一種卷煙濾嘴水浸提液體外微核試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置方法
【專利摘要】本發(fā)明一種卷煙濾嘴水浸提液體外微核試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置方法，該方法為：1）選取相同數(shù)量的符合制備陽(yáng)性對(duì)照條件的卷煙濾嘴和待測(cè)樣品組卷煙濾嘴；2）配制濃度為200-400μg/ml的環(huán)磷酰胺水溶液；3）在用于制備陽(yáng)性對(duì)照組的卷煙濾嘴上均勻噴灑環(huán)磷酰胺水溶液，待其自然干燥后備用；4）用相同的方法對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組和待測(cè)樣品組卷煙濾嘴進(jìn)行浸提；5）浸提液作為溶劑，用粉末細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行配制，將配制后的溶液過(guò)濾除菌；6）對(duì)經(jīng)步驟5）處理的提取液進(jìn)行體外微核試驗(yàn)。通過(guò)該方法設(shè)置的陽(yáng)性對(duì)照，可以驗(yàn)證卷煙濾嘴的提取過(guò)程和后續(xù)對(duì)卷煙濾嘴水浸提液進(jìn)行的體外微核試驗(yàn)是否可靠。
【專利說(shuō)明】一種卷煙濾嘴水浸提液體外微核試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于煙草【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種對(duì)卷煙濾嘴水浸提液進(jìn)行體外微核試驗(yàn)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置方法。

【背景技術(shù)】
[0002]微核試驗(yàn)是檢測(cè)染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法。無(wú)著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)成為微核。體外微核試驗(yàn)一般是利用體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞來(lái)進(jìn)行微核的檢測(cè)。它常常作為食品、藥品、牙科材料等的安全性生物學(xué)檢測(cè)手段之一。
[0003]由于卷煙濾嘴和人口腔直接接觸，存在潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)，因此，有必要采用體外微核試驗(yàn)手段，對(duì)其可能存在的潛在危害進(jìn)行考察。對(duì)卷煙濾嘴進(jìn)行體外微核試驗(yàn)時(shí)，首先需要對(duì)卷煙濾嘴進(jìn)行提取，然后再對(duì)提取液進(jìn)行檢測(cè)。因此，試驗(yàn)過(guò)程中需要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，以驗(yàn)證提取過(guò)程和后續(xù)的體外微核試驗(yàn)是否可靠。
[0004]現(xiàn)有的體外微核試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置方法有兩類:第一種方法，如果受試物可以配制成溶液，則使用一定濃度的已知具有遺傳毒性的試劑直接加到細(xì)胞培養(yǎng)液中制成陽(yáng)性對(duì)照；第二種方法，如果受試物需要制備浸提液進(jìn)行測(cè)試，則陽(yáng)性對(duì)照最好為和受試物性質(zhì)相同和相近的具有遺傳毒性的材料，并且該材料使用和受試物相同的方法進(jìn)行提取后，其浸提液應(yīng)在試驗(yàn)中呈明顯的陽(yáng)性反應(yīng)。
[0005]然而現(xiàn)有方法并不適用于卷煙濾嘴浸提液的體外微核試驗(yàn)，這是因?yàn)閷?duì)卷煙濾嘴進(jìn)行體外微核試驗(yàn)需要制備卷煙濾嘴浸提液，因此，使用上述第一種方法設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照則無(wú)法驗(yàn)證提取的過(guò)程是否可靠。而對(duì)于使用第二種方法，由于目前現(xiàn)有的卷煙濾嘴品種未發(fā)現(xiàn)具有遺傳毒性，并且沒(méi)有與卷煙濾嘴性質(zhì)相近的具遺傳毒性的材料，因此為驗(yàn)證卷煙濾嘴的提取過(guò)程和后續(xù)對(duì)卷煙濾嘴水浸提液進(jìn)行的體外微核試驗(yàn)是否可靠，有必要開(kāi)發(fā)一種針對(duì)卷煙濾嘴水浸提液體外微核試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置方法。
[0006]經(jīng)文獻(xiàn)搜索，未發(fā)現(xiàn)與本
【發(fā)明內(nèi)容】
相同文獻(xiàn)的公開(kāi)報(bào)道。
[0007]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)卷煙濾嘴水浸提液進(jìn)行體外微核試驗(yàn)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置方法。通過(guò)該方法設(shè)置的陽(yáng)性對(duì)照，可以驗(yàn)證卷煙濾嘴的提取過(guò)程和后續(xù)對(duì)卷煙濾嘴水浸提液進(jìn)行的體外微核試驗(yàn)是否可靠。
[0009]卷煙抽吸時(shí)濾嘴與人的口腔接觸，對(duì)卷煙濾嘴進(jìn)行提取需要選用和人唾液性質(zhì)相接近的溶劑(水或人工唾液)，因此人為添加到濾嘴上的陽(yáng)性物也是水溶性的。本發(fā)明使用環(huán)磷酰胺作為人為添加的遺傳毒性物質(zhì)。環(huán)磷酰胺的CAS號(hào)為50-18-0，是一種水溶性染色體斷裂劑，是體外微核試驗(yàn)中常用的一種陽(yáng)性對(duì)照試劑。因此，通過(guò)將環(huán)磷酰胺添加到濾嘴上作為陽(yáng)性對(duì)照樣品，然后和待測(cè)樣品一起制備水浸提液進(jìn)行體外微核試驗(yàn)，如果陽(yáng)性對(duì)照呈陽(yáng)性結(jié)果，則說(shuō)明卷煙濾嘴的提取過(guò)程和后續(xù)對(duì)卷煙濾嘴水浸提液進(jìn)行的體外微核試驗(yàn)是可靠的。
[0010]本發(fā)明可通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
選取相同數(shù)量的符合制備陽(yáng)性對(duì)照條件的卷煙濾嘴(作為后續(xù)用于制備陽(yáng)性對(duì)照組的卷煙濾嘴)和待測(cè)樣品組卷煙濾嘴；
步驟(2)配制濃度為200-400 μ g/ml的環(huán)磷酰胺水溶液；
步驟(3)在用于制備陽(yáng)性對(duì)照組的卷煙濾嘴上均勻噴灑步驟(2)配制的環(huán)磷酰胺水溶液，噴灑量應(yīng)使環(huán)磷酰胺在濾嘴浸提試驗(yàn)測(cè)試體系中的理論完全溶出終濃度大于等于20μ g/ml，并使卷煙濾嘴充分吸收環(huán)磷酰胺溶液，待其自然干燥后作為陽(yáng)性對(duì)照組卷煙濾嘴備用;
步驟(4)用相同的方法對(duì)相同數(shù)量的步驟(3)制備的陽(yáng)性對(duì)照組卷煙濾嘴和待測(cè)樣品組卷煙濾嘴進(jìn)行浸提；
步驟(5)使用步驟(4)得到的浸提液作為溶劑，用粉末細(xì)胞培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基說(shuō)明的方法進(jìn)行配制，然后將配制后的溶液過(guò)濾除菌后用于后續(xù)的體外微核試驗(yàn)；
步驟(6)對(duì)經(jīng)步驟(5)處理過(guò)的提取液進(jìn)行體外微核試驗(yàn)，測(cè)試提取液在測(cè)試體系中的濃度為100%、50%、25%和12.5% 4個(gè)劑量(低濃度的測(cè)試液使用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋得到)，提取液的細(xì)胞暴露時(shí)間為24小時(shí)。
[0011]所述步驟(I)中的符合制備陽(yáng)性對(duì)照條件的卷煙濾嘴是指:(I)用于制備陽(yáng)性對(duì)照的卷煙濾嘴不會(huì)因與環(huán)磷酰胺發(fā)生較強(qiáng)化學(xué)反應(yīng)而影響其陽(yáng)性結(jié)果；(2)用于制備陽(yáng)性對(duì)照的卷煙濾嘴不會(huì)因與環(huán)磷酰胺產(chǎn)生較強(qiáng)吸附作用而影響其陽(yáng)性結(jié)果；(3)用于制備陽(yáng)性對(duì)照的卷煙濾嘴水浸提液原液在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中測(cè)出的細(xì)胞存活率應(yīng)大于等于50%。
[0012]步驟(3)中所述的理論完全溶出濃度是指:根據(jù)所配制的環(huán)磷酰胺溶液實(shí)際濃度、環(huán)磷酰胺的實(shí)際噴灑量和提取時(shí)實(shí)際所加的溶劑量，在假定噴灑在濾嘴上的環(huán)磷酰胺在浸提時(shí)可以100%溶出的條件下計(jì)算得到的濃度。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為:本發(fā)明的卷煙濾嘴水浸提液體外微核試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置方法操作簡(jiǎn)單易行，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。本發(fā)明使用的人為添加的陽(yáng)性物環(huán)磷酰胺，是一種水溶性染色體斷裂劑，易于溶解在濾嘴的提取溶劑蒸餾水中。本發(fā)明所設(shè)置的環(huán)磷酰胺水溶液的濃度和測(cè)試劑量可使得體外微核試驗(yàn)呈陽(yáng)性結(jié)果，并且呈現(xiàn)出較好的劑量效應(yīng)關(guān)系。通過(guò)該方法設(shè)置的陽(yáng)性對(duì)照，可以驗(yàn)證卷煙濾嘴的提取過(guò)程和后續(xù)對(duì)卷煙濾嘴水浸提液進(jìn)行的體外微核試驗(yàn)是否可靠。
[0014]

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是以本發(fā)明的方法制備人為陽(yáng)性濾嘴作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)2種隨機(jī)挑選的市售卷煙濾嘴的水浸提液進(jìn)行體外微核試驗(yàn)所得到的不同濃度的浸提液的微核率圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0017]實(shí)施例1 以本發(fā)明的方法制備人為陽(yáng)性濾嘴作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)2種隨機(jī)挑選的市售卷煙濾嘴進(jìn)行體外微核試驗(yàn)。
[0018]1、隨機(jī)挑選2種市售卷煙，每種隨機(jī)抽取20支用于制備待測(cè)樣品組卷煙濾嘴。隨機(jī)抽取20支符合制備陽(yáng)性卷煙濾嘴條件的肯塔基3R4F卷煙用于制備陽(yáng)性對(duì)照組的卷煙濾嘴。將上述卷煙濾嘴切割下來(lái)備用，切割時(shí)應(yīng)避免切到接裝紙和卷煙紙的交疊部分，以防止將卷煙紙和煙絲帶入濾嘴樣品中。
[0019]2、配制濃度為200 μ g/ml的環(huán)磷酰胺水溶液。
[0020]3、在用于制備陽(yáng)性對(duì)照的3R4F卷煙濾嘴上均勻噴灑步驟2中配制的環(huán)磷酰胺水溶液10mL，使環(huán)磷酰胺在卷煙濾嘴浸提試驗(yàn)測(cè)試體系中的理論完全溶出終濃度為20 yg/ml (提取時(shí)加水量為lOOmL)，使卷煙濾嘴充分吸收添加的環(huán)磷酰胺溶液，待卷煙濾嘴自然干燥后作為陽(yáng)性卷煙濾嘴對(duì)照組備用。
[0021]4、用10mL蒸餾水對(duì)步驟3制備好的陽(yáng)性對(duì)照組卷煙濾嘴和2種待測(cè)樣品組卷煙濾嘴(樣品I和樣品2)在40 C下靜直提取30min。
[0022]5、用步驟4得到的水浸提液作為溶劑，用DMEM粉末細(xì)胞培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基說(shuō)明的方法進(jìn)行配制，并加入胎牛血清，使得胎牛血清體所占體積比為提取液總體積的10%，然后將配制后的溶液過(guò)濾除菌，后用于后續(xù)的體外微核試驗(yàn)。
[0023]6、對(duì)經(jīng)步驟5處理過(guò)的提取液使用CHO細(xì)胞進(jìn)行體外微核試驗(yàn)，測(cè)試提取液在測(cè)試體系中的濃度為100%、50%、25%和12.5% 4個(gè)劑量(低濃度的測(cè)試液使用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋得到)。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入細(xì)胞松弛素B，使其濃度為3 μ g/mL。暴露24小時(shí)之后收獲細(xì)胞，經(jīng)低滲和固定處理后用滴片法制作微核玻片。微核玻片經(jīng)Giemsa染色后在顯微鏡下對(duì)1000個(gè)雙核細(xì)胞進(jìn)行微核計(jì)數(shù)。
[0024]7、各樣品不同濃度下的微核率見(jiàn)圖1。由試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，所測(cè)試的2種濾嘴樣品的提取液在4個(gè)受試濃度下均未表現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，且微核率和空白對(duì)照組無(wú)顯著差異性(/7>0.05)，因此為陰性結(jié)果。人為陽(yáng)性濾嘴樣品提取液的微核率隨測(cè)試濃度的增高而降低，具有較為明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，并且100%、50%和25%三個(gè)劑量的微核率與空白對(duì)照組比較都具有顯著性差異ΟΚΟ.05)，因此為陽(yáng)性結(jié)果。說(shuō)明本實(shí)施例中卷煙濾嘴的提取過(guò)程和后續(xù)對(duì)卷煙濾嘴水浸提液進(jìn)行的體外微核試驗(yàn)是可靠的。
[0025]環(huán)磷酰胺水溶液的配制濃度還可以為250 μ g/ml >300 μ g/ml>350 μ g/ml >400μ g/ml 等。
[0026]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效物界定。
【權(quán)利要求】
1.一種卷煙濾嘴水浸提液體外微核試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: 步驟(I)選取相同數(shù)量的符合制備陽(yáng)性對(duì)照條件的卷煙濾嘴和待測(cè)樣品組卷煙濾嘴； 步驟(2)配制濃度為200-400 μ g/ml的環(huán)磷酰胺水溶液； 步驟(3)在用于制備陽(yáng)性對(duì)照組的卷煙濾嘴上均勻噴灑步驟(2)配制的環(huán)磷酰胺水溶液，噴灑量應(yīng)使環(huán)磷酰胺在濾嘴浸提試驗(yàn)測(cè)試體系中的理論完全溶出濃度大于等于20μ g/ml，并使卷煙濾嘴充分吸收環(huán)磷酰胺溶液，待其自然干燥后作為陽(yáng)性對(duì)照組卷煙濾嘴備用; 步驟(4)用相同的方法對(duì)步驟(3)制備的陽(yáng)性對(duì)照組卷煙濾嘴和待測(cè)樣品組卷煙濾嘴進(jìn)行浸提； 步驟(5)使用步驟(4)得到的水浸提液作為溶劑，用粉末細(xì)胞培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基說(shuō)明的方法進(jìn)行配制，然后將配制后的溶液過(guò)濾除菌后用于后續(xù)的體外微核試驗(yàn)； 步驟(6)用步驟(5)處理過(guò)的提取液進(jìn)行體外微核試驗(yàn)，測(cè)試提取液在測(cè)試體系中的濃度為100%、50%、25%和12.5% 4個(gè)劑量，提取液的細(xì)胞暴露時(shí)間為24小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卷煙濾嘴水浸提液體外微核試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置方法，其特征在于:步驟(4)所述的卷煙濾嘴的浸提采用蒸餾水作為提取液。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK104237495SQ201410489543
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】夭建華, 朱洲海, 曾婉俐, 高茜, 米其利, 黃海濤, 管瑩, 李雪梅, 徐濟(jì)倉(cāng), 唐萍 申請(qǐng)人:云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司