用于冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微成像的方法和裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微成像的方法和裝置，具體涉及將冷凍光鏡與冷凍透射電鏡進行關(guān)聯(lián)成像，包括用于光學(xué)-電子顯微關(guān)聯(lián)成像的光學(xué)顯微鏡冷凍載物臺裝置和相應(yīng)的關(guān)聯(lián)成像方法。可實現(xiàn)在極低溫下（低于-17CTC)進行光學(xué)顯微成像，并能實現(xiàn)對同一樣品的相同區(qū)域進行冷凍電子顯微成像。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于將各種類型倒置光學(xué)顯微鏡和市面上大多數(shù)透射電鏡關(guān)聯(lián)起來，能夠更快捷和精確實現(xiàn)關(guān)聯(lián)成像、最大程度上避免樣品表面冰晶形成、載網(wǎng)變形及碳膜破裂等問題?？蓮V泛用于細胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生物醫(yī)藥等相關(guān)研究。
【專利說明】用于冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微成像的方法和裝置

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及顯微成像的設(shè)備與方法，具體涉及光學(xué)顯微與電子顯微的關(guān)聯(lián)成像， 特別是將冷凍光鏡與冷凍透射電鏡進行關(guān)聯(lián)成像，包括用于光學(xué)-電子顯微關(guān)聯(lián)成像的光 學(xué)顯微鏡冷凍載物臺裝置和相應(yīng)的關(guān)聯(lián)成像方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微成像：一種能夠在極低溫度下（_170°C以下，能夠保持樣品在 接近生理狀態(tài)下的精細結(jié)構(gòu)信息）實現(xiàn)對有光學(xué)探針標(biāo)記的樣品進行光學(xué)顯微檢測，并能 對該樣品的同一區(qū)域進行高分辨電子顯微成像檢測的技術(shù)。冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微成像結(jié)合了 現(xiàn)代熒光顯微成像與冷凍電子顯微成像的優(yōu)勢，彌補了兩者之間的不足，在基礎(chǔ)科學(xué)研究 和臨床醫(yī)藥領(lǐng)域都有著巨大的應(yīng)用前景，如臨床病理樣品診斷和藥物追蹤與作用機制研究 等方面。
[0003] 這就需要一套裝置能夠?qū)⒗鋬鲭婄R樣品在光鏡下進行成像，并能夠安全地將樣品 由光鏡平臺轉(zhuǎn)移到冷凍電鏡平臺中；以及相應(yīng)的關(guān)聯(lián)方法快速精確地對成像區(qū)域進行共定 位。目前國際上已有報道的冷凍關(guān)聯(lián)平臺主要有以下幾種：美國匹茲堡大學(xué)章佩君課題組 開發(fā)了一套簡易的冷凍關(guān)聯(lián)平臺，可以將FEI公司Polara型電鏡的cartridge型樣品夾 連同樣品載網(wǎng)一起放入冷凍關(guān)聯(lián)平臺，進行光鏡成像，隨后將完成光鏡成像的cartridge 型樣品夾轉(zhuǎn)移到Polara型冷凍電鏡中進行成像。該系統(tǒng)存在的問題有：在冷凍光鏡成 像過程中，樣品暴露在空氣中，導(dǎo)致樣品容易被冰晶污染；cartridge較小，僅靠自身重力 與冷凍關(guān)聯(lián)平臺貼合，在冷凍條件下穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致樣品在成像過程中抖動較大；僅適 用于FEI公司Polara型號電鏡，可推廣使用范圍較小。另有德國馬克斯·普朗克研究所 WolfgangBaumeister課題組和荷蘭萊頓大學(xué)Abraham J. Koster課題組等各自開發(fā)的冷凍 關(guān)聯(lián)平臺采用自制的樣品夾承載電鏡樣品載網(wǎng)，在完成冷凍光鏡成像后，需要將樣品載網(wǎng) 從樣品夾中取出，再轉(zhuǎn)移到相應(yīng)電鏡的樣品夾或樣品桿中，隨后再轉(zhuǎn)移到冷凍電鏡中進行 成像，這導(dǎo)致樣品載網(wǎng)需要被多次轉(zhuǎn)移：一方面，多次轉(zhuǎn)移加大了關(guān)聯(lián)難度；另一方面，冷 凍樣品反復(fù)暴露在空氣中和沸騰的液氮中，使得樣品極易因冰晶污染、載網(wǎng)變形和碳膜破 碎而無法繼續(xù)使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述問題，本發(fā)明提供了一種能夠?qū)崿F(xiàn)光學(xué)顯微鏡與冷凍電鏡關(guān)聯(lián)成像的 冷凍樣品光鏡載物臺裝置，同時提供了相應(yīng)的關(guān)聯(lián)成像方法?？蓪崿F(xiàn)在極低溫下（低 于-170°C )進行光學(xué)顯微成像，并能實現(xiàn)對同一樣品的相同區(qū)域進行冷凍電子顯微成像。 本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于將各種類型倒置光學(xué)顯微鏡和市面上大多數(shù)透射電鏡關(guān)聯(lián)起來，能夠 更快捷和精確實現(xiàn)關(guān)聯(lián)成像、最大程度上避免樣品表面冰晶形成、載網(wǎng)變形及碳膜破裂等 問題?？蓮V泛用于細胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生物醫(yī)藥等相關(guān)研究。
[0005] 具體而言，本發(fā)明涉及以下各項：
[0006] 1. -種光鏡冷凍載物臺裝置，其特征在于所述裝置包括載物臺主體1，所述主體 中設(shè)置有冷卻室2,冷卻室中間設(shè)置有光通道3,所述光通道3頂部形成明場光光源放置位 置4,底部形成物鏡鏡頭放置位置5,圍繞所述光通道3,冷卻室2底部設(shè)置樣品桿卡槽6,所 述樣品桿卡槽6中間設(shè)置通孔，并且所述通孔向載物臺主體外側(cè)延伸形成冷凍樣品桿入口 7。
[0007] 2.根據(jù)1所述的裝置，所述載物臺主體上還包括與冷卻室2連通的液氮入口 8和 液氮和氮氣出口 9。
[0008] 3.根據(jù)1所述的裝置，所述明場光光源放置位置4和物鏡鏡頭放置位置（5)中間 均設(shè)置有玻片。
[0009] 4.根據(jù)1所述的裝置，所述載物臺主體上還設(shè)置有除霧氮氣入口 10,并分成上玻 片除霧氮氣出口 11和下玻片除霧氮氣出口 12。
[0010] 5.根據(jù)1所述的裝置，所述冷卻室2內(nèi)設(shè)置熱敏感電阻探頭，外部連接到溫度監(jiān)視 器，構(gòu)成了溫度監(jiān)視組件13。。
[0011] 6.根據(jù)1所述的裝置，所述冷卻室2與樣品桿卡槽6為一整體黃銅構(gòu)件。
[0012] 7.利用1-6所述光鏡冷凍載物臺裝置，光電關(guān)聯(lián)成像的方法，包括以下步驟：
[0013] 1)光學(xué)顯微成像時，分別采集同一區(qū)域的明場照片和熒光照片，利用明場光鏡照 片中載網(wǎng)索引號，在電鏡低倍模式下，迅速定位到同一載物方格，并采集該方格的低倍電鏡 照片；
[0014] 2)在光鏡照片中均勻選取多個清晰可見碳膜小孔的中心，同時選取電鏡照片中相 對應(yīng)碳膜小孔的中心點，利用線性擬合算法，達到高精度關(guān)聯(lián)；
[0015] 3)選取成像區(qū)域，并生成電鏡坐標(biāo)文件；
[0016] 4)采集電鏡數(shù)據(jù)。
[0017] 8.根據(jù)7所述的方法，所用載網(wǎng)為透射電鏡坐標(biāo)載網(wǎng)并覆蓋有周期性穿孔碳膜。
[0018] 9.根據(jù)7所述的方法，在步驟1)和2)之間，還可以包括將光鏡照片與電鏡低倍照 片利用IMOD Midas軟件進行初步關(guān)聯(lián)的步驟。
[0019] 10.根據(jù)7所述的方法，在步驟2)和3)之間，還可以包括對電鏡低倍成像模式和 高倍成像模式下坐標(biāo)進行再校正的步驟。
[0020] 發(fā)明詳述
[0021] 本發(fā)明主要包括光鏡冷凍載物臺裝置和相應(yīng)的關(guān)聯(lián)成像方法。
[0022] 本發(fā)明的光鏡冷凍載物臺裝置是一套能夠?qū)?cè)插式冷凍透射電鏡樣品桿放入到 光學(xué)顯微鏡平臺上進行冷凍光學(xué)顯微成像的承載裝置。
[0023] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是將電鏡樣品桿應(yīng)用到冷凍光鏡成像中，目前大部分透射 電鏡使用的冷凍樣品桿，以Gatan 626型樣品桿為例，采用滑蓋式樣品倉設(shè)計，即將冷凍樣 品放入到樣品桿中后，在不成像時，可將樣品密封到很小的空間內(nèi)，保證了樣品不受外界環(huán) 境影響，同時可維持樣品處于穩(wěn)定低溫狀態(tài)。將冷凍電鏡樣品桿應(yīng)用到冷凍光鏡成像中能 夠很好保護樣品不受冰晶污染，穩(wěn)定性好，容易上樣等優(yōu)勢，同時避免了樣品的多次轉(zhuǎn)移。 另外，樣品相對于冷凍樣品桿位置相對固定，可快速實現(xiàn)對樣品的光鏡與電鏡的共定位。
[0024] 本發(fā)明的光鏡冷凍載物臺裝置主要由載物臺主體、液氮泵入組件、溫度監(jiān)視組件 和除霧組件四部分組成。
[0025] 載物臺主體的設(shè)計主要是能夠與所用光學(xué)顯微鏡和冷凍電鏡的樣品桿進行匹配， 總體要求載物臺主體能夠很好地放入到光鏡的載物平臺中并能很好地固定；電鏡的樣品桿 能夠從側(cè)面插入到載物臺主體中，并能夠很好地固定和密封。
[0026] 液氮泵入組件：能夠穩(wěn)定持續(xù)將液氮泵入到載物臺主體的冷卻室中，用于維持樣 品始終處于極低的溫度下（低于-170度）。本發(fā)明中采用氣壓方式，將液氮從密封液氮罐 中采用恒壓壓出，保證了液氮流出的穩(wěn)定性，減少成像過程中的震動。
[0027] 溫度監(jiān)視組件：用于實時監(jiān)控樣品的溫度，以確保樣品不會因回溫而被破壞。
[0028] 除霧組件：在成像過程中，確保載物臺上下觀察窗不會結(jié)霜而影響到成像質(zhì)量。
[0029] 具體而言，本發(fā)明所描述的光鏡冷凍載物臺裝置如圖1所示，載物臺主體1內(nèi)以保 溫泡沫填充，外殼為耐低溫塑料與鋁合金材料；載物臺下部設(shè)置有凹槽，可嵌套光學(xué)顯微鏡 物鏡，在凹槽頂部為物鏡鏡頭放置位置5,其中間位置為玻片，所述物鏡鏡頭放置位置5正 上方的載物臺頂部設(shè)置有明場光光源放置位置4,中間位置為玻片，從而在物鏡鏡頭放置位 置5和明場光光源放置位置4之間形成光通道；環(huán)繞該光通道設(shè)置黃銅材質(zhì)的樣品桿卡槽 6,用于固定冷凍樣品桿頭部以及冷傳導(dǎo)；樣品桿卡槽6中間設(shè)置通孔，并且所述通孔向載 物臺主體外側(cè)延伸形成冷凍樣品桿入口 7 ;樣品桿卡槽6外周是與其合為一體的冷卻室2， 用于存儲冷卻用液氮；從該冷卻室上端向載物臺外側(cè)延伸設(shè)置兩個通孔，分別為液氮入口 8以及液氮和氮氣出口 9,所述液氮入口 8外部連接到液氮泵入組件，所述液氮和氮氣出口 9用于維持冷卻室內(nèi)恒壓；在載物臺主體上端的明場光光源放置位置4和載物臺主體下端 的物鏡鏡頭放置位置5分別設(shè)有除霧氮氣出口 11和12,兩者匯合則為除霧氮氣入口 10,夕卜 部連接到干燥氮氣；在冷卻室2內(nèi)部設(shè)置有熱敏感電阻探頭，外部連接到溫度監(jiān)視器，構(gòu)成 了溫度監(jiān)視組件13,用于實時監(jiān)視冷卻室內(nèi)溫度。
[0030] 當(dāng)使用該光鏡冷凍載物臺裝置時，根據(jù)附圖2,將光鏡冷凍載物臺放置于倒置熒光 顯微鏡載物臺上并固定；將物鏡鏡頭14和明場光光源15分別放置到相應(yīng)位置；并將冷凍 樣品桿入口用堵頭16進行密封。
[0031] 在對光鏡冷凍載物臺進行冷卻穩(wěn)定后，將裝有冷凍樣品的冷凍樣品桿17放入到 光鏡冷凍載物臺，開始進行成像實驗，如附圖3所示，其中18為液氮。
[0032] 關(guān)聯(lián)成像方法：
[0033]目前，一般的關(guān)聯(lián)方法采用肉眼比對關(guān)聯(lián)，關(guān)聯(lián)精度較低，通常在2um左右，并且 關(guān)聯(lián)起來較為困難，出錯率較高；而為了達到高精度關(guān)聯(lián)，通常會在冷凍制樣時，添加光鏡 和電鏡下均可見的熒光小球。采用熒光小球進行關(guān)聯(lián)，可達到很高的關(guān)聯(lián)精度。但同時存 在諸多問題，如果所加熒光小球與樣品所標(biāo)記的熒光在同一個熒光通道，熒光小球遠遠比 樣品熒光信號強，導(dǎo)致成像時樣品的熒光信號被掩蓋；如果所添加熒光小球與樣品標(biāo)記熒 光不在同一通道，則由于存在色差，導(dǎo)致關(guān)聯(lián)存在系統(tǒng)偏差。此外，突光小球直徑在200nm 左右，這樣在隨后電鏡成像時會遮擋很多樣品信息。
[0034] 本發(fā)明提出了一種直接利用特型透射電鏡坐標(biāo)載網(wǎng)上周期性穿孔碳膜進行高精 度關(guān)聯(lián)的方法。
[0035] 1)光學(xué)顯微成像時，分別采集同一區(qū)域的明場照片和熒光照片，利用明場光鏡照 片上載網(wǎng)索引號，在電鏡低倍成像模式下，迅速定位到同一載物方格（square)，并采集該方 格的低倍電鏡照片
[0036] 2)利用 IMOD Midas 軟件（http://bio3d. Colorado, edu/imod/)，將光鏡照片（明 場照片和熒光照片）與電鏡低倍照片進行初步關(guān)聯(lián)，關(guān)聯(lián)精度在2個微米范圍內(nèi)。
[0037] 3)隨后在光鏡照片中均勻選取多個（一般15-20個）清晰可見碳膜小孔的中心， 同時選取電鏡照片中相對應(yīng)碳膜小孔的中心點，利用線性擬合算法，以達到高精度關(guān)聯(lián)；
[0038] 4)電鏡低倍成像模式和高倍成像模式下坐標(biāo)進行校正，電鏡成像的低倍和高倍 存在很大的相變和相移，為達到高精度關(guān)聯(lián)，需對低倍和高倍成像模式下的坐標(biāo)進行再校 正；
[0039] 5)根據(jù)熒光照片，選取成像區(qū)域，并生成電鏡坐標(biāo)文件；
[0040] 6)將坐標(biāo)文件導(dǎo)入電鏡控制電腦，一一采集相應(yīng)電鏡數(shù)據(jù)；
[0041] 7)關(guān)聯(lián)精度分析：
[0042] 關(guān)聯(lián)精度σ計算滿足：
[0043]

【權(quán)利要求】
1. 一種光鏡冷凍載物臺裝置，其特征在于所述裝置包括載物臺主體（1)，所述主體中 設(shè)置有冷卻室（2)，冷卻室中間設(shè)置有光通道（3)，所述光通道（3)頂部形成明場光光源放 置位置（4)，底部形成物鏡鏡頭放置位置（5)，圍繞所述光通道（3)，在冷卻室（2)底部設(shè)置 樣品桿卡槽（6)，所述樣品桿卡槽（6)中間設(shè)置通孔，并且所述通孔向載物臺主體外側(cè)延伸 形成冷凍樣品桿入口（7)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，所述載物臺主體上還包括與冷卻室（2)連通的液氮入 口（8)和液氮和氮氣出口（9)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，所述明場光光源放置位置（4)和物鏡鏡頭放置位置 (5)中間均設(shè)置有玻片。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，所述載物臺主體上還設(shè)置有除霧氮氣入口（10)，并分 成上玻片除霧氮氣出口（11)和下玻片除霧氮氣出口（12)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，所述冷卻室（2)內(nèi)設(shè)置有熱敏感電阻探頭，外部連接到 溫度監(jiān)視器，構(gòu)成了溫度監(jiān)視組件（13)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，所述冷卻室（2)與樣品桿卡槽（6)為一整體黃銅構(gòu)件。
7. 利用權(quán)利要求1-6所述光鏡冷凍載物臺裝置進行光電關(guān)聯(lián)成像的方法，包括以下步 驟： 1) 光學(xué)顯微成像時，分別采集同一區(qū)域的明場照片和熒光照片，利用明場光鏡照片中 載網(wǎng)索引號，在電鏡低倍模式下，迅速定位到同一載物方格，并采集該方格的低倍電鏡照 片； 2) 在光鏡照片中均勻選取多個清晰可見碳膜小孔的中心，同時選取電鏡照片中相對應(yīng) 碳膜小孔的中心點，利用線性擬合算法，達到高精度關(guān)聯(lián)； 3) 選取成像區(qū)域，并生成電鏡坐標(biāo)文件； 4) 采集電鏡數(shù)據(jù)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所用載網(wǎng)為透射電鏡坐標(biāo)載網(wǎng)并覆蓋有周期性穿孔碳 膜。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，在步驟1)和2)之間，還可以包括將光鏡照片與電鏡低 倍照片利用IMOD Midas軟件進行初步關(guān)聯(lián)的步驟。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，在步驟2)和3)之間，還可以包括對電鏡低倍成像模 式和高倍成像模式下坐標(biāo)進行再校正的步驟。
【文檔編號】G01N23/00GK104215580SQ201410490390
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】畢國強, 周正洪, 何繼中, 陶長路, 徐程, 劉云濤 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)