一種用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法定量檢測羊肚菌菌絲的制作方法
【專利摘要】一種用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法定量檢測羊肚菌菌絲，其特征是：利用抗原與抗體特異性結合及酶對底物的顯色催化作用，檢測羊肚菌菌絲含量。a、是采用雙抗體夾心ELISA方法，其中一種抗體為鼠源抗羊肚菌單克隆抗體山、利用該方法測得羊肚菌菌絲濃度與0D值之間的關系曲線，并且曲線線性相關程度高；c、該方法對羊肚菌菌絲的檢測是特異性的檢測，作為羊肚菌菌絲的鑒定檢測。有益效果是：通過采用雙抗體夾心ELISA方法，對羊肚菌菌絲的含量進行快捷、準確地檢測，也即掌握了對培養(yǎng)基中羊肚菌的含量這個羊肚菌人工栽培的關鍵技術，大大地提高了菇農(nóng)的種植效率，降低了栽培羊肚菌的生產(chǎn)成本與風險。
【專利說明】一種用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法定量檢測羊肚菌菌絲
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學檢測【技術領域】，涉及一種羊肚菌菌絲定量檢測方法的改進。
【背景技術】
[0002] 羊肚菌是一種珍稀的食用菌，以美味著稱。近年來的研究發(fā)現(xiàn)其具有對人體多方 面的保健價值。由于人工栽培技術不成熟，產(chǎn)品基本靠野生資源的采集，價格居高不下。實 現(xiàn)羊肚菌的人工栽培具有巨大的商業(yè)價值。羊肚菌出菇的物質基礎是大量生長的羊肚菌菌 絲，可以說羊肚菌菌絲數(shù)量的多少是決定了羊肚菌栽培是否能實現(xiàn)出菇的關鍵因素。因而 及時、準確的了解培養(yǎng)基中羊肚菌的含量是羊肚菌人工栽培的關鍵技術手段。由于目前還 沒有定量檢測羊肚菌菌絲的實驗手段與方法，菇農(nóng)只能用肉眼觀察培養(yǎng)基憑經(jīng)驗來判斷菌 絲的含量，很難做到科學客觀了解菌絲含量。
[0003] 酶聯(lián)免疫吸附試驗(簡稱ELISA)是一種免疫學技術方法，利用抗原與抗體特異性 結合及酶對底物的顯色催化作用，來檢測抗原或抗體的免疫學檢測方法，在醫(yī)學及病原等 的檢測上有較為成熟的應用。
[0004] 另一種理論上可行的檢定羊肚菌菌絲的方法是在實驗室條件下的提取羊肚菌樣 品的DNA，通過RT-PCR測定來推算菌絲含量，該方法的優(yōu)勢是精準，缺點是需要專業(yè)的檢測 實驗室，檢測周期長(數(shù)天)，費用昂貴。
[0005] 參考文獻： (1) 穆晞惠，童朝陽，郝蘭群，等.雙抗體夾心ELISA法檢測相思子毒素[J].細胞與 分子免疫學雜志.2007, 23 (8):763 - 766. (2) 王一東，劉建.一株抗羊肚菌單克隆抗體及其制備方法：中 國，200910218152. 8 [P]· 2010-06-09. (3) 馬帥，陳華林，王雅文，等.免疫酶染色法對羊肚菌菌絲特異性靶位的初步定位與 分析[J]·菌物研究，2014, 12 (2) :115-118。
【發(fā)明內容】
[0006] 本發(fā)明的目的是：提供一種用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法定量檢測羊肚菌菌 絲，它可簡便、快捷、準確地檢測羊肚菌菌絲含量。
[0007] 本發(fā)明的技術方案是：利用抗原與抗體特異性結合及酶對底物的顯色催化作用， 檢測羊肚菌菌絲含量。
[0008] 本發(fā)明的具體技術方案是：1.是采用雙抗體夾心ELISA方法，其中一種抗體為鼠 源抗羊肚菌單克隆抗體。2.該方法可以測得羊肚菌菌絲濃度與0D值之間的關系曲線，并且 曲線線性相關程度高。3.該方法對羊肚菌菌絲的檢測是特異性的檢測，可以作為羊肚菌菌 絲的鑒定檢測。
[0009] 本發(fā)明的方法是： 酶聯(lián)免疫吸附試驗(簡稱ELISA)是一種免疫學技術方法，利用抗原與抗體特異性結合 及酶對底物的顯色催化作用，來檢測抗原或抗體的免疫學檢測方法，在醫(yī)學及病原等的檢 測上有較為成熟的應用。
[0010] 本發(fā)明所闡述的檢測方法是利用免疫學實驗技術的酶聯(lián)免疫吸附試驗雙抗體夾 心法原理。
[0011] 利用固定在酶標板上的抗羊肚菌抗體，特異性吸附樣品中的羊肚菌菌絲抗原，在 第二抗體及酶標抗體對抗原特異性結合的基礎上，利用酶對底物的催化作用，使底物產(chǎn)生 特定波長的顏色物質，底物顏色的深淺與抗體結合的抗原的多少正相關。通過酶標儀可以 測得不同量的標準羊肚菌抗原所對應的底物顏色不同深淺(吸光度、也稱0D值)，建立標準 羊肚菌濃度與吸光度對應關系的標準曲線及線性方程，在相同條件下測得樣品的吸光度， 即可用標準曲線及線性方程求得樣品中羊肚菌菌絲的含量。
[0012] 本發(fā)明的具體檢測方法是： 選取合適的鼠源抗羊肚菌菌絲的單克隆抗體及兔抗羊肚菌多克隆抗血清；制備經(jīng)物理 性破碎的液體培養(yǎng)的羊肚菌菌絲標準抗原；在優(yōu)化反應條件的基礎上，建立抗羊肚菌菌絲 抗原的雙抗體夾心ELISA法；檢測不同濃度的標準羊肚菌菌絲樣品，建立吸光度（0D值）與 菌絲濃度之間的標準曲線及線性方程；在相同工作條件下測待檢樣本的吸光度值，用標準 曲線的線性方程計算得到樣品中羊肚菌菌絲的含量值。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是：通過采用雙抗體夾心ELISA方法，對羊肚菌菌絲的含量進 行快捷、準確地檢測，也即掌握了對培養(yǎng)基中羊肚菌的含量這個羊肚菌人工栽培的關鍵技 術，大大地提高了菇農(nóng)的種植效率，降低了栽培羊肚菌的生產(chǎn)成本與風險。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明之包被濃度與0D值間關系曲線圖； 圖2是本發(fā)明測得的羊肚菌標準品與0D值標準曲線及線性方程。
【具體實施方式】
[0015] 實施例1 下面結合附圖對本發(fā)明做進一步描述： (一）本發(fā)明的實施實例所需實驗材料與主要儀器設備 1.菌株 羊肚菌（Morehella esculenta)菌株（51589號)，購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。
[0016] 2檢測樣本 于2012年5月采自吉林市豐滿區(qū)的野生羊肚菌子實體及其地表下的土壤基質樣本(凍 存于長春理工大學生命科學技術學院實驗室)。
[0017] 3 試劑 (1) HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)，HRP標記山羊抗鼠IgG(H+L)，購于北京中杉金橋生物 技術有限責任公司； (2) TMB，sigma 公司； (3) 抗羊肚菌單克隆抗體和多克隆抗體 鼠抗羊肚菌單克隆抗體（C6A8細胞株、腹水）和兔抗羊肚菌多抗(兔高免血清)，由長春 理工大學生命科學技術學院實驗室制備并保存。
[0018] 其他試劑均為國產(chǎn)分析純化學試劑。
[0019] 4主要儀器與設備 HZQ-QX型恒溫振蕩培養(yǎng)箱哈東聯(lián)公司，MDF-192型低溫冰箱SANYO公司，F(xiàn)DU1100小型 凍干機EYELA公司，ELx800?酶標儀美國伯騰儀器有限公司，hiac CF 16RX日本日立高速 冷凍離心機，等。
[0020] (二）實施的具體步驟 (1)所用抗體效價的測定：用常規(guī)間接ELISA法[8]分別測定抗羊肚菌多抗和單抗的效 價，間接ELISA法測得，抗羊肚菌多抗、單抗的效價分別為1:2. 05X 104和1:2. 56X 103。
[0021] (2)抗羊肚菌單克隆抗體的酶標板包被：將抗羊肚菌 的單克隆抗體用PH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液分別稀釋25 X、50 X、100 κ......25600 X ,其蛋白濃度分別為 1850mg/L、925mg/L、462mg/L......1. 81mg/L 包被酶標板，加入200 x稀釋的標準樣品(抗原)、200 x稀釋的兔抗羊肚菌多抗、5000 x稀釋 的酶標二抗及底物，對抗原進行雙抗體夾心ELISA檢測，其0D值與包被抗體濃度變化結果 見圖1。在包被抗體稀釋濃度為25600 X至12800 X時0D值呈遞增趨勢，當其稀釋濃度高于 800 X時，0D值趨于平穩(wěn)，故選擇最適包被抗體濃度為稀釋800 ,其蛋白濃度為57. 88mg/ L〇
[0022] (3)標準樣品的制備：于250ml錐形瓶加入125ml馬鈴薯培養(yǎng)基（以下簡稱Η)Β)， 用封口膜封口，滅菌后待用。將4°C保存的羊肚菌菌種斜面置于超凈工作臺內，無菌操作挑 取適量菌絲接種于上述滅菌的中，將培養(yǎng)瓶放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度23°C，轉速110 r/min振蕩培養(yǎng)。約4 d后得到球狀羊肚菌菌絲。將培養(yǎng)得到的球狀羊肚菌菌絲880 xg 離心5min，收集沉淀菌絲，同樣的方法用pH7. 4的磷酸鹽緩沖液（以下簡稱PBS)洗漆沉淀 菌絲三次。將沉淀菌絲經(jīng)低溫冷凍干燥機凍干24h，得到羊肚菌菌絲凍干品。稱取0.31g 凍干菌絲，與3g無菌海砂混合，加入適量_PBS研磨20min，880 χ g離心5min，取上清，再 經(jīng)9800 X g離心3min，取上清，最后得羊肚菌標準樣品體積為2. 35ml，菌絲濃度為1. 32 X. 105mg/L。該溶液即為羊肚菌菌絲標準樣品，冷凍或4°C保存，備用。
[0023] (4)夾心法的初步建立及實驗條件的優(yōu)化： (1)抗體包被：用PH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液將羊肚菌單克隆抗體（C6A8腹水， 蛋白濃度為4. 631 χ 104 mg/L)稀釋成蛋白濃度為200mg/L，包被酶標板，每孔加100 μ?, 其中一孔不加抗體，作為試劑空白。4°C過夜后甩去包被液，用含有0.05%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液（以下簡稱PBS-T)洗3次，3min/次，甩干。
[0024] (2)加待檢樣品：除試劑空白及另留一列孔作為陰性對照外，其余孔加適當稀釋的 陽性羊肚菌菌絲標準品各100 μ?,陰性對照孔加100 μ?的PBS-T，37°C孵育lh，用PBS-T洗 3次，3 min/次，甩干。
[0025] (3)加兔抗羊肚菌多抗(兔陽性血清，蛋白濃度為1. 026 X 105mg/L):除試劑空白 孔外，其余各孔加蛋白濃度為500mg/L的兔抗羊肚菌多抗，每孔100 μ.1，37?孵育45min， PBS-T洗5次，3 min/次，甩干。
[0026] (4)加HRP標記的山羊抗兔IgG :所有各孔加1:5000稀釋的HRP標記的山羊抗兔 IgG，每孔 100 JU.1，37 °C溫育 45min，洗漆 5 次，3 min/ 次，甩干。
[0027] (5)加底物顯色液：在各孔中加入新配制的底物顯色液100 μ.1,37?避光，顯色 15min〇
[0028] (6)終止反應：在各個孔中加入2mol/L H2S04溶液50 μ?。
[0029] (7)檢測及實驗條件的優(yōu)化：在ELxSOO?型酶標檢測儀上450nm波長處，測定0D 值。在陽性、陰性對照成立的基礎上，根據(jù)不同包被濃度、一抗?jié)舛鹊葘?D值進行 ELISA夾心法工作條件的優(yōu)化，在優(yōu)化了的條件基礎上建立ELISA雙抗體夾心法。
[0030] 1. 2. 3 ELISA雙抗體夾心法工作曲線的建立 用已建立的ELISA雙抗體夾心法，以標準品為檢樣分別加入稀釋2 X、4 X、8 X、16 X 、32 X、64 X、128 X、256 X和512 X的標準樣品，以PBS-T做為陰性對照，進行檢測。利用 Excel辦公軟件，以標準樣品凍干菌絲濃度為橫坐標，波長450nm處的0D值為縱坐標作圖， 獲得標準樣品菌絲濃度與0D值對應標準曲線及線性方程。
[0031] (4)利用夾心法得到標準曲線及線性方程：以不同的羊肚菌標準樣品干菌絲濃度 為橫坐標，0D值為縱坐標作圖，建立ELISA雙抗體夾心法標準羊肚菌菌絲濃度與0D值對 應關系的標準曲線。當標準樣品菌絲濃度為2.58 X 102飛.60 X 104mg/L之間時，菌絲濃度 對數(shù)值與其0D值呈良好的線性關系，見（圖2)。對此進行線性回歸分析，線性回歸方程為 y=0. 0949X-0. 0338, R2=0. 9943。
[0032] (5)待檢樣品的處理及檢測：稱取含有羊肚菌菌絲的樣本1. 02g，與3 g海砂混合 均勻，加入一定體積的PBS研磨20min。880 X g離心5min，取上清液，9800 g離心3min， 最后得上清1. 〇ml，該溶液即為土壤基質中菌絲含量檢測樣本。羊肚菌樣本中菌絲含量的測 定，根據(jù)上述步驟建立的ELISA雙抗體夾心法，檢測經(jīng)處理得到的檢測樣本的0D值，根據(jù)標 準標準曲線方程、回收率可得出土壤樣本中所含菌絲含量數(shù)值。
【權利要求】
1. 一種用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法定量檢測羊肚菌菌絲，其特征是： 利用抗原與抗體特異性結合及酶對底物的顯色催化作用，檢測羊肚菌菌絲含量。
2. 如權利要求1所述的一種用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法定量檢測羊肚菌菌絲，其 特征是： a、 是采用雙抗體夾心ELISA方法，其中一種抗體為鼠源抗羊肚菌單克隆抗體； b、 利用該方法測得羊肚菌菌絲濃度與0D值之間的關系曲線，并且曲線線性相關程度 商； c、 該方法對羊肚菌菌絲的檢測是特異性的檢測，作為羊肚菌菌絲的鑒定檢測。
【文檔編號】G01N33/569GK104215759SQ201410500474
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月23日 優(yōu)先權日:2014年9月23日
【發(fā)明者】王一東, 劉建 申請人:長春理工大學