一種檢測血紅蛋白結合磷酸化alpha-突觸核蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測與血液中紅細胞內血紅蛋白結合的磷酸化a-突觸核蛋白含量的方法，所述方法包括利用抗人血紅蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體，利用抗磷酸化人突觸核蛋白單克隆抗體作為檢測抗體，利用抗原-抗體反應原理檢測帕金森病人和正常健康人與血紅蛋白結合的磷酸化突觸核蛋白的含量并進行比較。
【專利說明】-種檢測血紅蛋白結合磷酸化alpha-突觸核蛋白的方法

【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測與血液中紅細胞內與血紅蛋白結合的磷酸化α-突觸核蛋 白含量的方法，該方法可用于帕金森病的診斷。

【背景技術】：
[0002] 帕金森病是一種常見的神經系統(tǒng)退行性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為靜止振顫、運 動遲緩、肌肉僵直和姿勢不穩(wěn)定等運動癥狀。引起這些癥狀的原因是中腦黑質多巴胺 神經元大量死亡和由此引起的紋狀體部位的多巴胺神經遞質的大幅度減少。帕金森病 的主要病理特征是神經細胞內出現(xiàn)嗜酸性包涵體--路易體（Lewy body)和路易神經 索（Lewy neurite)構成路易體和路易神經索的主要成分是纖維化的α-突觸核蛋白 (α-synuclein)。大量研究表明，α-突觸核蛋白是在帕金森病的發(fā)病中起關鍵作用的蛋 白質。a-突觸核蛋白基因點突變和多倍體變異可以引起家族性早發(fā)性帕金森病，其基因啟 動子多態(tài)性與帕金森病的發(fā)病風險有關。已經證明，帕金森病人腦組織中的α-突觸核蛋 白存在改變，表現(xiàn)為該蛋白的表達量異常增高，磷酸化、硝基化、泛素化和糖基化的修飾體 增加。異常表達和修飾的α-突觸核蛋白引起該蛋白異常聚集成寡聚體，并進而形成纖維 而沉積在路易體中 [4<。大量證據表明，異常表達、修飾的α-突觸核蛋白促進其聚集成對 神經元具有毒性作用的蛋白寡聚體，是各種原因導致神經元退變和帕金森病的關鍵。鑒于 a -突觸核蛋白在帕金森病發(fā)病和病理生理過程中的關鍵作用，檢測該蛋白在體液中的變 化被認為對帕金森病具有診斷意義。目前對腦脊液的檢測表明，帕金森病人腦脊液中的總 的α-突觸核蛋白含量降低和寡聚化α-突觸核蛋白含量增高，具有較高的診斷特異性和 敏感性。目前對帕金森病人血液中的突觸核蛋白的檢測主要限于血清和血漿。然而， 受限于檢測技術的敏感性和穩(wěn)定性以及其它干擾因素的影響，血清和血漿中的a -突觸核 蛋白的檢測結果及其在帕金森病的診斷意義尚不能定論。不同研究者報道的正常值相差數 百甚至上千倍。帕金森病人血漿和血清中的總α-突觸核蛋白含量有報道高于正常對照、 低于正常對照和沒有明顯變化等不同結果。帕金森病人血漿中的磷酸化α-突觸核蛋白含 量高于正常對照。
[0003] 研究表明，血液中的α-突觸核蛋白99%存在于紅細胞中。由于紅細胞是無核細 胞，不能表達a -突觸核蛋白，其胞漿的主要成分是血紅蛋白，由此推測，紅細胞中的a -突 觸核蛋白含量較高的原因很可能與血紅蛋白有關?；谏鲜鐾茰y，我們證明了血紅蛋白可 以與α-突觸核蛋白結合成復合體。由于α-突觸核蛋白可以以被動擴散的方式通過細胞 膜，因此，血紅蛋白可以將胞漿中的α-突觸核蛋白富集到紅細胞中，導致紅細胞中α-突 觸核蛋白含量明顯高于血液中的其它組分。因此，檢測紅細胞中與血紅蛋白結合的磷酸化 a-突觸核蛋白含量將有可能反應不同生理病理情況下磷酸化修飾的該蛋白的變化情況。
[0004] 本發(fā)明提供一種檢測紅細胞內與血紅蛋白結合的磷酸化α-突觸核蛋白的方法， 該方法具有較好的穩(wěn)定性和重復性，可以檢測病人和正常健康人的與血紅蛋白結合的磷酸 化a -突觸核蛋白含量，是篩選帕金森病高危人群和臨床診斷帕金森病的重要手段。


【發(fā)明內容】
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[0005] 本發(fā)明提供一種檢測紅細胞內與血紅蛋白結合的磷酸化α-突觸核蛋白含量的 方法，利用該方法所獲得的結果，有助于對帕金森病進行診斷和判定治療效果。
[0006] 本發(fā)明所述方法，利用抗人血紅蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體，利用抗磷酸化人 α -突觸核蛋白單克隆抗體作為檢測抗體，利用抗原-抗體反應原理檢測帕金森病人和正 常健康人與血紅蛋白結合的磷酸化人α-突觸核蛋白的含量并進行比較。
[0007] 為此，本發(fā)明提供一種檢測與紅細胞內與血紅蛋白結合的磷酸化人α -突觸核蛋 白含量的方法，所述方法，包括以下步驟：
[0008] (1)分離紅細胞中的胞漿蛋白；
[0009] (2)用抗人血紅蛋白單克隆抗體捕獲胞漿蛋白中的血紅蛋白；
[0010] (3)用生物素化的抗磷酸化人α -突觸核蛋白的單克隆抗體（如抗pSer 129)檢測 與血紅蛋白結合的磷酸化α-突觸核蛋白；
[0011] (4)加入親和素標記的堿性磷酸酶和顯色劑，進行顯色；
[0012] (5)用分光光度法對顯色的樣品進行吸光度測定，用標準曲線計算樣品中與血紅 蛋白結合的磷酸化α-突觸核蛋白的含量。
[0013] 以下對本發(fā)明所用名稱術語進行解釋：
[0014] (1)抗人血紅蛋白單克隆抗體：特異性識別人血紅蛋白的單克隆抗體。
[0015] (2)血紅蛋白結合磷酸化α -突觸核蛋白：與血紅蛋白發(fā)生相互作用的磷酸化人 α-突觸核蛋白。
[0016] (3)血紅蛋白-磷酸化α -突觸核蛋白復合體：在紅細胞胞漿中，血紅蛋白與磷酸 化人α-突觸核蛋白發(fā)生相互作用形成的復合物，稱為血紅蛋白-磷酸化α-突觸核蛋白 復合體。
[0017] (4)抗人磷酸化α -突觸核蛋白單克隆抗體：為任何特異識別人磷酸化α -突觸 核蛋白的單克隆抗體。
[0018] (5)鏈霉親和素標記堿性磷酸酶：在ELISA測定中，鏈霉親和素標記堿性磷酸酶 復合物中的鏈霉親和素可以與生物素化的抗磷酸化人α-突觸核蛋白的單克隆抗體結合， 而復合物中的堿性磷酸酶可以催化色原底物對硝基苯磷酸鹽（ΡΝΡΡ)生成黃色的對硝基酚 (ΡΝΡ)，其在入=405nm處有最大光吸收。
[0019] (6)顯色劑：為對硝基苯磷酸鹽二鈉鹽，或4硝基苯磷酸鹽，英文名稱 p-nitrophenyl phosphate disodium 或 4_nitrophenyl phosphate disodium,縮寫為 pNPP。用于ELISA的化學顯色底物，可在堿性磷酸酶的催化下形成對硝基酚（pNP)，后者是 黃色水溶產物，該產物在405nm處有最大光吸收。
[0020] (7) ELISA 酶標板：在酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)中，作為載體的固相聚苯乙烯（Polystyrene)表面對抗原、抗體或抗原抗體復合物 的吸附起重要作用。抗原、抗體和其它生物分子通過多種機制吸附至載體表面，這包括通過 疏水鍵、流水/離子鍵的被動吸附，通過引入其它活性基團如氨基和碳基的共價結合，以及 通過表面改性后的親水鍵結合。
[0021] (8)PBS :憐酸緩沖液（phosphate buffered saline)，濃度為 0· 01mol/L。NaHC03 緩沖液：碳酸氫鈉緩沖液，濃度為200mmol/L，pH 9. 6。
[0022] (9)封閉液：明膠含量為2. 5 %的PBST溶液，作用為封閉非特異結合，降低ELISA 背景。
[0023] (10)PBST :在0· 01mol/L PBS中含有0· 05% Tween-20即為磷酸鹽吐溫緩沖液， PBST。
[0024] (11)標準曲線的制作方法如下：每次試驗時將血紅蛋白-磷酸化α -突觸核蛋白 復合體進行系列稀釋，與樣品同時進行檢測，讀取相對應405nm處吸光值，做出其與濃度之 間的關系曲線。
[0025] 優(yōu)選的本發(fā)明的檢測紅細胞內與血紅蛋白結合的磷酸化α-突觸核蛋白含量的 方法，步驟如下：
[0026] 步驟 1，
[0027] 取靜脈血，必要時可以加入EDTA、肝素或枸櫞酸抗凝，分離紅細胞，經過離心即得 紅細胞胞漿蛋白；
[0028] 步驟 2，
[0029] 抗人血紅蛋白單克隆抗體包被ELISA酶標板，并加入封閉液進行封閉，隨后加入 上步得到的紅細胞胞漿蛋白，或血紅蛋白-磷酸化α -突觸核蛋白復合物標準蛋白。
[0030] 步驟 3，
[0031] 向上步ELISA酶標板中加入生物素化的抗磷酸化人α-突觸核蛋白單克隆抗體， 親和素標記的堿性磷酸酶，對硝基苯磷酸顯色液；
[0032] 步驟 4，
[0033] 在405nm處測定酶標板各孔的吸光度值，根據標準曲線計算紅細胞內與血紅蛋白 結合的磷酸化α-突觸核蛋白含量。
[0034] 特別優(yōu)選的本發(fā)明的檢測紅細胞內與血紅蛋白結合的磷酸化α-突觸核蛋白含 量的方法，步驟如下：
[0035] 步驟 1，
[0036] 取5-10ml抗凝血，混勻，貼壁加入至離心管中，記錄全血的體積，1 :1加入PBS，充 分混勻。
[0037] 將稀釋后的全血緩慢加至淋巴細胞分離液上，離心，分離紅細胞層。將紅細胞轉移 到新的離心管中，加PBS，離心，_80°C保存。
[0038] 凍存紅細胞在室溫融化后放入離心機，離心，上層即為紅細胞胞漿蛋白。
[0039] 步驟 2，
[0040] 包被：用NaHC03緩沖液稀釋抗人血紅蛋白抗體至終濃度為0. 1-4 μ g/mL。向酶標 板各孔加入該抗體稀釋液，孵育過夜。沖洗。
[0041] 封閉：向酶標板各孔加入封閉液，孵育1?2小時。沖洗。加入紅細胞胞漿樣品， 或血紅蛋白-磷酸化α -突觸核蛋白復合物標準蛋白，孵育1?2小時。沖洗。
[0042] 步驟 3，
[0043] 用封閉液稀釋生物素化的抗磷酸化人α-突觸核蛋白單克隆抗體至終濃度為 0. 1?2μ g/mL。向酶標板的各孔加入該抗體稀釋液，孵育1?2小時。沖洗。
[0044] 用封閉液稀釋親和素標記的堿性磷酸酶，向酶標板的各孔加入該酶稀釋液，孵育 0.5?2小時。沖洗。
[0045] 向酶標板的各孔加入對硝基苯磷酸顯色液，顯色10?50分鐘。
[0046] 步驟 4，
[0047] 在紫外分光光度計405nm處測定酶標板各孔的吸光度值。
[0048] 根據體外制備的血紅蛋白-磷酸化α -突觸核蛋白復合體標準品的濃度與405nm 處吸光值之間的關系曲線，計算樣品中與血紅蛋白結合的磷酸化α-突觸核蛋白復合體的 含量。
[0049] 本發(fā)明所述的方法，其中，抗人血紅蛋白單克隆抗體可以是任何一種特異性識別 人血紅蛋白的單克隆抗體，在市場上可以買到。
[0050] 本發(fā)明所述的方法，其中，抗磷酸化人α-突觸核蛋白單克隆抗體為任何一種識 別磷酸化人α-突觸核蛋白的單克隆抗體，在市場上可以買到。優(yōu)選的為識別pSerl29的 磷酸化人α-突觸核蛋白的單克隆抗體。
[0051] 本發(fā)明所述的方法中，其中，pSerl29磷酸化人α-突觸核蛋白的制備方法如 下：將630ymol/L的人基因重組α-突觸核蛋白與酪蛋白激酶II(casein kinase II) (NewEnglandBiolabs，Ipswitch，MA，USA)在lml緩沖液（20mMT;ris-HCl，pH7·5,50mM KC1，10mM MgC12，and ImM ATP)在30°C條件下反應24小時。反應通過煮沸終止。反應產物 于4-C、113, OOOXg離心20分鐘去除沉淀，上清通過陰離子交換層析純化，并利用Western blot分析法和質譜鑒定。得到的磷酸化α-突觸核蛋白進一步用硫酸銨沉淀法濃縮。
[0052] 本發(fā)明所述的方法，其中，其中生物素化的抗磷酸化人α-突觸核蛋白單克隆抗 體制備方法如下：
[0053] 1)用無水DMS0配制10mg/mL生物素Ν-羥基琥珀酰亞胺酯溶液。
[0054] 2)用硼酸鹽緩沖液（0· lmol/L，pH 8. 8)配制濃度至少為1?3mg/mL的抗體溶液， 若抗體儲存時加入了疊氮鈉，則標記前需先在硼酸鹽緩沖液中充分透析以除去疊氮鈉。
[0055] 3)按25?100 μ g的比率將生物素酯加入抗體中，混合均勻并在室溫下孵育4h。 在完成結合反應之前，DMS0的終濃度不能低于5%，否則生物素酯會出現(xiàn)沉淀。高濃度的生 物素酯會導致多個生物素分子結合在抗體上，因此可能會使所有抗體都被標記。較低的比 率則會是使生物素化保持在最低限度（25μ g生物素酯抗體的最初摩爾比為10 :1)。
[0056] 4)每250 μ g生物素酯內加入20 μ L的lmol/L的氯化銨，室溫孵育10min。
[0057] 5)將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結合的生物素或者用蛋 白A或蛋白G層析柱純化標記抗體。
[0058] 6)純化抗體冷凍抽干，4_8°C保存。本發(fā)明經過研究發(fā)現(xiàn)，上述方法與現(xiàn)有檢測體 液樣本中的磷酸化α-突觸核蛋白技術相比具有如下優(yōu)點：1)血液樣本易于獲得，適用于 大規(guī)模篩查；2)紅細胞內血紅蛋白樣本量大，提取與保存樣本較便捷；3)不受溶血影響。在 現(xiàn)有方法中，無論針對腦脊液磷酸化α -突觸核蛋白的檢測，還是針對血楽或血楽磷酸化 α -突觸核蛋白的檢測，均存在溶血對樣本的污染的問題。因為，紅細胞中的α -突觸核蛋 白含量占全血的99%，因此，即使是少量溶血也能夠影響測試結果；4)血紅蛋白結合磷酸 化α-突觸核蛋白含量較高，測試結果穩(wěn)定。
[0059] 以下為目前針對腦脊液和血液中磷酸化α-突觸核蛋白診斷方法的主要文獻及 其結果：
[0060] l.Wang Y, Shi M, Chung KA, Zabetian CP, Leverenz JB, Berg D,Srulijes K,Trojanowski JQ，Lee VM, Siderowf AD,Hurtig H, Litvan I，Schiess MC, Peskind ER，Masuda M, Hasegawa M，Lin X，Pan C，Galasko D，Goldstein DS，Jensen PH，Yang H,Cain KC, Zhang J. Phosphorylated a -synuclein in Parkinson's disease. Sci Transl Med. 2012Feb 15 ；4 (121) : 121ra20.
[0061] 2. Foulds PG，Diggle P，Mitchell JD，Parker A，Hasegawa M，Masuda-Suzukake M，Mann DM, Allsop D. A longitudinal study on a -synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 2013 ；3:2540.
[0062] 由于本發(fā)明效果的優(yōu)越性，本發(fā)明人根據上述方法制備了一種檢測試劑盒，所述 試劑盒包括以下試劑：
[0063] 抗人血紅蛋白單克隆抗體
[0064] 抗磷酸化人α-突觸核蛋白單克隆抗體
[0065] 根據需要，所述試劑盒還可包括以下輔助試劑：
[0066] 堿性磷酸酶，或親和素標記的堿性磷酸酶
[0067] 對硝基苯磷酸顯色液
[0068] ELISA 酶標板
[0069] PBS
[0070] NaHC03 緩沖液
[0071] 封閉液
[0072] PBST
[0073] 其中，
[0074] PBS的濃度為0· 01mol/L，配制方法為
[0075] Na2HP04 2.72 g NaH2P04 0.28 g NaCl 9.00 g DDW (雙蒸水） 10冊ml
[0076] NaHC03緩沖液的濃度為200mmol/L，pH 9. 6,配制方法為
[0077] NaHC03 0. 84g
[0078] 2〇% 疊氮鈉（NaN3) 50 μ 1
[0079] DDW 50ml
[0080] 封閉液的濃度為2. 5%，配制方法為
[0081] 明膠 2.5g
[0082] PBST 100ml
[0083] PBST 為含 0· 05% Tween-20 的 0· 01mol/L PBS，配制方法為
[0084] Na2HP04 2.72 g NaH2P04 0.28 g NaC'l 9.00 g
[0085] DDW 1000 ml Tween-20 500 μΙ
[0086] 上述試劑盒的使用是以血紅蛋白-磷酸化α-突觸核蛋白復合體作為標準蛋白， 以該復合體濃度與吸光度值的關系曲線作為標準曲線，通過測定樣本中的血紅蛋白結合磷 酸化a-突觸核蛋白復合體的濃度達到診斷帕金森病的目的。
[0087] 本發(fā)明的試劑盒，各試劑分別包裝，優(yōu)選使用包裝管，每個包裝管中裝入試劑的量 以夠一個樣本使用量為基本量，可以擴大到10個，100個，1000個樣本的使用量。
[0088] 本發(fā)明的試劑盒的使用是根據上述檢測紅細胞內血紅蛋白結合磷酸化人a-突 觸核蛋白含量的方法進行的，使用時將試劑盒中的試劑根據需要配制成相應的濃度，按照 所述方法測定即可。
[0089] 為研究本發(fā)明，還進行了以下重復性試驗，精密度試驗，檢測方法的篩選等試驗。
[0090] 將實施例3中制備的試劑盒分別取三批進行精密度實驗。以實施例3中所抽取的 試劑盒測定三份高、中、低值樣本〇. 5mmol/L、0. 125mmol/L和0. 03125mmol/L各8次。計算 測定濃度的變異系數。實施例3中的三批試劑盒的結果表明變異系數小于8. 0%。
[0091] 相同樣本重復實驗3次，結果顯示相對標準差RSD為0. 60%。
[0092] 采用棋盤滴定試驗確定抗體包被濃度、樣本稀釋倍數以及生物素化抗體濃度。根 據初步確定的濃度縮小間距，再做進一步棋盤滴定，確定最佳試驗條件。最終確定人血紅蛋 白抗體包被濃度為2 μ g/mL,樣本稀釋倍數為1 :4,生物素化抗體濃度為1 μ g/mL為最佳實 驗條件。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0093] 圖1紅細胞胞漿蛋白分離過程示意圖
[0094] 圖2ELISA方法檢測帕金森病人（PD)紅細胞中與血紅蛋白結合的磷酸化a -突觸 核蛋白的含量明顯高于健康對照（Con)。

【具體實施方式】：
[0095] 以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。
[0096] 實施例1，
[0097] 紅細胞胞漿蛋白的制備（圖1)
[0098] 步驟 1，
[0099] 取5-10ml抗凝血（EDTA、肝素或枸櫞酸抗凝）。將抗凝血上下顛倒輕輕混勻，貼壁 加入至50ml離心管中，記錄全血的體積，1:1加入PBS，充分混勻。
[0100] 步驟 2，
[0101] 將稀釋后的全血緩慢加至淋巴細胞分離液上,400Xg，離心20min。此時管內液體 由上至下的順序依次為血漿層、白膜層（外周血單個核細胞）、分離液層以及紅細胞層。
[0102] 步驟 3，
[0103] 吸去血漿層、白膜層和分離液層，將底層的紅細胞轉移到新的50ml離心管中，力口 PBS至40ml，2000rpm，離心lOmin，如此反復3次。分裝，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0104] 步驟 4，
[0105] 凍存紅細胞在室溫融化后放入4°C離心機，13000rpm，離心lOmin，抽提紅細胞胞 楽蛋白備用。
[0106] 實施例2，
[0107] 血紅蛋白結合磷酸化α -突觸核蛋白的ELISA檢測過程
[0108] 步驟 1，
[0109] 包被：用NaHC03緩沖液稀釋抗人血紅蛋白抗體至終濃度為約0. 1- 2 μ g/mL。向 酶標板各孔加入1〇〇 μ L該抗體稀釋液，4°C孵育過夜。用PBST (其為含有Tween-20的PBS) 沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0110] 步驟 2，
[0111] 封閉：向酶標板各孔加入100 μ L封閉液（其為含有明膠和Tween-20的PBS)，在 37°C孵育1?2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0112] 步驟 3，
[0113] 加樣：向各孔加入100 μ L已制備好的紅細胞胞漿樣品，濃度為8?10 μ g/mL，在 37°C孵育1?2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0114] 步驟 4，
[0115] 加檢測抗體：用封閉液稀釋生物素化的抗磷酸化人α -突觸核蛋白單克隆抗體抗 體至終濃度為0. 1?2. Ο μ g/mL。向酶標板的各孔加入100 μ L該抗體稀釋液，在37°C孵育 1?2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。步驟4，
[0116] 加標記酶和顯色液：用封閉液稀釋親和素標記的堿性磷酸酶（由Sigma公司出 售），向酶標板的各孔加入100 μ L該酶的稀釋液，在37°C孵育0. 5?2小時。用PBST沖洗 酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0117] 向酶標板的各孔加入100 μ L pNPP(對硝基苯磷酸顯色液，由Sigma公司出售）， 37 °C顯色10?50分鐘。
[0118] 步驟 5，
[0119] 測定吸光度值：用酶標儀測定405nm處酶標板各孔的吸光度值。
[0120] 根據體外制備的血紅蛋白-磷酸化α -突觸核蛋白復合體標準品中磷酸化α -突 觸核蛋白的濃度與405nm處吸光值之間的關系曲線，計算樣品中與血紅蛋白結合的磷酸化 α-突觸核蛋白復合體的量。
[0121] 實施例3，
[0122] ELISA法真實樣品的檢測（圖2)
[0123] 采用相對定量ELISA法，對15例臨床診斷的帕金森病人和15例健康對照人群 血液紅細胞胞漿中與血紅蛋白結合的磷酸化突觸核蛋白的量進行檢測。結果顯示帕 金森病人紅細胞中與血紅蛋白結合的磷酸化α-突觸核蛋白的量明顯高于健康對照（ρ < 0· 01)。
[0124] 實施例4，
[0125] 試劑盒成分舉例（1塊ELISA酶標版，可用于24個人樣本檢測）
[0126] 抗人血紅蛋白單克隆抗體20 μ g
[0127] 生物素化的抗磷酸化人α -突觸核蛋白單克隆抗體1〇 μ g
[0128] 堿性磷酸酶，或親和素標記的堿性磷酸酶5 μ L
[0129] 對硝基酚磷酸顯色液10mL
[0130] ELISA 酶標板
[0131] PBS 0. Olmol/L, 10mL
[0132] NaHC03 緩沖液 200mmol/L，lOmL
[0133] 封閉液 lOmL
[0134] PBST 300mL。
【權利要求】
1. 一種用于檢測與血紅蛋白結合的磷酸化α-突觸核蛋白含量的試劑盒，試劑盒中包 括以下試劑：抗人血紅蛋白單克隆抗體，生物素化抗磷酸化人α-突觸核蛋白單克隆抗體， 血紅蛋白-磷酸化α-突觸核蛋白復合體標準蛋白。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，根據需要，所述試劑盒還可包括以下輔助試劑：堿 性磷酸酶，或親和素標記的堿性磷酸酶，對硝基苯磷酸二鈉顯色液，ELISA酶標板，磷酸緩沖 液，NaHC03緩沖液，封閉液，PBST。
3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其中 磷酸緩沖液的濃度和pH值為0. Olmol/L，pH 7. 4， NaHC03緩沖液的濃度和pH值為200mmol/L, pH 9. 6， PBST 的濃度為含 0· 05% Tween-20 的 0· 01mol/L PBS， 封閉液的成分為含2. 5%明膠的PBST。
4. 根據權利要求2所述的試劑盒，其中各試劑分別包裝，每個包裝裝入試劑的量以夠 一個樣本使用量為基本量，可以擴大到10個，1〇〇個，1〇〇〇個樣本的使用量。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其中抗人血紅蛋白單克隆抗體可以是任何一種特異 性識別人血紅蛋白的單克隆抗體。
6. 根據權利要求1所述的試劑盒，其中抗磷酸化人α-突觸核蛋白單克隆抗體為任何 一種識別磷酸化人α -突觸核蛋白的單克隆抗體，如：識別pSerl29的磷酸化人α -突觸核 蛋白的單克隆抗體。
7. 根據權利要求1所述的試劑盒，其中血紅蛋白-磷酸化α-突觸核蛋白復合體標準 蛋白的制備方法如下： 1) 用500 μ L的0. Olmol/L PBS溶解磷酸化人α -突觸核蛋白和血紅蛋白，使終濃度分 別為 2mol/L 與 lmol/L，于 37°C、230rpm、振蕩孵育 24h ; 2) 孵育樣品在l〇〇〇〇Xg離心5min，吸取上清，以PBS為流動相，HiPrep 26/60Sephacryl S_200High Resolution層析柱凝膠過濾，分離血紅蛋白-磷酸化α-突觸 核蛋白復合體； 3) 用SWATH定量蛋白組方法，確定平均每個血紅蛋白分子結合的磷酸化α-突觸核蛋 白分子數，從而計算出磷酸化α-突觸核蛋白占復合體的重量百分比或摩爾百分比。
8. -種用權利要求1所述的試劑盒檢測紅細胞內與血紅蛋白結合的磷酸化α-突觸核 蛋白含量的方法，包括以下步驟： 1) 分離紅細胞中的胞漿蛋白； 2) 用抗人血紅蛋白單克隆抗體捕獲胞漿蛋白中的血紅蛋白； 3) 用生物素化的抗磷酸化人α-突觸核蛋白單克隆抗體檢測與血紅蛋白結合的磷酸 化α-突觸核蛋白； 4) 加入親和素標記堿性磷酸酶和顯色劑，進行顯色； 5) 用分光光度法對顯色的樣品進行吸光度測定，用標準曲線計算樣品中血紅蛋白結合 的磷酸化α-突觸核蛋白的含量。
9. 根據權利要求8所述的方法，步驟如下： 步驟1， 取靜脈血，必要時可以加入EDTA、肝素或枸櫞酸抗凝，分離紅細胞，凍融破碎紅細胞，再 經過離心即得紅細胞胞漿蛋白； 步驟2， 抗人血紅蛋白單克隆抗體包被ELISA酶標板，并加入封閉液進行封閉，隨后加入步驟 1得到的紅細胞胞漿蛋白，或不同濃度的血紅蛋白-磷酸化α-突觸核蛋白復合體標準蛋 白； 步驟3， 向步驟2的ELISA酶標板中加入生物素化的抗磷酸化人α -突觸核蛋白單克隆抗體， 親和素標記的堿性磷酸酶，對硝基苯磷酸顯色液； 步驟4， 在405nm處測定酶標板各孔的吸光度值，根據標準曲線計算與血紅蛋白結合的磷酸化 α-突觸核蛋白的含量。
10.根據權利要求8所述的方法，步驟如下： 步驟1， 取5-10ml抗凝血，混勻，貼壁加入至離心管中，記錄全血的體積，1 :1加入PBS，充分混 勻， 將稀釋后的全血緩慢加至淋巴細胞分離液上，離心，分離紅細胞層。將紅細胞轉移到新 的離心管中，加PBS，離心，-80°C保存， 凍存紅細胞在室溫融化后放入離心機，離心，上層即為紅細胞胞漿蛋白， 步驟2， 包被：用NaHC03緩沖液稀釋抗人血紅蛋白抗體至終濃度為0. 1?4. 0 μ g/mL。向酶標 板各孔加入該抗體稀釋液，孵育過夜。沖洗， 封閉：向酶標板各孔加入封閉液，孵育1?2小時，沖洗，加入紅細胞胞漿樣品，或不同 濃度的血紅蛋白-磷酸化α -突觸核蛋白復合體標準蛋白，孵育1?2小時，沖洗， 步驟3， 用封閉液稀釋生物素化的抗磷酸化人α -突觸核蛋白單克隆抗體至終濃度為0. 1? 2. 0 μ g/mL。向酶標板的各孔加入該抗體稀釋液，孵育1?2小時，沖洗， 用封閉液稀釋親和素標記的堿性磷酸酶，向酶標板的各孔加入該酶的稀釋液，孵育 0. 5?2小時，沖洗， 向酶標板的各孔加入對硝基苯磷酸顯色液，顯色10?50分鐘， 步驟4， 用紫外分光光度計測定405nm處的酶標板各孔的吸光度值， 根據體外制備的血紅蛋白-磷酸化α -突觸核蛋白復合體標準蛋白的濃度與405nm處 吸光值之間的關系曲線，計算樣品中與血紅蛋白結合的磷酸化人α-突觸核蛋白的含量。
【文檔編號】G01N33/68GK104215777SQ201410477919
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權日:2014年9月18日
【發(fā)明者】于順, 楊巍巍, 李昕 申請人:首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院