一種乳制品中乳鐵蛋白的檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，所述的檢測方法包括以下步驟：先將樣品溶解于水，離心去除脂肪，再加入酸試劑調(diào)節(jié)PH再離心，最后加入硫酸銨鹽析，離心，制得乳清即樣品乳鐵蛋白粗提物；再將乳清即樣品乳鐵蛋白粗提物過濾，制得樣品乳鐵蛋白精提物；最后進(jìn)行高效液相色譜測定，選用外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法計(jì)算峰面積，確定樣品中乳鐵蛋白的含量。本發(fā)明在樣品常規(guī)預(yù)處理的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，可以對乳制品中乳鐵蛋白進(jìn)行快速富集，樣品預(yù)處理簡單，費(fèi)時(shí)短，且檢測費(fèi)用低，受外界環(huán)境變化及操作人員的影響小，在對乳鐵蛋白進(jìn)行預(yù)處理后進(jìn)行高效液相色譜法檢測，可將乳鐵蛋白與其他雜質(zhì)很好的分開，保證了乳鐵蛋白檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【專利說明】—種乳制品中乳鐵蛋白的檢測試劑盒及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，具體涉及一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒及檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002]乳鐵蛋白又稱為乳轉(zhuǎn)鐵蛋白或紅蛋白，于1939年被外國學(xué)者發(fā)現(xiàn)。它是一種紅色糖蛋白，在淚液、汗液、精液、膽汁、乳汁及血液中性粒細(xì)胞中廣泛存在，尤其在初乳中含量最聞，可達(dá)7g/L。乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)與血清轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)蛋白相似，牛和人乳鐵蛋白分別由689、691個(gè)氣基酸組成，其中谷氨酸、天冬氨酸及丙氨酸含量較高，半胱氨酸含量較少，基本不含硫氨酸。乳鐵蛋白與鐵的親和力明顯高于血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，每個(gè)乳鐵蛋白可結(jié)合兩分子三價(jià)鐵及兩分子 HC03-或 C032-。
[0003]近年來，隨著生物工程技術(shù)的不斷進(jìn)步與成熟，科學(xué)家們已經(jīng)完成了乳鐵蛋白生物學(xué)功能的有關(guān)研究，確定了其對人體的9大重要功能，具體包括:提高腸道對鐵離子的吸收、廣譜抗菌和抑菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫等。由于乳鐵蛋白具有上述多種生理功能，因此，其在貧血及骨質(zhì)疏松等疾病的診治中均有著重要的作用。目前，乳鐵蛋白被公認(rèn)是一種天然、安全的功能性蛋白，因此，它在保健食品及藥品中均有著廣泛的應(yīng)用前景，同時(shí)，也受到有關(guān)生廠商的格外重視。GB2760文件中明確將乳鐵蛋白作為乳制品添加劑，可將其應(yīng)用于嬰兒配方奶粉、幼兒奶粉及學(xué)生奶焰中，使用量為30-100mg/100g。因此，對乳鐵蛋白靈敏快速的檢測，對于市售乳制品的質(zhì)量監(jiān)督具有重大意義。
[0004]目前測定乳制品中乳鐵蛋白含量的方法包括酶聯(lián)免疫法、凝膠色譜法及紫外分光光度法等，酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高，樣品無需純化及最小檢測限低等優(yōu)點(diǎn)，但易受環(huán)境及操作者的影響，多次檢測結(jié)果差異較大。紫外分光光度法操作簡便，但易受其他物質(zhì)的干擾，不易準(zhǔn)確定量。凝膠色譜法操作簡便，但僅適用于高純度樣品中乳鐵蛋白的測定。因此，急需尋求一種操作簡便、檢測準(zhǔn)確、適用樣本廣泛的檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種檢測靈敏度高、準(zhǔn)確性高、樣品預(yù)處理簡單的檢測方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，包括以下步驟:
Cl)分離純化:取樣品5-10g溶解于50-100ml去離子水中，離心20_30min，去除脂肪，加入酸試劑，調(diào)節(jié)PH至4-5,再次離心20-30min ,加入硫酸銨鹽析,離心,制得乳清即樣品乳鐵蛋白粗提物；
(2)精提:將步驟(I)中制得的乳鐵蛋白粗提物過濾，制得樣品乳鐵蛋白精提物；
(3)將步驟(2)中制得的樣品乳鐵蛋白精提物進(jìn)行高效液相色譜測定，選用外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法計(jì)算峰面積，確定樣品中乳鐵蛋白的含量。
[0007]優(yōu)選的，所述的酸試劑為鹽酸，所述的鹽酸濃度為l-3mol/L。
[0008]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的硫酸胺為質(zhì)量濃度為60%_90%的硫酸銨溶液。
[0009]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的離心速度均為4500-5000r/min。
[0010]優(yōu)選的，步驟(2)中所述的過濾采用的是纖維素濾膜，所述的纖維素濾膜的直徑為
0.35-0.45um。
[0011]優(yōu)選的，步驟(3)中所述的高效液相色譜測定的參數(shù)為:色譜柱采用弱陽離子交換色譜柱，流動(dòng)相為含有氯化物的磷酸鹽緩沖液或含有硼酸鹽的磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)量流速為0.5-1.0ml/min，進(jìn)樣量為10_15ul，檢測波長為265_285nm，柱溫為28_35°C。
[0012]優(yōu)選的，所述的弱陽離子交換色譜柱選自碘丙基陽離子交換色譜柱、碘酸基陽離子交換色譜柱或羧甲基陽離子交換色譜柱中的一種。
[0013]優(yōu)選的，所述的氯化物選自氯化鈉或氯化鉀中的一種或多種，所述的硼酸鹽選自硼酸鈉或硼酸鉀中的一種或多種。
[0014]優(yōu)選的，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為0.03-0.08mol/L,所述的磷酸鹽緩沖液的共軛堿為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀。
[0015]步驟(3)中所述的高效液相色譜法測定時(shí)的洗脫程序具體為:
氯化物或硼酸鹽的濃度變化范圍被洗脫物質(zhì)
0^0.1 mol/L -0.9"?.0mol/L 與陽離子不結(jié)合或結(jié)合弱的蛋白，0.9?1.0mol/L-1.Tl.2 mol/L乳鐵蛋白，
1.1?1.2 mol/L-1.4?1.5 mol/L 其他雜質(zhì)。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
(I)本發(fā)明根據(jù)乳鐵蛋白的理性特性，在樣品常規(guī)預(yù)處理的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，采用脫月旨、酸法去除酪蛋白及硫酸銨沉淀的方法，先進(jìn)行粗提、再進(jìn)行精提，可以對乳制品中乳鐵蛋白進(jìn)行快速富集，與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法相比，樣品預(yù)處理簡單，費(fèi)時(shí)短，且檢測費(fèi)用低，受外界環(huán)境變化及操作人員的影響小。
[0017](2)本發(fā)明將乳制品預(yù)處理后進(jìn)行高效液相色譜測定，可將其他蛋白及有關(guān)雜質(zhì)最大限度洗脫，而不會(huì)使乳鐵蛋白變性，在適宜的流動(dòng)相及一定色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜檢測，可使乳鐵蛋白與其他雜質(zhì)很好的分開，分離度及靈敏度均很高，保證了乳鐵蛋白檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明:
實(shí)施例1
一種乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，包括以下步驟:
(1)分離純化:取嬰兒奶粉5g溶解于50ml去離子水中，以4500r/min離心20min,去除脂肪，加入濃度為lmol/L的鹽酸，調(diào)節(jié)PH至4，再次離心20min，加入質(zhì)量濃度為60%的硫酸銨溶液鹽析，離心lOmin，制得乳清即樣品乳鐵蛋白粗提物；
(2)精提:將步驟(I)中制得的乳鐵蛋白粗提物采用直徑為0.35um的纖維素濾膜過濾，制得樣品乳鐵蛋白精提物；
(3)將步驟(2)中制得的樣品乳鐵蛋白精提物進(jìn)行高效液相色譜測定，色譜條件:色譜柱采用碘丙基陽離子交換色譜柱，流動(dòng)相為含有氯化鈉的磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)量流速為
0.5ml/min，進(jìn)樣量為10ul，檢測波長為265nm，柱溫為28 V ;選用外標(biāo)法計(jì)算峰面積，確定樣品中乳鐵蛋白的含量。
[0019]優(yōu)選的，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為0.03mol/L,所述的磷酸鹽緩沖液的共軛堿為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉。
[0020]步驟(3)中所述的高效液相色譜法測定時(shí)的洗脫程序具體為:
氯化物或硼酸鹽的濃度變化范圍被洗脫物質(zhì)
O mol/L -0.9mol/L與陽離子不結(jié)合或結(jié)合弱的蛋白，1.0mol/L-1.2
mol/L乳鐵蛋白，
1.2 mol/L-1.5 mol/L其他雜質(zhì)。
[0021]實(shí)施例2
一種乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，包括以下步驟:
(1)分離純化:取幼兒奶粉1g溶解于10ml去離子水中，以5000r/min離心30min，去除脂肪，加入濃度為3mol/L的鹽酸，調(diào)節(jié)PH至5，再次離心30min，加入質(zhì)量濃度為90%的硫酸銨溶液鹽析，離心20min，制得乳清即樣品乳鐵蛋白粗提物；
(2)精提:將步驟(I)中制得的乳鐵蛋白粗提物采用直徑為0.45um的纖維素濾膜過濾，制得樣品乳鐵蛋白精提物；
(3)將步驟(2)中制得的樣品乳鐵蛋白精提物進(jìn)行高效液相色譜測定，色譜條件:色譜柱采用碘酸基陽離子交換色譜柱，流動(dòng)相為含有氯化鉀的磷酸鹽緩沖液，流速為1.0ml/min，進(jìn)樣量為15ul，檢測波長為285nm，柱溫為35°C ;選用外標(biāo)法計(jì)算峰面積，確定樣品中乳鐵蛋白的含量。
[0022]所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為0.08mol/L,所述的磷酸鹽緩沖液的共軛堿為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉。
[0023]步驟(3)中所述的高效液相色譜法測定時(shí)的洗脫程序具體為:
氯化物或硼酸鹽的濃度變化范圍被洗脫物質(zhì)
0.1 mol/L -0.9mol/L與陽離子不結(jié)合或結(jié)合弱的蛋白，0.9mol/L-1.lmol/L 乳鐵蛋白，
1.1 mol/L-1.4 mol/L其他雜質(zhì)。
[0024]實(shí)施例3
一種乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，包括以下步驟:
(1)分離純化:取女士奶粉8g溶解于80ml去離子水中，以4800r/min離心25min，去除脂肪，加入濃度為2mol/L的鹽酸，調(diào)節(jié)PH至4.5，再次離心25min，加入質(zhì)量濃度為75%的硫酸銨溶液鹽析，離心15min，制得乳清即樣品乳鐵蛋白粗提物；
(2)精提:將步驟(I)中制得的乳鐵蛋白粗提物采用直徑為0.4um的纖維素濾膜過濾，制得樣品乳鐵蛋白精提物；
(3)將步驟(2)中制得的樣品乳鐵蛋白精提物進(jìn)行高效液相色譜測定，色譜條件:色譜柱采用羧甲基陽離子交換色譜柱，流動(dòng)相為含有硼酸鈉的磷酸鹽緩沖液，流速為0.8ml/min，進(jìn)樣量為12ul，檢測波長為280nm，柱溫為30°C ;選用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算峰面積,確定樣品中乳鐵蛋白的含量。
[0025]優(yōu)選的，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為0.06mol/L,所述的磷酸鹽緩沖液的共軛堿為磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀。
[0026]步驟(3)中所述的高效液相色譜法測定時(shí)的洗脫程序具體為:
氯化物或硼酸鹽的濃度變化范圍被洗脫物質(zhì)
Omol/L -0.9mol/L與陽離子不結(jié)合或結(jié)合弱的蛋白，0.9mol/L_l.I
mol/L乳鐵蛋白，
1.lmol/L-1.4mol/L其他雜質(zhì)。
[0027]上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)分離純化:取樣品5-10g溶解于50-100ml去離子水中，離心20_30min，去除脂肪，加入酸試劑，調(diào)節(jié)PH至4-5,再次離心20-30min ,加入硫酸銨鹽析,離心10-20min,制得乳清即樣品乳鐵蛋白粗提物； (2)精提:將步驟(I)中制得的乳鐵蛋白粗提物過濾，制得樣品乳鐵蛋白精提物； (3)將步驟(2)中制得的樣品乳鐵蛋白精提物進(jìn)行高效液相色譜測定，選用外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法計(jì)算峰面積，確定樣品中乳鐵蛋白的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，其特征在于，所述的酸試劑為鹽酸，所述的鹽酸濃度為l-3mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，其特征在于，步驟(I)中所述的硫酸胺為質(zhì)量濃度為60%-90%的硫酸銨溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，其特征在于，步驟(I)中所述的離心速度均為4500-5000r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中所述的過濾采用的是纖維素濾膜，所述的纖維素濾膜的直徑為0.35-0.45um。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中所述的高效液相色譜測定的參數(shù)為:色譜柱采用弱陽離子交換色譜柱，流動(dòng)相為含有氯化物的磷酸鹽緩沖液或含有硼酸鹽的磷酸鹽緩沖液，流動(dòng)量流速為0.5-1.0ml/min,進(jìn)樣量為10-15ul，檢測波長為 265-285nm，柱溫為 28_35°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，其特征在于，所述的弱陽離子交換色譜柱選自碘丙基陽離子交換色譜柱、碘酸基陽離子交換色譜柱或羧甲基陽離子交換色譜柱中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，其特征在于，所述的氯化物選自氯化鈉或氯化鉀中的一種或多種，所述的硼酸鹽選自硼酸鈉或硼酸鉀中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，其特征在于，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為0.03-0.08mol/L,所述的磷酸鹽緩沖液的共軛堿為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳制品中乳鐵蛋白的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中所述的高效液相色譜法測定時(shí)的洗脫程序具體為: 氯化物或硼酸鹽的濃度變化范圍被洗脫物質(zhì)， .0^0.1 mol/L -0.9"?.0mol/L 與陽離子不結(jié)合或結(jié)合弱的蛋白，0.9?1.0mol/L-1.Tl.2 mol/L乳鐵蛋白，
.1.1?1.2 mol/L-1.4?1.5 mol/L 其他雜質(zhì)。
【文檔編號】G01N30/88GK104280498SQ201410482589
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月20日
【發(fā)明者】郭狄 申請人:中山鼎晟生物科技有限公司