一種膠質(zhì)瘤干細胞的體外三維培養(yǎng)模型及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細胞生物學領(lǐng)域，具體涉及一種用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型及應用。所述體外三維培養(yǎng)模型的制備按照如下步驟進行：將三維膠原支架置于DMEM培養(yǎng)基中浸泡6-24小時后取出，去除三維膠原支架上黏附的多余的DMEM得預處理三維膠原支架，將預處理三維膠原支架置于細胞培養(yǎng)板中，將成球的膠質(zhì)瘤干細胞種植于預處理三維膠原支架中，于37℃靜置2-6小時后，加入內(nèi)皮培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2-4天，即得到用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型。該體外三維培養(yǎng)模型各種操作過程均在室溫下進行，可在原位進行各種染色，包括免疫組化、免疫熒光染色；可進行電鏡檢測；可直接消化后進行RT-PCR及Western Blot檢測。
【專利說明】一種膠質(zhì)瘤干細胞的體外三維培養(yǎng)模型及應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞生物學領(lǐng)域，具體涉及一種用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型及應用。

【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤的生長和遠隔病灶的形成有賴于血液供應，經(jīng)典的血管生成理論認為，當實體腫瘤長至l_2mm3時，需誘導生成新的血管來獲取血供，否則腫瘤就會停止生長。隨著對腫瘤生物學研究的不斷深入，近些年人們還發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞還可以通過自身變形、圍繞形成管腔，以一種獨立于內(nèi)皮細胞依賴性血管的血管擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)方式構(gòu)筑腫瘤微循環(huán)。自1999年Man1tis等報道了惡性黑色素瘤中存在一種腫瘤新的微循環(huán)模式血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)后，人們在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝細胞癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤中證實了 VM的存在。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)腫瘤，已研究證實了膠質(zhì)瘤中也存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象，而且與膠質(zhì)瘤患者預后相關(guān)。膠質(zhì)瘤干細胞在膠質(zhì)瘤血管生成擬態(tài)現(xiàn)象中可能起著主要的作用。
[0003]血管生成擬態(tài)與傳統(tǒng)腫瘤血管生成途徑不同，它不依賴機體血管內(nèi)皮細胞的增生，因此，在研究血管擬態(tài)形成的細胞和分子機制時，要求體外培養(yǎng)的細胞通過自身變形形成管樣結(jié)構(gòu)。但是在體外二維培養(yǎng)過程中，當細胞密度達到一定數(shù)量時，細胞突起間極易相互連接，從而形成所謂的“管樣結(jié)構(gòu)”，但該結(jié)構(gòu)并非由細胞形成的管樣結(jié)構(gòu)，不能真實反映體內(nèi)血管擬態(tài)的結(jié)構(gòu)。因此，需尋找一種細胞培養(yǎng)模型可以模擬體內(nèi)血管擬態(tài)的結(jié)構(gòu)。
[0004]目前常用的研究血管新生的體外模型是Matrigel膠三維培養(yǎng)模型。但Matrigel膠實質(zhì)是一種基質(zhì)膠，僅為細胞培養(yǎng)提供基質(zhì)，而非真正意義的三維培養(yǎng)體系。此外，由于Matrigel膠自身的原因，在研究過程中發(fā)現(xiàn)其存在以下缺點:(I)Matrigel膠在常溫處于膠凍樣，操作必須在4°C以下的低溫環(huán)境中進行，這會對細胞造成損傷；(2)由于細胞在二維培養(yǎng)的某些細胞表型與三維培養(yǎng)不同，因此在研究VM時想要找到一種可以進行原位檢測的細胞培養(yǎng)模型，但Matrigel膠不易溶解、本底易于著色等原因，不能在該培養(yǎng)模型原位進行檢測。目前，Matrigel膠僅用來驗證細胞是否在一定的處理條件下可以形成管樣結(jié)構(gòu)，這在很大程度上限制了體外血管擬態(tài)的研究進展。因此，在腫瘤體外血管擬態(tài)研究中，亟需建立一種適合研究血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]目前應用在制備3D細胞培養(yǎng)的主要材質(zhì)包括天然有機物和無機大分子聚合物，天然有機物有膠原、殼聚糖、葡萄糖氨基聚糖類、藻酸鹽、絲心蛋白、瓊脂糖、淀粉；無機大分子聚合物有PGA(聚乙醇酸)、PLA(聚乳酸)、PLC(聚己內(nèi)酯)、Ρ0Ε (聚原酸酯)及其多相聚合支架如PLGA等。本申請的發(fā)明人在研究過程中預料不到的發(fā)現(xiàn)，采用三維膠原支架為膠質(zhì)瘤干細胞的細胞培養(yǎng)支架，在體外培養(yǎng)可得到一個新的、有效的體外三維培養(yǎng)模型，制備過程中各種操作過程均在室溫下進行，該體外三維培養(yǎng)模型可排除在Matrigel膠上由于細胞突起連接形成的管樣結(jié)構(gòu)，可在原位進行各種染色，包括免疫組化、免疫熒光染色；可進行電鏡檢測；可直接消化后進行RT-PCR及Western Blot檢測,使用方便快捷,為體外血管擬態(tài)的研究提供了一種重要的工具，基于上述發(fā)現(xiàn)，從而完成了本發(fā)明。
[0006]因此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型，具體的，所述體外三維培養(yǎng)模型的制備按照如下步驟進行:
[0007]將三維膠原支架置于DMEM培養(yǎng)基中浸泡6-24小時后取出，去除三維膠原支架上黏附的多余的DMEM預處理三維膠原支架，將預處理三維膠原支架置于細胞培養(yǎng)板中，將成球的膠質(zhì)瘤干細胞種植于預處理三維膠原支架中，于37°C靜置2-6小時后，加入內(nèi)皮培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)2-4天，即得到用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型。所述內(nèi)皮培養(yǎng)基的配制為EBM培養(yǎng)基(Lonza，CC-3156)，2%胎牛血清(Gibco，10099-133)，青霉素(penicillin, 100U/ml)，鏈霉素(streptomycin, 100U/ml)。
[0008]優(yōu)選的，在上述的方法中，將成球的膠質(zhì)瘤干細胞種植于預處理三維膠原支架中，于37°C靜置4小時。
[0009]優(yōu)選的，在上述的方法中，加入內(nèi)皮培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)3天。
[0010]優(yōu)選的，所述三維膠原支架的材料為IV型膠原，孔徑直徑為300-500 μ m。
[0011]優(yōu)選的，所述成球的膠質(zhì)瘤干細胞的制備方法為:膠質(zhì)瘤細胞(U87細胞株或原代膠質(zhì)瘤細胞091214)用含10%胎牛血清(Gibco, 10099-133)的DMEM培養(yǎng)基(Gbico)培養(yǎng)2-3天后將培養(yǎng)基吸棄，加入PBS(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)清洗后吸棄，重復PBS清洗2-3次，然后加入1ml干細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，此后每天采用半換液方式添加新的干細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-7天即可成球，得到成球的膠質(zhì)瘤干細胞。所述膠質(zhì)瘤干細胞培養(yǎng)基配方為 DMEM/F12(Invitrogen，CA, USA), bFGF(10ng/ml, PeproTech, NJ, USA),EGF (lOng/ml, PeproTech, NJ, USA), B27 (1:50, Invitrogen, CA, USA), penicillin (100U/ml)，streptomycin(lOOU/ml)。
[0012]進一步，所述膠質(zhì)瘤細胞為U87細胞株或原代膠質(zhì)瘤細胞091214。
[0013]優(yōu)選的，所述膠質(zhì)瘤細胞為綠色熒光蛋白標記的膠質(zhì)瘤細胞。
[0014]本發(fā)明還提供了三維膠原支架在制備用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型中的應用，所述三維膠原支架的材料為IV型膠原，孔徑直徑為300-500 μ m。
[0015]有益效果:本發(fā)明采用三維膠原支架為膠質(zhì)瘤干細胞的細胞培養(yǎng)支架，在體外培養(yǎng)可得到一個新的、有效的用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型，制備過程中各種操作過程均在室溫下進行；得到的該體外三維培養(yǎng)模型與現(xiàn)有的Matrigel膠培養(yǎng)模型相比，三維膠原支架培養(yǎng)細胞過程操作簡單，各種操作過程均在室溫下進行，細胞在三維膠原支架上形成的管樣結(jié)構(gòu)更為可信，可排除在Matrigel膠上由于細胞突起連接形成的管樣結(jié)構(gòu)。三維膠原支架培養(yǎng)細胞形成VM可在原位進行各種染色，包括免疫組化、免疫熒光染色；可進行電鏡檢測；可直接消化后進行RT-PCR及Western Blot檢測，使用方便快捷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1膠質(zhì)瘤干細胞在三維膠原支架和培養(yǎng)皿中二維培養(yǎng)的結(jié)果圖(A:三維膠原支架:掃描電鏡顯示三維膠原支架的超微結(jié)構(gòu)；C、E:U87和原代膠質(zhì)瘤細胞091214的細胞球在干細胞培養(yǎng)基中形成干細胞細胞球；D、F:掃描電鏡顯示膠質(zhì)瘤干細胞在三維膠原支架中生長)。
[0017]圖2膠質(zhì)瘤干細胞在三維膠原支架中的分化現(xiàn)象(A和B為掃描電鏡顯示膠質(zhì)瘤干細胞在與三維膠原支架接觸處出現(xiàn)分化現(xiàn)象(箭頭所示)；C SRT-PCR顯示干細胞在三維膠原支架中干性基因表達下調(diào))。
[0018]圖3膠質(zhì)瘤干細胞在不同三維培養(yǎng)條件下的生長方式(A為采用Matrigel膠培養(yǎng)為采用三維膠原支架培養(yǎng))。
[0019]圖4膠質(zhì)瘤干細胞在三維膠原支架中形成管樣結(jié)構(gòu)的HE染色、免疫熒光染色及電鏡掃描觀察結(jié)果。
[0020]圖5膠質(zhì)瘤干細胞在三維膠原支架中形成管樣結(jié)構(gòu)的Western Blot檢測結(jié)果。

【具體實施方式】
[0021]所舉實施例是為了更好地對本發(fā)明的內(nèi)容進行說明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所舉實施例。所以熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
對實施方案進行非本質(zhì)的改進和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0022]本發(fā)明實施例中，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，10%胎牛血清(Gibco，10099-133)。
[0023]膠質(zhì)瘤干細胞培養(yǎng)基配方為DMEM/F12(Invitrogen，CA，USA), bFGF(10ng/ml,PeproTech, NJ, USA)，EGF(lOng/ml, PeproTech, NJ, USA)，B27 (I:50, Invitrogen, CA, USA)，penicillin(lOOU/ml)， streptomycin(lOOU/ml)。
[0024]三維膠原支架的材料由IV型膠原組成，孔徑直徑為300-500 μ m,三維膠原支架在掃描電鏡下呈網(wǎng)孔狀的三維結(jié)構(gòu)(如圖1A和圖1B)。
[0025]PBS購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
[0026]所述膠質(zhì)瘤細胞為U87細胞株和原代膠質(zhì)瘤細胞091214。U87細胞株來自ATCC，VA, USA。原代膠質(zhì)瘤細胞(091214)來自第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科住院病人膠質(zhì)瘤切除標本。
[0027]實施例1GFP-U87及GFP-091214成球?qū)嶒?br> [0028]在10mm培養(yǎng)皿內(nèi)，將用綠色熒光標記的U87 (GFP-U87)用含10 %胎牛血清(Gibco, 10099-133)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后，將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基吸棄，加入5ml PBS清洗后吸棄，重復2次；加入1ml干細胞培養(yǎng)基，以后每天采用半換液方式添加新的干細胞培養(yǎng)基，5-7天即可成球，得到成球的GFP-U87，用于傳代和實驗用。
[0029]按照上述方法培養(yǎng)綠色熒光標記的原代膠質(zhì)瘤細胞091214 (GFP-091214)得到成球的GFP-091214，用于傳代和實驗用。
[0030]實施例2膠質(zhì)瘤干細胞的體外三維培養(yǎng)模型的建立
[0031]將三維膠原支架用DMEM浸泡過夜，取出用濾紙將支架上黏附的多余的DMEM吸除，將支架放置于六孔板內(nèi)，將實施例1中成球的GFP-U87和GFP-091214細胞分別種植于膠原支架，37°C孵箱內(nèi)靜置4小時后，加入5ml干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，同時以實施例1培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)的GFP-U87和GFP-091214細胞球作為對照，掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤干細胞在膠原支架內(nèi)呈三維立體方式生長，如圖1D和圖1F所示，培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)的GFP-U87和GFP-091214細胞球的結(jié)構(gòu)如圖1C和圖1E所示。
[0032]采用RT-PCR檢測干性基因的表達情況，結(jié)果顯示，與二維培養(yǎng)(實施例1的方法)相比三維膠原支架培養(yǎng)的干細胞的干性基因0CT4，S0X2及Nanog表達下調(diào)，如圖2C ;電鏡結(jié)果顯示與膠原支架接觸處的細胞出現(xiàn)了明顯的分化，如圖2A和圖2B。
[0033]實施例3三維膠原支架與Matrigel膠培養(yǎng)模型的比較
[0034]將三維膠原支架用DMEM浸泡過夜，取出用濾紙將支架上黏附的多余的DMEM吸除，將支架放置于六孔板內(nèi)，將實施例1中形成的GFP-091214細胞球分別接種在三維膠原支架和Matrigel膠上，37 °C孵箱內(nèi)靜置4小時后，內(nèi)皮培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后，激光共聚焦顯微鏡顯示膠質(zhì)瘤干細胞在Matrigel膠和三維支架均可見管樣結(jié)構(gòu)形成。在三維膠原支架中可見由細胞形成三維管樣結(jié)構(gòu)，而在Matrigel膠形成的管樣結(jié)構(gòu)主要由細胞突起形成，結(jié)果如圖3所示。
[0035]實施例4利用三維膠原支架培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細胞形成的管樣結(jié)構(gòu)細胞表達血管擬態(tài)相關(guān)蛋白的檢測
[0036]將三維膠原支架用DMEM浸泡過夜，取出用濾紙將支架上黏附的多余的DMEM吸除，將支架放置于六孔板內(nèi)，將實施例1中制備的成球的GFP-U87和GFP-091214細胞分別種植于三維膠原支架，37°C孵箱內(nèi)靜置4小時后，用內(nèi)皮培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后；用鑷子取出后放入10%福爾馬林固定20min，將上述支架制成10 μ m的冰凍切片后，進行HE染色及免疫熒光染色，如圖4所示，發(fā)現(xiàn)細胞在三維膠原支架形成管樣結(jié)構(gòu)，且這些細胞高表達血管擬態(tài)相關(guān)蛋白，取出支架放入2%戊二醛固定并送電鏡室制片，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞在支架內(nèi)可形成管樣結(jié)構(gòu)，HE染色顯示，膠質(zhì)瘤干細胞在內(nèi)皮細胞培養(yǎng)下，在膠原支架中形成管樣結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色顯示形成管樣結(jié)構(gòu)的細胞高表達血管擬態(tài)相關(guān)蛋白VE-Cadherin，Laminin,同時保持膠質(zhì)瘤細胞標記物GFAP。掃描電鏡(SEM)顯示管樣結(jié)構(gòu)是由瘤細胞構(gòu)成的。將支架直接放入蛋白提取液中，進行WesternBlot檢測，進一步證實，細胞高表達CD133，VE-Cadherin, Laminin, VEGFR2，如圖 5 所示。
[0037]從實施例2-4可以看出，與Matrigel膠相比，三維膠原支架培養(yǎng)細胞過程操作簡單，各種操作過程均在室溫下進行，細胞在三維膠原支架上形成的管樣結(jié)構(gòu)更為可信，可排除在Matrigel膠上由于細胞突起連接形成的管樣結(jié)構(gòu)。三維膠原支架培養(yǎng)細胞形成VM可在原位進行各種染色，包括免疫組化、免疫熒光染色；可進行電鏡檢測；可直接消化后進行RT-PCR及Western Blot檢測。與現(xiàn)有的培養(yǎng)模型相比，具有顯著的進步性。
[0038]最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。
【權(quán)利要求】
1.一種用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型，其特征在于，所述體外三維培養(yǎng)模型的制備按照如下步驟進行: 將三維膠原支架置于DMEM培養(yǎng)基中浸泡6-24小時后取出，去除三維膠原支架上黏附的多余的DMEM得預處理三維膠原支架，將預處理三維膠原支架置于細胞培養(yǎng)板中，將成球的膠質(zhì)瘤干細胞種植于預處理三維膠原支架中，于37°C靜置2-6小時后，加入內(nèi)皮培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)2-4天后，即得到用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型；所述內(nèi)皮培養(yǎng)基為添加有2%胎牛血清、青霉素100U/ml和鏈霉素100U/ml的EBM培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型，其特征在于，所述三維膠原支架的材料為IV型膠原，孔徑直徑為300-500 μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型，其特征在于，所述成球的膠質(zhì)瘤干細胞的制備方法為:膠質(zhì)瘤細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3天后將培養(yǎng)基吸棄，加入PBS清洗后吸棄，重復PBS清洗2_3次，然后加入1ml膠質(zhì)瘤干細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，此后每天采用半換液方式添加新的膠質(zhì)瘤干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)5-7天即可成球，得到成球的膠質(zhì)瘤干細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的一種用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型，其特征在于，所述膠質(zhì)瘤細胞為膠質(zhì)瘤細胞株U87或原代膠質(zhì)瘤細胞091214。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型，其特征在于，所述膠質(zhì)瘤細胞為綠色熒光蛋白標記的膠質(zhì)瘤細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型，其特征在于，將成球的膠質(zhì)瘤干細胞種植于預處理三維膠原支架中，于37°C靜置4小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型，其特征在于，加入內(nèi)皮培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)3天。
8.三維膠原支架在制備用于研究膠質(zhì)瘤干細胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型中的應用，其特征在于，所述三維膠原支架的材料為IV型膠原，孔徑直徑為300-500 μ m。
【文檔編號】G01N33/68GK104312975SQ201410499649
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】姚小紅, 吳海波, 卞修武, 戴建武 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院