小分子、F(ab’ )2片段、單鏈抗體片段、Fv片段、單鏈Fv片段、核酸、凝集素、配體-結(jié)合受體、affybodies、納米抗體(nanobodies)、印跡聚合物(imprinted polymer)、高親合性多聚體(avimer)、肽模擬物(peptidomimetic)、激素受體、細(xì)胞因子受體及合成受體以及這些物質(zhì)的修飾物和片段。
[0145]在一些實(shí)施方案中，生物標(biāo)記值使用生物標(biāo)記/捕獲劑復(fù)合物來(lái)檢測(cè)。
[0146]在其他實(shí)施方案中，生物標(biāo)記值得自生物標(biāo)記/捕獲劑復(fù)合物，并且例如作為生物標(biāo)記/捕獲劑相互作用隨后的反應(yīng)結(jié)果間接檢測(cè)，但是依賴(lài)于生物標(biāo)記/捕獲劑復(fù)合物的形成。
[0147]在一些實(shí)施方案中，生物標(biāo)記值從生物學(xué)樣品中的生物學(xué)標(biāo)記直接檢測(cè)。
[0148]在一實(shí)施方案中，生物標(biāo)記使用多重形式檢測(cè)，這允許在生物學(xué)樣品中同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)或更多個(gè)生物標(biāo)記。在多重形式的一實(shí)施方案中，捕獲劑直接或間接、共價(jià)或非共價(jià)地固定在固體支持物上分散的位置。在另一實(shí)施方案中，多重形式使用分離的固體支持物，其中每個(gè)固體支持物具有與該固體支持物相關(guān)的獨(dú)特捕獲劑，例如量子點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，單獨(dú)的裝置用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中待檢測(cè)的多個(gè)生物標(biāo)記的每一個(gè)?？梢耘渲脝为?dú)的裝置以允許同時(shí)處理生物學(xué)樣品中的每個(gè)生物標(biāo)記。例如，可以使用微量滴定板，由此該板中的每個(gè)孔用于獨(dú)特地分析生物學(xué)樣品中待檢測(cè)的多個(gè)生物標(biāo)記之一。
[0149]在一個(gè)或多個(gè)前述實(shí)施方案中，可以使用熒光標(biāo)簽(tag)來(lái)標(biāo)記生物標(biāo)記/捕獲復(fù)合物的組分以允許檢測(cè)生物標(biāo)記值。在一些實(shí)施方案中，使用已知技術(shù)可以將熒光標(biāo)記(fluorescent label)與對(duì)本文所述的任何生物標(biāo)記特異性的捕獲劑偶聯(lián),然后該突光標(biāo)記可以用于檢測(cè)對(duì)應(yīng)的生物標(biāo)記值。合適的熒光標(biāo)記包括稀土元素螯合物、熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺酰、另Il藻藍(lán)蛋白、PBXL-3、Qdot 605、麗絲胺(Lissamine)、藻紅蛋白、德克薩斯紅及其他這樣的化合物。
[0150]在一實(shí)施方案中，突光標(biāo)記是突光染料分子。在一些實(shí)施方案中，突光染料分子包含至少一個(gè)取代的吲哚環(huán)(indolium ring)體系，其中吲哚環(huán)的3-碳上的取代基含有化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)或偶聯(lián)的物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，染料分子包括AlexFluor分子，例如 AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 647、AlexaFluor 680 或 AlexaFluor700。在其他實(shí)施方案中，染料分子包括第一類(lèi)型和第二類(lèi)型的染料分子，如兩種不同的AlexaFluor分子。在其他實(shí)施方案中，染料分子包括第一類(lèi)型和第二類(lèi)型的染料分子，并且兩種染料分子具有不同的發(fā)射光譜。
[0151]熒光可以用與大范圍的測(cè)定形式相容的許多儀器測(cè)量。例如，已經(jīng)設(shè)計(jì)了分光熒光計(jì)來(lái)分析微量滴定板、顯微鏡載玻片、印刷陣列(printed array)、小杯等。見(jiàn)Principlesof Fluorescence Spectroscopy,by J.R.Lakowiczj Springer Science+BusinessMedia,Inc.，2004。 見(jiàn) B1luminescence&Chemiluminescence:Progress&CurrentApplicat1ns ；Philip E.Stanley and Larry J.Kricka editors, World ScientificPublishing Company, January 2002。
[0152]在一個(gè)或多個(gè)前述實(shí)施方案中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽可以任選地用于標(biāo)記生物標(biāo)記/捕獲復(fù)合物的組分以允許檢測(cè)生物標(biāo)記值。合適的化學(xué)發(fā)光材料包括任何草酰氯、Rodamin6G、Ru (bipy) 32+、TMAE (四三(二甲胺基)乙烯(tetrakis (dimethylamino) ethylene))、連苯三酷(1，2，3-三輕基苯(1，2，3-trihydroxibenzene))、光澤精、過(guò)氧草酸酯(peroxyoxalate)、芳基草酸酯、卩丫卩定酯(Acridinium ester)、二氧雜環(huán)丁焼(d1xetane)
坐寸O
[0153]仍然在其他實(shí)施方案中，檢測(cè)方法包括酶/底物組合，其產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)記值的可檢測(cè)信號(hào)。通常，酶催化生色底物的化學(xué)改變，這種改變可以使用多種技術(shù)測(cè)量，包括分光光度法、熒光及化學(xué)發(fā)光。合適的酶包括例如螢光素酶、螢光素、蘋(píng)果酸脫氫酶、脲酶、辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、尿酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、乳過(guò)氧化物酶、微過(guò)氧化物酶等。
[0154]仍然在其他實(shí)施方案中，檢測(cè)方法可以是產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)的熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性核素或酶/底物組合的組合。多種方式的信號(hào)在生物標(biāo)記測(cè)定形式中可以具有獨(dú)特且有利的特性。
[0155]更特別地，本文所述的生物標(biāo)記的生物標(biāo)記值可以使用已知的分析方法來(lái)檢測(cè)，包括單重適配體測(cè)定、多重適配體測(cè)定、單重或多重免疫測(cè)定、mRNA表達(dá)譜、miRNA表達(dá)譜、質(zhì)譜分析、組織學(xué)/細(xì)胞學(xué)方法等，這在下文中詳細(xì)地描述。
[0156]使用基于適配體的測(cè)定確定生物標(biāo)記值
[0157]檢測(cè)和定量生物學(xué)樣品及其他樣品中生理學(xué)上有意義的分子的測(cè)定在科學(xué)研究和衛(wèi)生保健領(lǐng)域是重要的工具。一類(lèi)這樣的測(cè)定包括使用包含固定在固體支持物上的一個(gè)或多個(gè)適配體的微陣列。所述適配體各自能夠以高特異性方式和非常高的親和力結(jié)合靶分子。見(jiàn)例如題為“核酸配體”的美國(guó)專(zhuān)利第5，475，096號(hào)，還見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第6，242，246號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第6，458，543號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第6，503，715號(hào)，這些專(zhuān)利的題目均是“核酸配體診斷生物芯片”。一旦使微陣列與樣品接觸，則適配體結(jié)合所述樣品中存在的它們各自的靶分子，從而允許確定對(duì)應(yīng)于生物標(biāo)記的生物標(biāo)記值。
[0158]如本文所用，“適配體”指對(duì)靶分子具有特異性結(jié)合親和力的核酸。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解到親和力相互作用的問(wèn)題關(guān)鍵程度；然而在本文中，適配體對(duì)其靶標(biāo)的“特異性結(jié)合親和力”指適配體通常以與其結(jié)合測(cè)試樣品中其他組分的親和力相比更高程度的親和力結(jié)合其靶標(biāo)?！斑m配體”是一種類(lèi)型或物種的核酸分子的一系列拷貝，其具有特定的核苷酸序列。適配體可包含任何合適數(shù)目的核苷酸，包括任何數(shù)目的化學(xué)修飾的核苷酸?！斑m配體”指多于一個(gè)的這種系列的分子。不同的適配體可以具有相同或不同數(shù)目的核苷酸。適配體可以是DNA或RNA或化學(xué)修飾的核酸，并且可以是單鏈、雙鏈的或者含有雙鏈區(qū)，以及可以包含較高級(jí)別的結(jié)構(gòu)。適配體也可以是光適配體(photoaptamer),其中該適配體中包含光反應(yīng)性或化學(xué)反應(yīng)性官能團(tuán)以允許其與其對(duì)應(yīng)靶標(biāo)共價(jià)連接。本文公開(kāi)的任何適配體方法可以包括使用特異性結(jié)合相同靶分子的兩種或更多種適配體。如下文進(jìn)一步描述，適配體可以包含標(biāo)簽。如果適配體包含標(biāo)簽，則該適配體的所有拷貝不需要具有相同的標(biāo)簽。此外，如果不同的適配體各自包含標(biāo)簽，則這些不同的適配體可以具有相同的標(biāo)簽或者不同的標(biāo)簽。
[0159]適配體可以使用任何已知方法鑒定，包括SELEX方法。一旦鑒定，則可以根據(jù)任何已知方法制備或合成適配體，這些已知方法包括化學(xué)合成方法和酶促合成方法。
[0160]術(shù)語(yǔ)“SELEX”和“SELEX方法”在本文可互換使用，通常指(I)與(2)的組合，其中(I)是選擇以期望的方式與靶分子相互作用的適配體，例如以高親和力結(jié)合蛋白，(2)是擴(kuò)增那些選擇的核酸。SELEX方法可用于鑒定對(duì)特定靶標(biāo)或生物標(biāo)記具有高親和力的適配體。
[0161]SELEX通常包括制備核酸的候選混合物；使所述候選混合物與期望的靶分子結(jié)合以形成親和力復(fù)合物；分離所述親和力復(fù)合物與未結(jié)合的候選核酸；使核酸與所述親和力復(fù)合物分開(kāi)并分離所述核酸；純化所述核酸；以及鑒定特異性適配體序列。所述方法可以包括多次循環(huán)以進(jìn)一步精制所選適配體的親和力。所述方法可以包括在該方法的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)處的擴(kuò)增步驟。見(jiàn)例如題為“核酸配體”的美國(guó)專(zhuān)利第5，475，096號(hào)。SELEX方法可以用于產(chǎn)生與適配體的靶標(biāo)共價(jià)結(jié)合的適配體，以及與適配體的靶標(biāo)非共價(jià)結(jié)合的適配體。見(jiàn)例如題為“通過(guò)指數(shù)富集的核酸配體的系統(tǒng)進(jìn)化:Chem1-SELEX”的美國(guó)專(zhuān)利第5，705，337號(hào)。
[0162]SELEX方法可以用于鑒定含有修飾的核苷酸的高親和力適配體，所述修飾的核苷酸賦予該適配體改善的特性，例如改善的體內(nèi)穩(wěn)定性或改善的遞送特性。此類(lèi)修飾的實(shí)例包括核糖和/或磷酸和/或堿基位置的化學(xué)取代。通過(guò)SELEX方法鑒定的含有修飾的核苷酸的適配體描述于題為“含有修飾的核苷酸的高親和力核酸配體”的美國(guó)專(zhuān)利第5，660，985號(hào)，其描述了含有在嘧啶的5’-和2’-位置處經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸衍生物的寡核苷酸。見(jiàn)上文，美國(guó)專(zhuān)利第5，580，737號(hào)描述了高特異性適配體，其含有由2’-氨基(2’-NH2)、2’ -氟(2’ -F)和/或2’ -O-甲基(2’ -OMe)修飾的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。還見(jiàn)題為“ SELEX和PH0T0SELEX”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)20090098549，其描述了具有擴(kuò)展的物理和化學(xué)性質(zhì)的核酸文庫(kù)及其在SELEX和photoSELEX中的用途。
[0163]SELEX也可用于鑒定具有期望的解離速率(off-rate)特性的適配體。見(jiàn)題為“產(chǎn)生具有改善的解離速率的適配體的方法”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)20090004667，其描述了產(chǎn)生可以結(jié)合靶分子的適配體的改進(jìn)SELEX方法。描述了產(chǎn)生與各自的靶分子具有較慢解離速率的適配體和光適配體的方法。所述方法包括使候選混合物與靶分子接觸；允許形成核酸-靶標(biāo)復(fù)合物；以及進(jìn)行緩慢解離速率富集過(guò)程，其中具有快解離速率的核酸-靶標(biāo)復(fù)合物解離并不再形成，而具有慢解離速率的復(fù)合物會(huì)保持完整。此外，所述方法包括在產(chǎn)生候選核酸混合物中使用修飾的核苷酸，以產(chǎn)生具有改善的解離速率性能的適配體。
[0164]許多這樣的測(cè)定使用包含光反應(yīng)性官能團(tuán)的適配體，這允許適配體與其靶分子共價(jià)結(jié)合或“光交聯(lián)”。見(jiàn)例如題為“核酸配體診斷生物芯片”的美國(guó)專(zhuān)利第6，544，776號(hào)。這些光反應(yīng)性適配體也稱(chēng)作光適配體。見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第5，763，177號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第6，001，577號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第6，291，184號(hào)，所述專(zhuān)利的題目均是“通過(guò)指數(shù)富集的核酸配體的系統(tǒng)進(jìn)化:核酸配體的光選擇和溶液SELEX”;還見(jiàn)例如題為“核酸配體的光選擇”的美國(guó)專(zhuān)利第6，458，539號(hào)。在使微陣列與樣品接觸并使光適配體具有結(jié)合其靶分子的機(jī)會(huì)之后，將該光適配體光激活并洗滌固體支持物以除去任何非特異性結(jié)合的分子?？梢允褂脟?yán)格洗滌條件，因?yàn)榻Y(jié)合光適配體的靶分子由于該光適配體上光激活的官能團(tuán)所產(chǎn)生的共價(jià)鍵而通常未被除去。在這種方式中，測(cè)定允許檢測(cè)對(duì)應(yīng)于測(cè)試樣品中生物標(biāo)記的生物標(biāo)記值。
[0165]在這兩種測(cè)定形式中，適配體在與樣品接觸之前固定在固體支持物上。然而，在某些情況下，在與樣品接觸之前固定適配體也許無(wú)法提供最佳的測(cè)定。例如，預(yù)固定適配體可能導(dǎo)致適配體與靶分子在固體支持物表面上的無(wú)效混合，這可能導(dǎo)致漫長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間及因此的延長(zhǎng)的孵育時(shí)間以允許適配體與其靶分子有效結(jié)合。此外，當(dāng)光適配體用于測(cè)定并且取決于用作固體支持物的材料時(shí)，該固體支持物可能趨于分散或吸收用于實(shí)現(xiàn)光適配體與其靶分子之間的共價(jià)鍵形成的光。此外，取決于所用的方法，結(jié)合適配體的靶分子的檢測(cè)可能不準(zhǔn)確，因?yàn)楣腆w支持物的表面也可能暴露于且受所用的任何標(biāo)記劑的影響。最后，適配體固定在固體支持物上通常包括在適配體暴露于樣品之前的適配體制備步驟(即固定)，這個(gè)制備步驟可能影響適配體的活性或功能性。
[0166]還描述了適配體測(cè)定，其允許適配體在溶液中捕獲其靶標(biāo)，然后在檢測(cè)之前使用設(shè)計(jì)為除去適配體-靶標(biāo)混合物中特定組分的分離步驟(見(jiàn)題為“測(cè)試樣品的多重分析”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)20090042206)。所述適配體測(cè)定方法允許檢測(cè)和定量測(cè)試樣品中的非核酸靶標(biāo)(如蛋白靶標(biāo))，這通過(guò)檢測(cè)和定量核酸(即適配體)進(jìn)行。所述方法產(chǎn)生核酸替代物(surrogate)(即適配體)以檢測(cè)和定量非核酸靶標(biāo)，由此允許包括擴(kuò)增在內(nèi)的許多核酸技術(shù)用于包括蛋白靶標(biāo)在內(nèi)的更大范圍的期望靶標(biāo)。
[0167]可以構(gòu)建適配體以促進(jìn)從適配體生物標(biāo)記復(fù)合物(或光適配體生物標(biāo)記共價(jià)復(fù)合物)分離測(cè)定組分，以及允許分離適配體以進(jìn)行檢測(cè)和/或定量。在一實(shí)施方案中，這些構(gòu)建體可以包含適配體序列中可裂解或可釋放的元件。在其他實(shí)施方案中，可以在適配體中引入額外的官能性，例如標(biāo)記的或可檢測(cè)的組分、間隔組分或者特異性結(jié)合標(biāo)簽或固定元件。例如，適配體可以包含通過(guò)可裂解部分與適配體連接的標(biāo)簽、標(biāo)記、分隔標(biāo)記與可裂解部分的間隔組分。在一實(shí)施方案中，可裂解元件是光可裂解接頭(linker)。光可裂解接頭可以連接至生物素部分和間隔區(qū)段，可以包含NHS基團(tuán)以用于胺的衍生化，以及可以用于在適配體中弓I入生物素基團(tuán)，從而允許適配體在測(cè)定方法中較晚地釋放。
[0168]用溶液中所有測(cè)定組分進(jìn)行的均質(zhì)測(cè)定在檢測(cè)信號(hào)之前不需要分離樣品與試劑。這些方法是快速且易于使用的。這些方法基于分子捕獲或與特異性靶標(biāo)反應(yīng)的結(jié)合試劑產(chǎn)生信號(hào)。對(duì)于肺癌，分子捕獲劑是適配體或抗體等，特異性靶標(biāo)是表I第2列的肺癌生物標(biāo)記。
[0169]在一實(shí)施方案中，一種信號(hào)產(chǎn)生方法利用由于熒光團(tuán)標(biāo)記的捕獲劑與其特異性生物標(biāo)記靶標(biāo)的相互作用而導(dǎo)致的各向異性信號(hào)改變。當(dāng)標(biāo)記的捕獲劑與其靶標(biāo)反應(yīng)時(shí)，增加的分子量導(dǎo)致附著于該復(fù)合物的熒光團(tuán)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)變得更慢，從而改變各向異性值。通過(guò)監(jiān)測(cè)各向異性改變，結(jié)合事件可以用于定量測(cè)量溶液中的生物標(biāo)記。其他方法包括熒光偏振測(cè)定、分子信標(biāo)方法、時(shí)間分辨熒光猝滅法、化學(xué)發(fā)光、熒光共振能量轉(zhuǎn)移等。
[0170]可以用于檢測(cè)對(duì)應(yīng)于生物學(xué)樣品中生物標(biāo)記的生物標(biāo)記值的基于溶液的示例性適配體測(cè)定包括如下步驟:(a)通過(guò)使所述生物學(xué)樣品與適配體接觸來(lái)制備混合物，所述適配體包含第一標(biāo)簽并具有對(duì)所述生物標(biāo)記的特異性親和力，其中當(dāng)所述樣品中存在所述生物標(biāo)記時(shí)形成適配體親和力復(fù)合物；(b)使所述混合物暴露于包含第一捕獲元件的第一固體支持物，并且允許所述第一標(biāo)簽與所述第一捕獲元件結(jié)合；(C)除去未與所述第一固體支持物結(jié)合的混合物的任何組分；(d)使第二標(biāo)簽附著于所述適配體親和力復(fù)合物的生物標(biāo)記組分；(e)從所述第一固體支持物釋放所述適配體親和力復(fù)合物；(f)使釋放的適配體親和力復(fù)合物暴露于包含第二捕獲元件的第二固體支持物，并且允許所述第二標(biāo)簽與所述第二捕獲元件結(jié)合；(g)通過(guò)分離未復(fù)合的適配體與所述適配體親和力復(fù)合物從所述混合物除去任何未復(fù)合的適配體；(h)從固體支持物洗脫適配體；以及(i)通過(guò)檢測(cè)所述適配體親和力復(fù)合物的適配體組分來(lái)檢測(cè)所述生物標(biāo)記。
[0171]使用免疫測(cè)定確定生物標(biāo)記值
[0172]免疫測(cè)定方法基于抗體與其對(duì)應(yīng)靶標(biāo)或分析物的反應(yīng)，并且根據(jù)特定測(cè)定形式可以檢測(cè)樣品中的分析物。為了改進(jìn)基于免疫反應(yīng)性的測(cè)定方法的特異性和靈敏性，通常由于單克隆抗體的特異性表位識(shí)別而使用單克隆抗體。多克隆抗體由于其與單克隆抗體相比增加的靶標(biāo)親和力而成功地用于各種免疫測(cè)定中。免疫測(cè)定已經(jīng)設(shè)計(jì)為用于大范圍生物學(xué)樣品基質(zhì)。免疫測(cè)定形式已經(jīng)設(shè)計(jì)為提供定性、半定量及定量結(jié)果。
[0173]定量結(jié)果通過(guò)使用已知濃度的待檢測(cè)的特定分析物產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)產(chǎn)生。將來(lái)自未知樣品的應(yīng)答或信號(hào)在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上作圖，并確定該未知樣品中對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)的量或值。
[0174]已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多免疫測(cè)定形式。ELISA或EIA可以定量檢測(cè)分析物。這種方法依賴(lài)于標(biāo)記對(duì)分析物或抗體的附著，標(biāo)記組分直接或者間接包括酶。ELISA測(cè)試可以設(shè)計(jì)為直接、間接、競(jìng)爭(zhēng)性或者夾心檢測(cè)分析物。其他方法依賴(lài)于標(biāo)記，如放射性同位素(I125)或熒光。其他技術(shù)包括例如凝集反應(yīng)、濁度測(cè)定法、比濁法、蛋白印跡、免疫沉淀、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、Luminex測(cè)定等(見(jiàn)ImmunoAssay:A Practical Guide, editedby Brian Law, published by Taylor&Francis, Ltd.，2005edit1n)。
[0175]示例性測(cè)定形式包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射性免疫測(cè)定、熒光、化學(xué)發(fā)光以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)或時(shí)間分辨的-FRET(TR-FRET)免疫測(cè)定。檢測(cè)生物標(biāo)記的方法的實(shí)例包括生物標(biāo)記免疫沉淀及隨后允許辨別大小和肽水平的定量方法，如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、平面電色譜等。
[0176]檢測(cè)和/或定量可檢測(cè)標(biāo)記或信號(hào)產(chǎn)生材料的方法取決于所述標(biāo)記的性質(zhì)。由合適的酶催化的反應(yīng)產(chǎn)物(其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是酶，見(jiàn)上文)可以是但不限于熒光、發(fā)光或放射性的，或者它們可以吸收可見(jiàn)光或紫外光。適合于檢測(cè)這樣的可檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)儀的實(shí)例包括但不限于X光照片、放射性計(jì)數(shù)器、閃爍計(jì)數(shù)器、分光光度計(jì)、比色計(jì)、熒光計(jì)、發(fā)光計(jì)和光密度計(jì)。
[0177]可以通過(guò)允許適當(dāng)準(zhǔn)備、處理和分析反應(yīng)的任何方式來(lái)進(jìn)行任何檢測(cè)方法。這可以例如在多孔測(cè)定板(如96孔或者386孔平板)中進(jìn)行，或者使用任何合適的陣列或者微陣列進(jìn)行?？梢匀斯せ蜃詣?dòng)化制備各種試劑的儲(chǔ)液，使用能夠檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記的可商購(gòu)的分析軟件、機(jī)器人技術(shù)和檢測(cè)儀器自動(dòng)化進(jìn)行所有隨后的移液、稀釋、混合、分配、洗滌、孵育、樣品讀取、數(shù)據(jù)收集和分析。
[0178]使用基因表達(dá)譜確定生物標(biāo)記值
[0179]測(cè)量生物學(xué)樣品中的mRNA可以用作檢測(cè)該生物學(xué)樣品中對(duì)應(yīng)的蛋白水平的替代。因此，本文所述的任何生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組還可以通過(guò)檢測(cè)適當(dāng)?shù)腞NA來(lái)檢測(cè)。
[0180]mRNA表達(dá)水平通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR及隨后的qPCR)測(cè)量。RT-PCR用于從mRNA產(chǎn)生cDNA。cDNA可用于qPCR測(cè)定以隨DNA擴(kuò)增過(guò)程的進(jìn)展而產(chǎn)生熒光。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較，qPCR可以產(chǎn)生絕對(duì)測(cè)量度，如每細(xì)胞的mRNA拷貝數(shù)。RNA印跡、微陣列、Invader測(cè)定以及與毛細(xì)管電泳組合的RT-PCR已經(jīng)用于測(cè)量樣品中 mRNA 的表達(dá)水平。見(jiàn) Gene Express1n Profiling:Methods and Protocols, RichardA.Shimkets, editor, Humana Press,2004。
[0181]miRNA分子是小RNA，其不編碼但是可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。適合于測(cè)量mRNA表達(dá)水平的任何方法均可以用于對(duì)應(yīng)的miRNA。最近，許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究了 miRNA作為疾病的生物標(biāo)記的用途。許多疾病涉及廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，并且毫不意外地發(fā)現(xiàn)miRNA可以作為生物標(biāo)記。miRNA濃度與疾病之間的關(guān)聯(lián)通常不如蛋白水平與疾病之間的關(guān)聯(lián)明確，但是miRNA生物標(biāo)記值可能是重要的。當(dāng)然，隨著疾病期間任何RNA的不同表達(dá)，開(kāi)發(fā)體外診斷產(chǎn)品所面臨的問(wèn)題包括需要miRNA在患病細(xì)胞中存活及易于提取以進(jìn)行分析,或者miRNA被釋放進(jìn)入血液或其他基質(zhì)中，在此它們必須存活足夠長(zhǎng)的時(shí)間以進(jìn)行測(cè)量。蛋白生物標(biāo)記具有類(lèi)似的要求，盡管許多潛在的蛋白生物標(biāo)記以旁分泌方式在疾病期間于病變和功能部位有意地分泌。許多潛在的蛋白生物標(biāo)記設(shè)計(jì)為在合成那些蛋白的細(xì)胞外起作用。
[0182]使用體內(nèi)分子成像技術(shù)檢測(cè)分子標(biāo)記
[0183]任何所述的生物標(biāo)記(見(jiàn)表I第2列)也可以用于分子成像測(cè)試。例如，顯像劑可以與任何所述生物標(biāo)記偶聯(lián)，這可以用于輔助肺癌診斷、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展/緩解或轉(zhuǎn)移、監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)或者監(jiān)測(cè)對(duì)治療的應(yīng)答等。
[0184]體內(nèi)成像技術(shù)提供了用于確定個(gè)體體內(nèi)特定疾病狀況的非侵入性方法。例如，身體的所有部分或者甚至整個(gè)身體均可以作為三維圖像觀(guān)察，從而提供關(guān)于身體內(nèi)形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)的有價(jià)值的信息。這樣的技術(shù)可以與檢測(cè)本文所述的生物標(biāo)記組合以提供關(guān)于個(gè)體的癌癥狀態(tài)，特別是肺癌狀態(tài)的信息。
[0185]體內(nèi)分子成像技術(shù)的應(yīng)用由于該技術(shù)的各種進(jìn)展而得以擴(kuò)展。這些進(jìn)展包括新造影劑或標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，如放射性標(biāo)記和/或熒光標(biāo)記，其可以在身體內(nèi)提供強(qiáng)信號(hào)；以及開(kāi)發(fā)更強(qiáng)的新成像技術(shù)，其可以從身體外部檢測(cè)和分析這些信號(hào)，并且具有足夠的靈敏性和精確度以提供有用的信息。造影劑可以在適當(dāng)?shù)某上裣到y(tǒng)中觀(guān)察，從而提供所述造影劑所處位置的身體部分或多個(gè)部分的圖像。造影劑可以與捕獲劑結(jié)合或締合，例如適配體或抗體，例如和/或結(jié)合或締合肽或蛋白，或寡核苷酸(例如為了檢測(cè)基因表達(dá))，或者復(fù)合物，所述復(fù)合物含有任何這些物質(zhì)和一種或多種大分子和/或其他顆粒形式。
[0186]造影劑也是可以用于成像的放射性原子的特征。對(duì)于閃爍照相研究合適的放射性原子包括锝-99m或碘-123。其他易于檢測(cè)的部分包括例如磁共振成像(MRI)的自旋標(biāo)記物’如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。這樣的標(biāo)記為本領(lǐng)域熟知，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇。
[0187]標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)包括但不限于磁共振成像、計(jì)算機(jī)斷層掃描、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(SPECT)等。對(duì)于診斷性體內(nèi)成像，可用的檢測(cè)設(shè)備的類(lèi)型是選擇指定造影劑的主要因素，如用于靶標(biāo)(蛋白、mRNA等)的指定放射性核素和特定生物標(biāo)記。所選的放射性核素通常具有通過(guò)指定類(lèi)型設(shè)備可檢測(cè)的衰變類(lèi)型。此外，當(dāng)選擇用于體內(nèi)診斷的放射性核素時(shí)，其半衰期應(yīng)當(dāng)足夠長(zhǎng)以允許在靶組織最大吸收時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，但是也應(yīng)當(dāng)足夠短，以減小宿主所受到的有害輻射。
[0188]示例性成像技術(shù)包括但不限于PET和SPECT，這是將放射性核素全身(synthetically)或局部地給予個(gè)體的成像技術(shù)。隨后，隨時(shí)間測(cè)量放射性示蹤劑的吸收，并用于獲得關(guān)于靶向的組織與生物標(biāo)記的信息。由于所用的特定同位素的高能(Y-射線(xiàn))發(fā)射以及用于檢測(cè)它們的設(shè)備的靈敏性和完善(sophisticat1n)，可以從身體外部推導(dǎo)出放射性的二維分布。
[0189]PET中常用的正電子發(fā)射核素包括例如碳-11、氮-13、氧-15和氟-18。通過(guò)電子捕獲和/或Y-發(fā)射衰變的同位素用于SPECT中，并且包括例如碘-123和锝-99m。用锝-99m標(biāo)記氨基酸的示例性方法是在螯合前體的存在下還原高锝酸鹽離子以形成不穩(wěn)定的锝-99m-前體配合物，其又與雙官能修飾的趨化肽的金屬結(jié)合基團(tuán)反應(yīng)，形成锝-99m-趨化肽偶聯(lián)物。
[0190]抗體常用于這樣的體內(nèi)成像診斷方法。用于體內(nèi)診斷的抗體的制備和用途為本領(lǐng)域熟知。特異性結(jié)合表I第2列的任何生物標(biāo)記的標(biāo)記的抗體可以注入疑似患有某種類(lèi)型癌癥(如肺癌)的個(gè)體，并根據(jù)所用的特定生物標(biāo)記的可檢測(cè)性來(lái)診斷或評(píng)價(jià)所述個(gè)體的疾病狀況。如上文所述，使用的標(biāo)記根據(jù)所用的成像形式選擇。標(biāo)記的定位允許確定癌癥的擴(kuò)散。器官或組織內(nèi)標(biāo)記的量也允許確定該器官或組織中癌癥的存在與否。
[0191]相似地，適配體可以用于這樣的體內(nèi)成像診斷方法。例如，用于鑒定表I第2列所述的特定生物標(biāo)記的適配體(并且因此特異性結(jié)合該特定生物標(biāo)記)可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行標(biāo)記并注入疑似患有肺癌的個(gè)體，并根據(jù)該特定生物標(biāo)記的可檢測(cè)性來(lái)診斷或評(píng)價(jià)所述個(gè)體的肺癌狀態(tài)。如上文所述，使用的標(biāo)記根據(jù)所用的成像形式選擇。標(biāo)記的定位允許確定癌癥的擴(kuò)散。器官或組織內(nèi)標(biāo)記的量也允許確定該器官或組織中癌癥的存在與否。適配體定向的顯像劑與其他顯像劑相比可以具有關(guān)于組織滲透、組織分布、動(dòng)力學(xué)、消除、效力和選擇性方面獨(dú)特且有利的特性。
[0192]這樣的技術(shù)也可以任選地用標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行，例如通過(guò)用反義寡核苷酸成像檢測(cè)基因表達(dá)。這些方法用于原位雜交，例如用熒光分子或放射性核素作為標(biāo)記。檢測(cè)基因表達(dá)的其他方法包括例如檢測(cè)報(bào)道基因的活性。
[0193]另一種常見(jiàn)類(lèi)型的成像技術(shù)是光學(xué)成像，其中對(duì)象體內(nèi)的熒光信號(hào)通過(guò)所述對(duì)象體外的光學(xué)設(shè)備檢測(cè)。這些信號(hào)可以是由于實(shí)際的熒光和/或生物發(fā)光。光學(xué)檢測(cè)設(shè)備靈敏性的改進(jìn)增加了光學(xué)成像在體內(nèi)診斷測(cè)定中的應(yīng)用。
[0194]體內(nèi)分子生物標(biāo)記的用途日益增加，包括臨床試驗(yàn)，例如在新癌癥療法臨床試驗(yàn)中更快速地測(cè)量臨床效力，和/或避免對(duì)諸如多發(fā)性硬化的那些疾病的長(zhǎng)期安慰劑治療，其中這樣的長(zhǎng)期治療可能被認(rèn)為是存在倫理問(wèn)題。
[0195]關(guān)于其他技術(shù)，見(jiàn)N.Blow, Nature Methods, 6, 465-469，2009。
[0196]使用組織學(xué)/細(xì)胞學(xué)方法確定生物標(biāo)記值
[0197]對(duì)于肺癌的評(píng)價(jià)，許多組織樣品可用于組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)方法。樣品選擇取決于原發(fā)腫瘤位置和轉(zhuǎn)移的部位。例如，支氣管內(nèi)和經(jīng)支氣管活組織檢查、細(xì)針抽吸、切割針及核心活組織檢查可以用于組織學(xué)。支氣管洗漆(washing)和刷檢(brushing)、胸膜抽吸和痰可用于細(xì)胞學(xué)。雖然細(xì)胞學(xué)分析仍用于診斷肺癌，但是已知組織學(xué)方法提供癌癥檢測(cè)更好的靈敏性。本文鑒定的在肺癌個(gè)體中表現(xiàn)出上調(diào)的任何生物標(biāo)記(見(jiàn)表37)可以用于染色組織學(xué)樣本作為疾病的指征。
[0198]在一實(shí)施方案中，對(duì)于對(duì)應(yīng)的一種或多種生物標(biāo)記是特異性的一種或多種捕獲劑用于肺細(xì)胞樣品的細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)，并且可以包括如下一個(gè)或多個(gè)方面:收集細(xì)胞樣品、固定細(xì)胞樣品、脫水、透明(clearing)、將細(xì)胞樣品固定在顯微鏡載玻片上、使細(xì)胞樣品透化、分析物檢索處理、染色、脫色、洗滌、封閉以及在緩沖溶液中與一種或多種捕獲劑反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞樣品從細(xì)胞塊(cell block)中產(chǎn)生。
[0199]在另一實(shí)施方案中，對(duì)于對(duì)應(yīng)生物標(biāo)記是特異性的一種或多種捕獲劑用于肺組織樣品的組織學(xué)評(píng)價(jià)中，并且可以包括如下一個(gè)或多個(gè)方面:收集組織樣本、固定組織樣品、脫水、透明、將組織樣品固定在顯微鏡載玻片上、使組織樣品透化、分析物檢索處理、染色、脫色、洗滌、封閉、再水合以及在緩沖溶液中與一種或多種捕獲劑反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，固定和脫水用冷凍代替。
[0200]在另一實(shí)施方案中，對(duì)于對(duì)應(yīng)的一種或多種生物標(biāo)記是特異性的一種或多種適配體與組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)樣品反應(yīng)，并且可以作為核酸擴(kuò)增方法中的核酸靶標(biāo)。合適的核酸擴(kuò)增方法包括例如PCR、q-β復(fù)制酶、滾環(huán)擴(kuò)增、鏈置換、解旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及限制和環(huán)化輔助的滾環(huán)擴(kuò)增。
[0201]在一實(shí)施方案中，將對(duì)于用于組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)的對(duì)應(yīng)生物標(biāo)記是特異性的一種或多種捕獲劑在緩沖溶液中混合，所述緩沖溶液可以包含任何如下成分:封閉材料、競(jìng)爭(zhēng)齊U、去污劑、穩(wěn)定劑、載體核酸、聚陰離子材料等。
[0202]“細(xì)胞學(xué)方案”通常包括樣品收集、樣品固定(fixat1n)、樣品固定(immobilizat1n)和染色?！凹?xì)胞制備”可以包括樣品收集后的一些處理步驟，包括使用一種或多種慢解離速率的適配體來(lái)染色制備的細(xì)胞。.
[0203]樣品收集可以包括直接將樣品置于未處理的轉(zhuǎn)運(yùn)容器中，將樣品置于含有一些類(lèi)型介質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)容器中，或者將樣品直接置于玻片上(固定)而不進(jìn)行任何處理或固定。
[0204]樣品固定可以通過(guò)將一部分收集的樣本涂在用聚賴(lài)氨酸、明膠或硅烷處理的載玻片上而改進(jìn)。玻片可以通過(guò)在玻片上涂有薄且均勻的細(xì)胞層而制備。通常采取小心操作以使減少機(jī)械扭轉(zhuǎn)和干燥假象。液體樣本可以通過(guò)細(xì)胞塊方法處理?；蛘撸后w樣本可以與固定溶液在室溫下1:1混合大約10分鐘。
[0205]細(xì)胞塊可以從剩余的積液、痰、尿液沉淀、胃腸液、細(xì)胞刮取物或細(xì)針抽吸物中制備。通過(guò)離心或膜過(guò)濾濃縮或壓實(shí)細(xì)胞。已經(jīng)揭示了許多細(xì)胞塊制備方法。代表性方法包括固定的沉淀、細(xì)菌瓊脂或膜過(guò)濾方法。在固定的沉淀方法中，將細(xì)胞沉淀與諸如鮑音液(Bouins)、苦味酸或緩沖的福爾馬林的固定劑混合，然后將混合物離心以沉淀固定的細(xì)胞。除去上清，盡可能完全地干燥細(xì)胞團(tuán)塊(pellet)。收集細(xì)胞團(tuán)塊并包在鏡頭紙中，然后置于組織盒(tissue cassette)中。將組織盒置于含其他固定劑的罐子中，作為組織樣品進(jìn)行處理。瓊脂方法與上述方法非常相似，只是取出細(xì)胞團(tuán)塊并在紙巾上干燥，然后切成兩半。將切面置于載玻片上一滴熔化的瓊脂中，然后將該細(xì)胞團(tuán)塊用瓊脂包被，保證瓊脂中無(wú)氣泡形成。使瓊脂變硬，然后除去任何過(guò)多的瓊脂。將其置于組織盒中，完成組織處理?；蛘撸梢詫⒓?xì)胞團(tuán)塊直接懸浮于在65°C的2%液體瓊脂中并離心樣品。使瓊脂細(xì)胞團(tuán)塊在4°C下固化I小時(shí)?？梢詮碾x心管中取出固體瓊脂并切成兩半。將瓊脂包在濾紙中，然后置于組織盒中。從這點(diǎn)開(kāi)始的處理與上述方法相同。在任何這些方法中可以用膜過(guò)濾低代替離心。任何這些方法均可用于產(chǎn)生“細(xì)胞塊樣品”。
[0206]細(xì)胞塊可以使用專(zhuān)門(mén)的樹(shù)脂制備，包括Lowicryl樹(shù)脂、LR White、LR Gold、Unicryl和MonoStep。這些樹(shù)脂具有低粘度,并且可以在低溫下及用紫外(UV)光聚合。包埋方法依賴(lài)于在脫水期間逐漸冷卻樣品，將樣品轉(zhuǎn)移至樹(shù)脂以及于最終低溫下在合適UV波長(zhǎng)處聚合細(xì)胞塊。
[0207]細(xì)胞塊切片可以用蘇木精-伊紅(HE)染色以進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查，而其他切片用于特異性標(biāo)記檢查。
[0208]無(wú)論方法是細(xì)胞學(xué)方法或組織學(xué)方法，可以在進(jìn)一步處理之前將樣品固定以防止樣品降解。這種方法稱(chēng)作“固定”，并且描述了可以互換使用的許多材料和方法?；诖龣z測(cè)的靶標(biāo)和待分析的特定細(xì)胞/組織類(lèi)型，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)最佳地選擇樣品固定方案和試劑。樣品固定依賴(lài)于試劑，如乙醇、聚乙二醇、甲醇、福爾馬林或異丙醇。樣品應(yīng)當(dāng)盡可能在收集及附著在玻片上后很快固定。然而，選擇的固定劑可以在各種分子靶標(biāo)中引入結(jié)構(gòu)改變，這使得隨后更難以檢測(cè)。固定(fixat1n)和固定(immobilizat1n)方法及其順序可以改變細(xì)胞的外觀(guān)，并且這些改變必須是由細(xì)胞學(xué)技術(shù)人員預(yù)期及認(rèn)可的。固定劑可以導(dǎo)致某些類(lèi)型細(xì)胞收縮，并且導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)顆粒或網(wǎng)狀物。許多固定劑通過(guò)使細(xì)胞組分交聯(lián)而起作用。這可以破壞或改變特異性表位，產(chǎn)生新表位，導(dǎo)致分子締合以及降低膜通透性。福爾馬林固定是一種最常用的細(xì)胞學(xué)/組織學(xué)方法。福爾馬林在相鄰蛋白之間或在蛋白內(nèi)形成甲基橋。沉淀或凝固也用于固定，乙醇常用于這種類(lèi)型的固定。交聯(lián)與沉淀的組合也可以用于固定。牢固的固定方法在保留形態(tài)學(xué)信息方面是最佳的，而較弱的固定方法對(duì)于保留分子靶標(biāo)方面是最佳的。
[0209]代表性的固定劑是50%無(wú)水乙醇、2mM聚乙二醇(PEG)、1.85%甲醛。這種制劑的變化包括乙醇(50% -95% )、甲醇(20% -50% )以及僅福爾馬林(甲醛)。另一種常用的固定劑是2% PEG 1500、50%乙醇以及3%甲醇。將玻片在室溫下置于固定劑中約10-15分鐘，然后取出并干燥。一旦玻片被固定，可以用諸如PBS的緩沖溶液對(duì)其進(jìn)行漂洗。
[0210]許多染料可以用于差異地突出和反差或“染色”細(xì)胞、亞細(xì)胞和組織特征或形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。蘇木精(hematoylin)用于使細(xì)胞核染色為藍(lán)色或黑色。橘黃G_6和天青伊紅(EosinAzure)均使細(xì)胞質(zhì)染色。橘黃G使含有角蛋白和糖原的細(xì)胞染成黃色。伊紅Y用于使核仁、纖毛、紅細(xì)胞和表面上皮扁平細(xì)胞染色。羅曼諾夫斯基(Romanowsky)染色用于空氣干燥的玻片，并且可以用于增強(qiáng)復(fù)型及區(qū)分細(xì)胞外與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)材料。
[0211]染色方法可以包括增加細(xì)胞對(duì)于染色通透性的處理。用去污劑處理細(xì)胞可以用于增加通透性。為了增加細(xì)胞和組織的通透性，可以將固定的樣品用溶劑、皂苷類(lèi)或者非離子去污劑進(jìn)一步處理。酶促消化也可以改進(jìn)組織樣品中特異性靶標(biāo)的可接近性。
[0212]染色后，使用漸增的醇濃度進(jìn)行連續(xù)醇漂洗將樣品脫水。最終的洗滌使用二甲苯或諸如柑桔萜的二甲苯取代物，其具有接近在載玻片上應(yīng)用的蓋玻片的折射率。這個(gè)最后的步驟稱(chēng)作透明。一旦使樣品脫水及透明，應(yīng)用封固劑。所選的封固劑具有接近玻璃的折射率，并且能夠使蓋玻片與載玻片粘合。其還抑制細(xì)胞樣品另外的干燥、收縮或褪色。
[0213]無(wú)論使用的染色或處理，對(duì)肺細(xì)胞學(xué)樣本進(jìn)行的最后評(píng)價(jià)通過(guò)一些類(lèi)型顯微鏡檢查進(jìn)行以允許通過(guò)肉眼觀(guān)察形態(tài)學(xué)并確定標(biāo)記的存在與否。示例性顯微鏡檢查方法包括明視野顯微鏡、相襯顯微鏡、突光顯微鏡和微分干涉相差顯微鏡方法。
[0214]如果在檢查后需要對(duì)樣品進(jìn)行次級(jí)測(cè)試，則可以除去蓋玻片并對(duì)載玻片進(jìn)行脫色。脫色包括使用用于染色該載玻片的最初未加入染料的原始溶劑系統(tǒng)，并以與原始染色程序相反順序進(jìn)行。脫色也可以通過(guò)將該載玻片浸泡在酸醇中直至細(xì)胞無(wú)色。一旦無(wú)色，則將載玻片用水充分漂洗并進(jìn)行第二染色程序。
[0215]此外，通過(guò)使用特異性分子試劑，如抗體或者核酸探針或適配體，可以將特異性分子區(qū)分與細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析組合。這改進(jìn)了診斷細(xì)胞學(xué)的精確性。顯微切割可用于分離細(xì)胞的子集以進(jìn)行另外的評(píng)價(jià)，特別是用于遺傳學(xué)評(píng)價(jià)異常染色體、基因表達(dá)或突變。
[0216]制備用于組織學(xué)評(píng)價(jià)的組織樣品包括固定、脫水、浸潤(rùn)(infiltrat1n)、包埋和切片。用于組織學(xué)的固定試劑與用于細(xì)胞學(xué)的固定試劑非常相似或相同，并且在以諸如個(gè)體蛋白的分子為代價(jià)的情況中具有相同的保持形態(tài)學(xué)特征的問(wèn)題。如果組織樣品不進(jìn)行固定和脫水而是代之以冷凍然后在冷凍時(shí)切片可以節(jié)省時(shí)間。這是更溫和的處理程序，并且可以保留更多的個(gè)體標(biāo)記。然而，冷凍對(duì)于組織樣品的長(zhǎng)期保存不可接受，因?yàn)橛捎诒w的引入引起亞細(xì)胞信息喪失。冷凍組織樣品中的冰也妨礙切片過(guò)程產(chǎn)生極薄的切片，并且因此可以喪失一些顯微鏡分辨力和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的圖像。除了福爾馬林固定之外，四氧化鋨也用于固定和染色磷脂(膜)。
[0217]組織的脫水是通過(guò)用漸增濃度的醇連續(xù)洗滌而實(shí)現(xiàn)。透明使用的材料可以與醇和包埋材料混溶，并且包括從50:50醇:澄清劑開(kāi)始至100%澄清劑(二甲苯或二甲苯取代物)的逐步處理過(guò)程。浸潤(rùn)包括將組織與液體形式的包埋劑(溫?zé)岬南?，硝化纖維溶液)一起孵育，首先是50:50包埋劑:澄清劑，隨后是100%包埋劑。包埋通過(guò)將組織置于模具或盒中并充填熔化的包埋劑如蠟、瓊脂或明膠而完成。使包埋劑硬化。然后將硬化的組織樣品切成薄切片以用于染色和隨后的檢查。
[0218]在染色之前，將組織切片脫蠟并再水合。用二甲苯使切片脫蠟，可以更換一次或多次二甲苯，并通過(guò)在遞減濃度的醇中連續(xù)洗滌而再水合。在脫蠟之前，可以將組織切片于約80°C下在載玻片上熱固定約20分鐘。
[0219]激光捕獲顯微切割允許從組織切片分離細(xì)胞的子集以進(jìn)行進(jìn)一步分析。
[0220]在細(xì)胞學(xué)中，為了增強(qiáng)顯微特征的觀(guān)察，可以將組織切片或薄片用各種染色方法染色。許多可商購(gòu)的染色方法可以用于增強(qiáng)或鑒定特定的特征。
[0221]為了進(jìn)一步增加分子試劑與細(xì)胞學(xué)/組織學(xué)樣品的相互作用，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多“分析物檢索(analyte retrieval) ”技術(shù)。第一種這樣的技術(shù)使用高溫加熱固定的樣品。這種方法也稱(chēng)作熱誘導(dǎo)的表位檢索或HIER。已經(jīng)使用了許多加熱技術(shù)，包括蒸汽加熱、微波、高壓蒸汽、水浴以及加壓蒸煮或這些加熱方法的組合。分析物檢索溶液包括例如水、檸檬酸鹽和普通鹽水緩沖液。分析物檢索的關(guān)鍵是高溫的時(shí)間，但是較低溫度進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間也已經(jīng)成功使用。分析物檢索的另一關(guān)鍵是加熱溶液的pH。發(fā)現(xiàn)低pH提供最佳的免疫染色，但是也產(chǎn)生經(jīng)常需要使用第二組織切片作為陰性對(duì)照的背景。無(wú)論緩沖液組成，使用高PH溶液通常獲得最一致的益處(增加免疫染色而不增加背景)。對(duì)特異性靶標(biāo)的分析物檢索方法根據(jù)經(jīng)驗(yàn)對(duì)使用加熱的靶標(biāo)、時(shí)間、PH和緩沖液組成的變量加以?xún)?yōu)化。使用微波分析物檢索方法允許用抗體試劑順序染色不同的靶標(biāo)。但是在染色步驟之間獲得抗體與酶復(fù)合物需要的時(shí)間也證實(shí)使細(xì)胞膜分析物降解。微波加熱方法也改進(jìn)原位雜交方法。
[0222]為了開(kāi)始分析物檢索過(guò)程，首先將切片脫蠟并水合。然后將玻片置于平皿或罐子中的1mM檸檬酸鈉緩沖液pH 6.0中。代表性的程序使用1100W微波，以100%功率對(duì)玻片微波處理2分鐘，隨后在確保玻片保留覆蓋于液體中之后使用20%功率對(duì)玻片微波處理18分鐘。然后使玻片在敞口容器中冷卻，隨后用蒸餾水漂洗。HIER可以與酶促消化組合使用以改進(jìn)靶標(biāo)對(duì)免疫化學(xué)試劑的反應(yīng)性。
[0223]一種這樣的酶促消化方案使用蛋白酶K。20 μ g/ml濃度的蛋白酶K在50mM Tris堿、ImM EDTA.0.5% Triton X-100、pH 8.0緩沖液中制備。該方法首先包括將切片在更換2次的二甲苯中脫蠟，每次5分鐘。然后將樣品在更換2次的100%乙醇中水合，每次3分鐘，在95 %和80 %乙醇中水合，每次I分鐘，然后在蒸餾水中漂洗。將切片用蛋白酶K工作溶液覆蓋，于37°C下在加濕室中孵育10-20分鐘(最佳孵育時(shí)間可以根據(jù)組織類(lèi)型和固定程度而變化)。將切片在室溫下冷卻10分鐘，然后在PBS吐溫(Tween) 20中漂洗2次2分鐘。如果需要，可以將切片封閉以消除來(lái)自?xún)?nèi)源化合物和酶的潛在干擾。然后將切片用在一抗稀釋緩沖液中適當(dāng)稀釋的一抗在室溫下孵育I小時(shí)或者在4°C下孵育過(guò)夜。然后將該切片用PBS吐溫20漂洗2次2分鐘。如果需要特定的應(yīng)用，可以進(jìn)行另外的封閉，隨后用PBS吐溫20再漂洗3次2分鐘，然后最后完成免疫染色方案。
[0224]在室溫下用1% SDS簡(jiǎn)單處理也已經(jīng)證實(shí)改進(jìn)了免疫組織化學(xué)染色。分析物檢索方法已經(jīng)應(yīng)用于玻片固定切片(slide mounted sect1n)以及自由浮動(dòng)切片(freefloating sect1n)。另一處理選擇是將玻片置于pH 6.0的含有朽1檬酸和0.1諾納德(Nonident)P40的罐子中，并加熱至95°C。然后將該玻片用諸如PBS的緩沖溶液洗滌。
[0225]對(duì)于組織的免疫學(xué)染色，可以通過(guò)將切片浸入諸如血清或脫脂奶粉的蛋白溶液中來(lái)封閉抗體與組織蛋白的非特異性結(jié)合。
[0226]封閉反應(yīng)可包括需要降低內(nèi)源生物素的水平；消除內(nèi)源電荷作用；失活內(nèi)源核酸酶；和/或失活內(nèi)源酶如過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶。內(nèi)源核酸酶可以通過(guò)以下方式失活:用蛋白酶K降解；熱處理；使用螯合劑，如EDTA或EGTA ;引入載體DNA或RNA ;用離液劑處理，如尿素、硫脲、鹽酸胍、硫氰酸胍、高氯酸鋰等或焦碳酸二乙酯。堿性磷酸酶可以通過(guò)用0.1NHCl在室溫下處理5分鐘或用ImM左旋咪唑處理而失活。過(guò)氧化物酶活性可以通過(guò)用0.03%過(guò)氧化氫處理而消除。內(nèi)源生物素可以通過(guò)將玻片或切片在室溫下浸入抗生物素蛋白(鏈霉抗生物素蛋白，可以取代中性鏈親和素(neutravidin))溶液中至少15分鐘而封閉。然后將玻片或切片在緩沖液中洗滌至少10分鐘。這個(gè)步驟可以重復(fù)至少3次。然后將玻片或切片浸入生物素溶液中10分鐘。這個(gè)步驟可以重復(fù)至少3次，每次使用新鮮的生物素溶液。重復(fù)緩沖液洗滌程序。應(yīng)當(dāng)減少封閉方案以防止破壞所關(guān)注的細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)或者靶標(biāo)或多個(gè)靶標(biāo)，但是可以組合一種或多種這樣的方案以“封閉”玻片或切片，然后與一種或多種慢解離速率適配體反應(yīng)。見(jiàn)Basic Medical Histology: the B1logyof Cells, Tissues and Organs,authored by Richard G.Kesselj Oxford UniversityPress, 1998。
[0227]使用質(zhì)譜方法確定生物標(biāo)記值
[0228]許多質(zhì)譜儀的配制(configurat1n)可以用于檢測(cè)生物標(biāo)記值。一些類(lèi)型的質(zhì)譜儀可以獲得或可以用各種配制生產(chǎn)。通常，質(zhì)譜儀具有如下主要部件:樣品入口、離子源、質(zhì)量分析儀、檢測(cè)儀、真空系統(tǒng)以及設(shè)備控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)系統(tǒng)。樣品入口、離子源和質(zhì)量分析儀的不同通常限定設(shè)備的類(lèi)型及其能力。例如，入口可以是毛細(xì)管柱液體層析源，或者可以是直接探針或鏡臺(tái)(stage)如用于基質(zhì)輔助激光解吸電離中。常用的離子源是例如電噴射，包括納米噴射(nanospray)和微噴射(microspray);或者基質(zhì)輔助激光解吸電離。常用的質(zhì)量分析儀包括四極濾質(zhì)器(quadrupole mass filter)、離子講質(zhì)量分析儀和飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀。其他質(zhì)譜方法為本領(lǐng)域熟知(見(jiàn)Burlingame et al.Anal.Chem.70:647R-716R(1998) ；Kinter and Sherman, New York(2000))。
[0229]蛋白生物標(biāo)記和生物標(biāo)記值可以通過(guò)任何如下方式檢測(cè)和測(cè)量:電噴射離子化質(zhì)譜(ES1-MS)、ES1-MS/MS、ES1-MS/(MS) η、基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)、表面增強(qiáng)激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(SELD1-T0F-MS)、硅表面解吸/離子化(D1S)、二次離子質(zhì)譜(SIMS)、四極飛行時(shí)間(Q-TOF)J^tultraflex IIIT0F/T0F的串聯(lián)式飛行時(shí)間(T0F/T0F)技術(shù)、大氣壓化學(xué)離子化質(zhì)譜(APC1-MS)、APC1-MS/MS、APC1-(MS)n、大氣壓光電離質(zhì)譜(APP1-MS)、APP1-MS/MS 和 APP1-(MS)N、四極質(zhì)譜、傅里葉變換質(zhì)譜(FTMS)、定量質(zhì)譜以及離子阱質(zhì)譜。
[0230]樣品制備策略用于在對(duì)蛋白生物標(biāo)記進(jìn)行質(zhì)譜表征及確定生物標(biāo)記值之前標(biāo)記和富集樣品。標(biāo)記方法包括但不限于用于相對(duì)和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽(iTRAQ)和在細(xì)胞培養(yǎng)中用氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SILAC)。在質(zhì)譜分析之前用于選擇性富集候選生物標(biāo)記蛋白樣品的捕獲劑包括但不限于適配體、抗體、核酸探針、嵌合物、小分子、F(ab’)2片段、單鏈抗體片段、Fv片段、單鏈Fv片段、核酸、凝集素、配體-結(jié)合受體、affybodies、納米抗體、錨蛋白、結(jié)構(gòu)域抗體、可變抗體支架(例如雙抗體等)印刷的聚合物、高親合性多聚體、肽模擬物、擬肽、肽核酸、蘇糖核酸、激素受體、細(xì)胞因子受體及合成的受體以及這些物質(zhì)的修飾和片段。
[0231]前述測(cè)定允許檢測(cè)可用于診斷肺癌的方法中的生物標(biāo)記值，其中所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)至少N個(gè)生物標(biāo)記值,所述至少N個(gè)生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表I第2列提供的生物標(biāo)記的生物標(biāo)記，其中如下文所述，利用生物標(biāo)記值的分類(lèi)指示所述個(gè)體是否患有肺癌。雖然某些所述肺癌生物標(biāo)記可以單獨(dú)用于檢測(cè)和診斷肺癌，但是本文所述的方法用于分組肺癌生物標(biāo)記的多個(gè)子集，其各自用作三個(gè)或更多個(gè)生物標(biāo)記的組。因此，本申請(qǐng)的各種實(shí)施方案提供了包含N個(gè)生物標(biāo)記的組合，其中N是至少三個(gè)生物標(biāo)記。在其他實(shí)施方案中，N選自2-61個(gè)生物標(biāo)記中的任意數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解N可以選自任何上述范圍以及相似但更高級(jí)范圍中的任意數(shù)。根據(jù)本文所述任何方法，可以單獨(dú)檢測(cè)和分類(lèi)生物標(biāo)記值，或者可以共同檢測(cè)和分類(lèi)生物標(biāo)記值，例如以多重測(cè)定形式。
[0232]在另一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)肺癌不存在的方法，所述方法包括在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)至少N個(gè)生物標(biāo)記值,所述至少N個(gè)生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表I第2列提供的生物標(biāo)記的生物標(biāo)記，其中如下文所述，生物標(biāo)記值的分類(lèi)指示所述個(gè)體中不存在肺癌。雖然某些所述肺癌生物標(biāo)記可以單獨(dú)用于檢測(cè)和診斷不存在肺癌，但是本文所述的方法用于分組肺癌生物標(biāo)記的多個(gè)子集，其各自用作三個(gè)或更多個(gè)生物標(biāo)記的組。因此，本申請(qǐng)的各種實(shí)施方案提供了包含N個(gè)生物標(biāo)記的組合，其中N是至少三個(gè)生物標(biāo)記。在其他實(shí)施方案中，N選自2-61個(gè)生物標(biāo)記中的任意數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解N可以選自任何上述范圍以及相似但更高級(jí)范圍中的任意數(shù)。根據(jù)本文所述任何方法，可以單獨(dú)檢測(cè)和分類(lèi)生物標(biāo)記值，或者可以共同檢測(cè)和分類(lèi)生物標(biāo)記值，例如以多重測(cè)定形式。
[0233]生物標(biāo)記分類(lèi)及疾病評(píng)分計(jì)算
[0234]對(duì)于給定診斷測(cè)試的生物標(biāo)記“特征”含有標(biāo)記的集合，每個(gè)標(biāo)記在所關(guān)注群體中具有不同水平。在此方面，不同水平可以指針對(duì)兩個(gè)或更多個(gè)組中個(gè)體的標(biāo)記水平的不同平均值(mean)，或者兩個(gè)或更多個(gè)組中的不同的方差，或者這兩者的組合。對(duì)于最簡(jiǎn)單形式的診斷測(cè)試，這些標(biāo)記可以用于將來(lái)自個(gè)體的未知樣品分配到兩組中的一組中，疾病組或非疾病組。將樣品分配于兩個(gè)或更多個(gè)組中的一組稱(chēng)為分類(lèi)，用于實(shí)現(xiàn)這種分配的程序稱(chēng)為分類(lèi)器或分類(lèi)方法。分類(lèi)方法也可以稱(chēng)為評(píng)分方法。有許多分類(lèi)方法可以用于從生物標(biāo)記值的集合構(gòu)建診斷分類(lèi)器。通常，分類(lèi)方法最容易用監(jiān)督學(xué)習(xí)技術(shù)進(jìn)行，其中用獲得自希望區(qū)分的兩個(gè)(或更多個(gè)，對(duì)于多個(gè)分類(lèi)狀態(tài))不同組內(nèi)的個(gè)體的樣品收集數(shù)據(jù)集合。因?yàn)槊總€(gè)樣品所屬類(lèi)別(組或群體)事先對(duì)于每個(gè)樣品均是已知的，所以可以訓(xùn)練分類(lèi)方法以獲得期望的分類(lèi)應(yīng)答。還可以使用無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)技術(shù)來(lái)產(chǎn)生診斷分類(lèi)器。
[0235]開(kāi)發(fā)診斷分類(lèi)器的常用方法包括決策樹(shù)；bagging+boosting+forests ;基于規(guī)則推論的學(xué)習(xí)(rule inference based learning) ;Parzen 窗方法(Parzen Windows)；線(xiàn)性模型；邏輯；神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法；無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)；K-means ;分級(jí)上升/下降(hierarchicalascending/descending);半監(jiān)督學(xué)習(xí)；原型方法；近鄰取樣(nearest neighbor);核密度估計(jì)(kernel density estimat1n);支持向量機(jī)(support vector machine);隱馬爾可夫模型(hidden Markov model);玻爾茲曼學(xué)習(xí)(Boltzmann Learning);并且分類(lèi)器可以簡(jiǎn)單組合或者以減小特定目標(biāo)函數(shù)的方式組合。綜述參見(jiàn)例如Pattern Classificat1n, R.0.Duda, et al., editors, John ffiley&Sons, 2nd edit1n, 2001 ;還參見(jiàn) The Elementsof Statistical Learning-Data Mining, Inference, and Predict1n, T.Hastie, etal., editors, Springer Science+Business Media, LLC, 2nd edit1n, 2009 ;它們均通過(guò)引用整體并入本文。
[0236]為了用監(jiān)督學(xué)習(xí)技術(shù)產(chǎn)生分類(lèi)器，獲得稱(chēng)為訓(xùn)練數(shù)據(jù)的樣品集合。在診斷測(cè)試的情況中，訓(xùn)練數(shù)據(jù)包括來(lái)自未知樣品稍后會(huì)被分配的不同組(類(lèi)別)的樣品。例如，收集自對(duì)照群體的個(gè)體和特定疾病群體的個(gè)體的樣品可以組成訓(xùn)練數(shù)據(jù)以開(kāi)發(fā)可以分類(lèi)未知樣品(或者，更特別地，樣品所來(lái)自的個(gè)體)為患有該疾病或無(wú)該疾病的分類(lèi)器。從訓(xùn)練數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)分類(lèi)器已知為訓(xùn)練該分類(lèi)器。分類(lèi)器訓(xùn)練的具體細(xì)節(jié)取決于監(jiān)督學(xué)習(xí)技術(shù)的性質(zhì)。作為示例，訓(xùn)練樸素貝葉斯(na’fve Bayesian)分類(lèi)器的實(shí)例在下文進(jìn)行描述(參見(jiàn)例如 Pattern Classificat1n, R.0.Duda, et al., editors, Johnffiley&Sons, 2nd edit1n, 2001 ;還參見(jiàn) The Elements of Statistical Learning-DataMining, Inference,and Predict1n,T.Hastie, et al., editors,SpringerScience+Business Media, LLC, 2nd edit1n, 2009)。
[0237]因?yàn)橥ǔＴ谟?xùn)練集合中存在比樣品多得多的潛在生物標(biāo)記值，所以必須小心避免過(guò)擬合。當(dāng)統(tǒng)計(jì)學(xué)模型描述隨機(jī)誤差或噪聲而非潛在關(guān)系時(shí)發(fā)生過(guò)擬合。過(guò)擬合可以由各種方式避免，這包括例如限制開(kāi)發(fā)分類(lèi)器中使用的標(biāo)記數(shù)目，假設(shè)標(biāo)記應(yīng)答互相獨(dú)立，限制采用的潛在統(tǒng)計(jì)學(xué)模型的復(fù)雜性，以及保證潛在統(tǒng)計(jì)學(xué)模型符合數(shù)據(jù)。
[0238]使用生物標(biāo)記的集合開(kāi)發(fā)診斷測(cè)試的示意性實(shí)例包括應(yīng)用樸素貝葉斯分類(lèi)器，這是一種基于貝葉斯(Bayes)定理的簡(jiǎn)單或然性分類(lèi)器，具有生物標(biāo)記的嚴(yán)格獨(dú)立處理。每個(gè)生物標(biāo)記由針對(duì)每種類(lèi)別中測(cè)量的RFU值或1gRFU (相對(duì)熒光單位)值的類(lèi)別依賴(lài)性概率密度函數(shù)(pdf)描述。一個(gè)類(lèi)別中的標(biāo)記的集合的共同pdf (joint pdfs)假定為每個(gè)生物標(biāo)記的個(gè)體類(lèi)別依賴(lài)性Pdf的積。在此情況中訓(xùn)練樸素貝葉斯分類(lèi)器意味著分配參數(shù)(“參數(shù)化”)以表征類(lèi)別依賴(lài)性pdf。類(lèi)別依賴(lài)性pdf的任何潛在模型均可以使用，但是模型應(yīng)該通常符合在訓(xùn)練集合中觀(guān)察的數(shù)據(jù)。
[0239]具體地，測(cè)量疾病類(lèi)別中生物標(biāo)記i的值Xi的類(lèi)別依賴(lài)性概率寫(xiě)作p(Xi|d)，并且








觀(guān)察具有值1 = (%^,』8)的1!個(gè)標(biāo)記的整體樸素貝葉斯概率寫(xiě)作

【權(quán)利要求】
1.特異于表I所列的生物標(biāo)記蛋白的捕獲劑在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于通過(guò)如下方法診斷或確定個(gè)體患有或者不患有肺癌的似然性，所述方法包括: 提供包含表I所列的N個(gè)生物標(biāo)記蛋白的生物標(biāo)記組；和 在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于所述組中的所述生物標(biāo)記蛋白之一，其中所述生物標(biāo)記值提供所述個(gè)體患有或不患有肺癌的似然性的指示，其中N是任選的整數(shù)，使得所述生物標(biāo)記組的靈敏性+特異性值為1.65或更大。
2.權(quán)利要求1的用途，其中N= 2 - 61。
3.權(quán)利要求1的用途，其中N= 3 - 61。
4.權(quán)利要求1的用途,其中N= 4-61。
5.權(quán)利要求1的用途，其中N= 5 - 61。
6.特異于表I所列的生物標(biāo)記蛋白的捕獲劑在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于通過(guò)如下方法診斷或確定個(gè)體患有或者不患有肺癌的似然性，所述方法包括: 提供包含表I所列的N個(gè)生物標(biāo)記蛋白的生物標(biāo)記組；和 在來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品中檢測(cè)生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于所述組中的所述生物標(biāo)記蛋白之一，其中所述生物標(biāo)記值提供所述個(gè)體患有或不患有肺癌的似然性的指示，并且其中N = 2-61。
7.權(quán)利要求6的用途，其中N= 3-61。
8.權(quán)利要求6的用途，其中N= 4-61。
9.權(quán)利要求6的用途，其中N= 5-61。
10.權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的用途，其中所述生物標(biāo)記組的靈敏性+特異性值為1.65或更大。
11.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的用途，其中所述生物標(biāo)記組的靈敏性+特異性值為1.70或更大。
12.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的用途，其中檢測(cè)所述生物標(biāo)記值包括進(jìn)行體外測(cè)定。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述體外測(cè)定包括對(duì)應(yīng)于每個(gè)所述生物標(biāo)記的至少一種捕獲劑，并且還包括從由適配體、抗體和核酸探針組成的組中選擇所述至少一種捕獲劑。
14.權(quán)利要求12的用途，其中所述體外測(cè)定選自免疫測(cè)定、基于適配體的測(cè)定、組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)測(cè)定以及mRNA表達(dá)水平測(cè)定。
15.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的用途，其中每個(gè)生物標(biāo)記值基于預(yù)定值或值的預(yù)定范圍評(píng)價(jià)。
16.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的用途，其中所述生物學(xué)樣品是肺組織，并且其中所述生物標(biāo)記值源自所述肺組織的組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)分析。
17.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的用途，其中所述個(gè)體是人。
18.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的用途，其中所述個(gè)體是吸煙者。
19.權(quán)利要求18的用途，其中所述生物標(biāo)記蛋白選自表I第6列。
20.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的用途，其中所述個(gè)體具有肺小結(jié)。
21.權(quán)利要求20的用途，其中所述生物標(biāo)記選自表I第5列。
22.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的用途，其中所述肺癌是非小細(xì)胞肺癌。
23.一種指示肺癌的似然性的裝置，所述裝置包括: 檢索歸因于來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品的數(shù)據(jù)的模塊，其中所述數(shù)據(jù)包括生物標(biāo)記值，所述生物標(biāo)記值每個(gè)對(duì)應(yīng)于選自表I的至少N個(gè)生物標(biāo)記之一，其中所述生物標(biāo)記在所述生物學(xué)樣品中檢測(cè)；以及 執(zhí)行分類(lèi)方法的模塊，所述分類(lèi)方法指示作為所述生物標(biāo)記值的函數(shù)的所述個(gè)體的肺疾病狀態(tài)；其中N= 2-61。
24.權(quán)利要求23的裝置，其中N=3-61。
25.權(quán)利要求23的裝置，其中N= 4-61。
26.權(quán)利要求23的裝置，其中N=5-61。
27.權(quán)利要求23的裝置，其中所述分類(lèi)方法使用類(lèi)別依賴(lài)性概率密度函數(shù)。
28.權(quán)利要求27的裝置，其中所述分類(lèi)方法使用兩種或更多種類(lèi)別。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK104198709SQ201410477840
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2009年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2008年9月9日
【發(fā)明者】L·戈?duì)柕? M·斯坦頓, E·N·布羅迪, R·M·奧斯特羅夫, D·濟(jì)奇, A·A·E·斯圖爾特 申請(qǐng)人:私募蛋白質(zhì)體公司