一種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器制備方法及應(yīng)用，屬于新型功能材料、生物傳感檢測【技術(shù)領(lǐng)域】?；谌S結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米材料較大的比表面積，較高的催化效率等優(yōu)點提高了對前列腺癌特異性抗原檢測的靈敏度，降低了檢出限，對前列腺癌特異性抗原的檢測具有重要意義。
【專利說明】一種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器制備方法及應(yīng)用。具體是采用三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt制備一種檢測前列腺癌標(biāo)志物的電化學(xué)免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]目前對前列腺癌標(biāo)志物的檢測有多種方法，比如基因檢測法，化學(xué)發(fā)光免疫分析，酶聯(lián)免疫分析等；本發(fā)明是將免疫學(xué)原理與電分析化學(xué)相結(jié)合，制備了一種靈敏性高、選擇性好、簡便快速的用于檢測前列腺特異性抗原的傳感器。
[0003]石墨烯納米層作為一種二維材料，有較大的比表面積，催化性能好，生物相容性好等特點；金納米粒子具有催化性能高、長期分散性穩(wěn)定、生物相溶性強等特點；氨基化石墨烯相比石墨烯能更大程度地增加了與金的結(jié)合，Au-NH2-GS納米復(fù)合材料能夠增加抗體在其表面的負載量和在水中的分散性，該復(fù)合材料的應(yīng)用具有提高免疫傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性，降低傳感器的檢出限，增強電化學(xué)信號等優(yōu)勢。本發(fā)明制備了一種具有三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT納米材料，在其三維空間結(jié)構(gòu)中插入Pt納米粒子，促使抗體更容易、牢固的與其結(jié)合，從而顯著提高了該材料的催化性能。本發(fā)明制備過程簡單，檢測快捷，靈敏性高，檢出限低等一系列優(yōu)點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一基于具有三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合材料，制備一種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器；本發(fā)明的目的之二將該傳感器應(yīng)用于前列腺癌特異性抗原的高靈敏、快速特異檢測。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
1.一種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器制備方法，步驟如下:
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用0.05 Mm的A1203拋光粉打磨，用超純水清洗干凈；將4^6 μ?,Ο.5^2 mg/mL的Au-NH2-GS溶液滴加到處理好的裸電極上，放置4 °C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(2)將4飛μ?,8?12Pg/mL的前列腺癌標(biāo)志物一抗溶液滴加到電極表面，放置4°C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(3)將3PL、質(zhì)量分數(shù)為0.5?3.0 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，放置4 °C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 1:冰箱中晾干;
(4)滴加4飛μ?、0.5 pg/mL?15 ng/mL的一系列不同濃度的前列腺癌標(biāo)志物抗原標(biāo)準溶液到電極表面，放置4 °C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(5)將4飛μ?、3?6mg/mL的GS-CNT-Pt/Ab2 二抗孵化物溶液滴涂于電極表面上，置于4 °C冰箱中晾干后，超純水沖洗，制得前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器。
[0006]2.Au-NH2_GS納米復(fù)合材料溶液的制備，步驟如下:
(1)金納米粒子溶液的制備
將100 mL、質(zhì)量分數(shù)為0.01?0.02%的HAuC14溶液加熱至沸，滴加2.0?3.0 mL、質(zhì)量分數(shù)為0.5^1.5%的檸檬酸鈉水溶液，溶液顏色變?yōu)榧t棕色，冷卻至室溫；
(2)氨基化石墨烯NH2-GS的制備
0.05、.2 g石墨烯分散在5?15 mL的乙醇中，超聲攪拌1 h，加入0.廣0.3 mL、質(zhì)量分數(shù)為99%的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在70 1:條件下加熱攪拌l.(T2.0 h;加入0.1 mL、質(zhì)量分數(shù)為80%的水合肼，95°C加熱1 h;在9000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心2(T40 min ;在真空條件下干燥8?12 h，制得氨基化石墨烯NH2-GS ;
(3)Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液的制備
稱取1(T20 mg的氨基化石墨烯NH2-GS置于小燒杯中，加入1(T20 mL金納米溶液，攪拌1(T14 h，離心后在真空條件35?45 °C下干燥12h，制得Au-NH2_GS納米復(fù)合材料，用水配制成0.5^2 mg/mL的Au-NH2_GS納米復(fù)合材料溶液。
[0007]3.GS-CNT_Pt/Ab2 二抗孵化物溶液的制備，步驟如下:
(1)氧化石墨烯的制備
將0.3 g的石墨和1.5^2.0 g高錳酸鉀混合，放入帶有磁子的500 mL的三口瓶中，力口入體積比為8?10: 1的硫酸和磷酸混合液，將三口瓶放入油浴鍋，加熱到50 V，反應(yīng)10?12 h;將樣品傾倒到40 mL的冰上，磁力攪拌下，滴加0.5?1.0 mL的過氧化氫，溶液變?yōu)橥咙S色，在8000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心0.5 h,依次用30 mL、0.2 mol/L的鹽酸及30 mL的無水乙醇離心洗滌3次，棄去上清液，用乙醚離心洗滌1次，棄去上清液，得到的固體樣品置于3(T40 °C的真空干燥箱中干燥12 h，制得氧化石墨烯棕黃色固體粉末；
(2)三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT納米復(fù)合材料的制備
將2(T40 mg的碳納米管CNT加入到30 mL、l?3 mg/mL的氧化石墨烯的均勻分散液中，超聲30 min，將得到的混合物放入50 mL的高壓反應(yīng)釜中，加熱升溫至16(Tl90 °C，并保持12 h，冷卻至室溫，將得到的混合物冷凍干燥；
(3)三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物的制備
在劇烈攪拌的條件下，將1 mL、5?15 mmol/L的K2PtCl4溶液和5 mg的三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT納米復(fù)合材料加入到10 mL的超純水中，冰浴30 min, 7000 rpm下離心分離5 min,制得三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物，用水洗滌、離心分離3次，35?45°C下真空干燥12h ；
(4)GS-CNT-Pt/Ab2 二抗孵化物溶液的制備
將3飛mg的三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物加入到3飛mL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入15(Γ300 μ?、10 Pg/mL的前列腺癌標(biāo)記物二抗Ab2溶液，4 °C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化24 h，3000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心10 min，加入1 mL、pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，制得GS-CNT-Pt/Ab2 二抗孵化物溶液，4 °C下保存?zhèn)溆谩?br> [0008]4.前列腺癌標(biāo)志物的檢測方法，步驟如下:
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、3(T50 mmol/L的pH =5.9?8.0磷酸鹽緩沖溶液中進行測試； (2)用計時電流法對前列腺特異性抗原標(biāo)準溶液進行檢測，輸入電壓為-0.4 V，取樣間隔0.1 s，運行時間300 s ；
(3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、3(T50 mmol/L的pH=5.9?8.0磷酸鹽緩沖溶液中注入10 PL、5?10 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化，繪制工作曲線；
(4)用血清樣品溶液代替前列腺特異性抗原標(biāo)準溶液，按照工作曲線繪制的方法進行檢測。
[0009]本發(fā)明的有益成果
(1)Au-NH2-GS納米復(fù)合材料與Au-GS復(fù)合材料相比增加抗體在其表面的負載量和在水中的分散性，從而提高傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性。
[0010](2)將碳納米管中引入還原氧化石墨烯中，形成獨特的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增大了比表面積，負載更多的Pt納米粒子，使抗體容易與其結(jié)合。
[0011](3)將三維GS-CNT-Pt納米復(fù)合物與腫瘤標(biāo)志物二抗直接孵化，利用貴金屬優(yōu)異的生物相容性和較高的催化性能，在二抗的標(biāo)記中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的檢測誤差，顯著提高了電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。
[0012](4)本發(fā)明利用抗原、抗體的免疫反應(yīng)，提高了檢測方法的特異性。
[0013](5)本發(fā)明制備的電化學(xué)免疫傳感器用于前列腺癌特異性抗原標(biāo)志物的檢測，具有響應(yīng)時間短，檢測限低，線性范圍寬，可以實現(xiàn)簡單、快速、高靈敏和特異性檢測等優(yōu)點，線性范圍為 0.50 pg/mL^15 ng/mL，檢測限為 0.12 pg/mL。

【具體實施方式】
[0014]實施例1 一種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器制備方法
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用0.05 Mm的A1203拋光粉打磨，用超純水清洗干凈；將4 μ?、0.5 mg/mL的Au-NH2-GS溶液滴加到處理好的裸電極上，放置4 °C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 V冰箱中晾干；
(2)將4μ?、8 Pg/mL的前列腺癌標(biāo)志物一抗溶液滴加到電極表面，放置4°C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(3)將3PL、質(zhì)量分數(shù)為0.5 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，放置4 °C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(4)滴加4μ?、0.5 pg/mL?15 ng/mL的一系列不同濃度的前列腺癌標(biāo)志物抗原標(biāo)準溶液到電極表面，放置4 °C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(5)將4μ?、3 mg/mL的GS_CNT_Pt/Ab2 二抗孵化物溶液滴涂于電極表面上，置于4 V冰箱中晚干后，超純水沖洗，制得如列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器。
[0015]實施例2 —種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器制備方法
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用0.05 Mm的A1203拋光粉打磨，用超純水清洗干凈；將5μ?、1.0 mg/mL的Au_NH2_GS溶液滴加到處理好的裸電極上，放置4 °C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 V冰箱中晾干；
(2)將5μ?、10 Pg/mL的前列腺癌標(biāo)志物一抗溶液滴加到電極表面，放置4 °〇冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(3)將3PL、質(zhì)量分數(shù)為2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，放置4°C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(4)滴加5PL、0.5 pg/mL?15 ng/mL的一系列不同濃度的前列腺癌標(biāo)志物抗原標(biāo)準溶液到電極表面，放置4 °C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(5)將5μ?、5 mg/mL的GS_CNT_Pt/Ab2 二抗孵化物溶液滴涂于電極表面上，置于4 V冰箱中晚干后，超純水沖洗，制得如列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器。
[0016]實施例3 —種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器制備方法
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用0.05 Mm的A1203拋光粉打磨，用超純水清洗干凈；將6 μ?,2 mg/mL的Au_NH2_GS溶液滴加到處理好的裸電極上，放置4°C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(2)將6μ?、12 Pg/mL的前列腺癌標(biāo)志物一抗溶液滴加到電極表面，放置4 °〇冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(3)將3PL、質(zhì)量分數(shù)為3.0 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，放置4 °C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(4)滴加6μ?、0.5 pg/mL?15 ng/mL的一系列不同濃度的前列腺癌標(biāo)志物抗原標(biāo)準溶液到電極表面，放置4 °C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(5)將6μ?、6 mg/mL的GS_CNT_Pt/Ab2 二抗孵化物溶液滴涂于電極表面上，置于4 V冰箱中晚干后，超純水沖洗，制得如列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器。
[0017]實施例4 Au-NH2_GS納米復(fù)合材料溶液的制備 (1)金納米粒子溶液的制備
將100 mL、質(zhì)量分數(shù)為0.01%的HAuC14溶液加熱至沸，滴加2.0 mL、質(zhì)量分數(shù)為0.5%
的檸檬酸鈉水溶液，溶液顏色變?yōu)榧t棕色，冷卻至室溫；
(3)氨基化石墨烯NH2-GS的制備
0.05 g石墨烯分散在5 mL的乙醇中，超聲攪拌1 h，加入0.1 mL、質(zhì)量分數(shù)為99%的3_氨丙基三乙氧基硅烷，在70 1:條件下加熱攪拌1.0 h;加入0.1 mL、質(zhì)量分數(shù)為80%的水合肼，95 °C加熱1 h;在9000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心20 min ;在真空條件下干燥8 h，制得氨基化石墨烯NH2-GS;
(3)Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液的制備
稱取10 mg的氨基化石墨烯NH2-GS置于小燒杯中，加入10 mL金納米溶液，攪拌10 h，離心后在真空條件35 °C下干燥12 h，制得Au-NH2-GS納米復(fù)合材料，用水配制成0.5 mg/mL的Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液。
[0018]實施例5 Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液的制備
(1)金納米粒子溶液的制備
將100mL、質(zhì)量分數(shù)為0.015%的HAuC14溶液加熱至沸，滴加2.5 mL、質(zhì)量分數(shù)為1.0%
的檸檬酸鈉水溶液，溶液顏色變?yōu)榧t棕色，冷卻至室溫；
(4)氨基化石墨烯NH2-GS的制備
0.1 g石墨烯分散在10 mL的乙醇中，超聲攪拌1 h，加入0.2 mL、質(zhì)量分數(shù)為99%的3_氨丙基三乙氧基硅烷，在70°C條件下加熱攪拌1.5 h;加入0.1 mL、質(zhì)量分數(shù)為80%的水合肼，95 °C加熱1 h;在9000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心30 min ;在真空條件下干燥10 h，制得氨基化石墨烯NH2-GS ； (3) Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液的制備
稱取15 mg的氨基化石墨烯NH2-GS置于小燒杯中，加入15 mL金納米溶液，攪拌12 h，離心后在真空條件40 °C下干燥12 h，制得Au-NH2-GS納米復(fù)合材料，用水配制成1.0 mg/mL的Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液。
[0019]實施例6 Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液的制備
(1)金納米粒子溶液的制備
將100 mL、質(zhì)量分數(shù)為0.02%的HAuC14溶液加熱至沸，滴加3.0 mL、質(zhì)量分數(shù)為1.5%
的檸檬酸鈉水溶液，溶液顏色變?yōu)榧t棕色，冷卻至室溫；
(5)氨基化石墨烯NH2-GS的制備
0.2 g石墨烯分散在15 mL的乙醇中，超聲攪拌1 h，加入0.3 mL、質(zhì)量分數(shù)為99%的3_氨丙基三乙氧基硅烷，在70 1:條件下加熱攪拌2.0 h;加入0.1 mL、質(zhì)量分數(shù)為80%的水合肼，95 °C加熱1 h;在9000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心40 min ;在真空條件下干燥12 h，制得氨基化石墨烯NH2-GS ；
(3) Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液的制備
稱取20 mg的氨基化石墨烯NH2-GS置于小燒杯中，加入20 mL金納米溶液，攪拌14 h，離心后在真空條件45 °C下干燥12 h，制得Au-NH2-GS納米復(fù)合材料，用水配制成2 mg/mL的Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液。
[0020]實施例7 GS-CNT-Pt/Ab2 二抗孵化物溶液的制備
(1)氧化石墨烯的制備
將0.3 g的石墨和1.5 g高錳酸鉀混合，放入帶有磁子的500 mL的三口瓶中，加入體積比為8: 1的硫酸和磷酸混合液，將三口瓶放入油浴鍋，加熱到50 °C，反應(yīng)10 h;將樣品傾倒到40 mL的冰上，磁力攪拌下，滴加0.5 mL的過氧化氫，溶液變?yōu)橥咙S色，在8000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心0.5 h,依次用30 mL、0.2 mol/L的鹽酸及30 mL的無水乙醇離心洗漆3次，棄去上清液，用乙醚離心洗滌1次，棄去上清液，得到的固體樣品置于30° C的真空干燥箱中干燥12 h，制得氧化石墨烯棕黃色固體粉末；
(2)三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT納米復(fù)合材料的制備
將20 mg的碳納米管CNT加入到30 mL、l mg/mL的氧化石墨烯的均勻分散液中，超聲30 min，將得到的混合物放入50 mL的高壓反應(yīng)釜中，加熱升溫至160 °C，并保持12 h，冷卻至室溫，將得到的混合物冷凍干燥；
(3)三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物的制備
在劇烈攪拌的條件下，將1 mL、5 mmol/L的1(2?比14溶液和5 mg的三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT納米復(fù)合材料加入到10 mL的超純水中，冰浴30 min, 7000 rpm下離心分離5 min,制得三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物，用水洗滌、離心分離3次，35 °C下真空干燥12 h ;
(4)GS-CNT-Pt/Ab2 二抗孵化物溶液的制備
將3mg的三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物加入到3 mL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入150 μ?、10 Pg/mL的前列腺癌標(biāo)記物二抗Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化24h，3000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心10 min，加入1 mL、pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，制得GS-CNT-Pt/Ab2 二抗孵化物溶液，4 °C下保存?zhèn)溆谩?br> [0021]實施例8 GS-CNT_Pt/Ab2 二抗孵化物溶液的制備 (1)氧化石墨烯的制備
將0.3 g的石墨和1.8 g高錳酸鉀混合，放入帶有磁子的500 mL的三口瓶中，加入體積比為9: 1的硫酸和磷酸混合液，將三口瓶放入油浴鍋，加熱到50 °C，反應(yīng)11 h;將樣品傾倒到40 mL的冰上，磁力攪拌下，滴加0.8 mL的過氧化氫，溶液變?yōu)橥咙S色，在8000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心0.5 h,依次用30 mL、0.2 mol/L的鹽酸及30 mL的無水乙醇離心洗漆3次，棄去上清液，用乙醚離心洗滌1次，棄去上清液，得到的固體樣品置于35° C的真空干燥箱中干燥12 h，制得氧化石墨烯棕黃色固體粉末；
(2)三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT納米復(fù)合材料的制備
將30mg的碳納米管CNT加入到30 mL、2 mg/mL的氧化石墨烯的均勻分散液中，超聲30 min，將得到的混合物放入50 mL的高壓反應(yīng)釜中，加熱升溫至180 °C，并保持12 h，冷卻至室溫，將得到的混合物冷凍干燥；
(3)三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物的制備
在劇烈攪拌的條件下，將1 mL、10 mmol/L的1(2?比14溶液和5 mg的三維GS-CNT納米復(fù)合材料加入到10 mL的超純水中，冰浴30 min, 7000 rpm下離心分離5 min,制得三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物，用水洗滌、離心分離3次，40°C下真空干燥12h ；
(4)GS-CNT-Pt/Ab2 二抗孵化物溶液的制備
將5 mg的三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物加入到5 mL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入200 μ?、10 Pg/mL的前列腺癌標(biāo)記物二抗Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化24 h，3000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心10 min，加入1 mL、pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，制得GS-CNT-Pt/Ab2 二抗孵化物溶液，4 °C下保存?zhèn)溆谩?br> [0022]實施例9 GS-CNT-Pt/Ab2 二抗孵化物溶液的制備
(1)氧化石墨烯的制備
將0.3 g的石墨和2.0 g高錳酸鉀混合，放入帶有磁子的500 mL的三口瓶中，加入體積比為10: 1的硫酸和磷酸混合液，將三口瓶放入油浴鍋，加熱到50 V，反應(yīng)12 h ;將樣品傾倒到40 mL的冰上，磁力攪拌下，滴加1.0 mL的過氧化氫，溶液變?yōu)橥咙S色，在8000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心0.5 h,依次用30 mL、0.2 mol/L的鹽酸及30 mL的無水乙醇離心洗漆3次，棄去上清液，用乙醚離心洗滌1次，棄去上清液，得到的固體樣品置于40 °C的真空干燥箱中干燥12 h，制得氧化石墨烯棕黃色固體粉末；
(2)三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT納米復(fù)合材料的制備
將40 mg的碳納米管CNT加入到30 mL、3 mg/mL的氧化石墨烯的均勻分散液中，超聲30 min，將得到的混合物放入50 mL的高壓反應(yīng)釜中，加熱升溫至190 °C，并保持12 h，冷卻至室溫，將得到的混合物冷凍干燥；
(3)三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物的制備
在劇烈攪拌的條件下，將1 mL、15 mmol/L的K2PtCl4溶液和5 mg的三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT納米復(fù)合材料加入到10 mL的超純水中，冰浴30 min, 7000 rpm下離心分離5 min,制得三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物，用水洗滌、離心分離3次，45 °C下真空干燥12 h ；
(4)GS-CNT-Pt/Ab2 二抗孵化物溶液的制備
將6 mg的三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物加入到6 mL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入300 μ?、10 Pg/mL的前列腺癌標(biāo)記物二抗Ab2溶液，4 °C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化24 h，3000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心10 min，加入1 mL、pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，制得GS-CNT-Pt/Ab2 二抗孵化物溶液，4 °C下保存?zhèn)溆谩?br> [0023]實施例10前列腺癌標(biāo)志物的檢測
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、30 mmol/L的pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；
(2)用計時電流法對前列腺特異性抗原標(biāo)準溶液進行檢測，輸入電壓為-0.4 V，取樣間隔0.1 s，運行時間300 s ；
(3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、30 mmol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中注入10 μ?、5 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化，繪制工作曲線；
(4)用血清樣品溶液代替前列腺特異性抗原標(biāo)準溶液，按照工作曲線繪制的方法進行檢測。
[0024]實施例11前列腺癌標(biāo)志物的檢測
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的PH8.0磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；
(2)用計時電流法對前列腺特異性抗原標(biāo)準溶液進行檢測，輸入電壓為-0.4 V，取樣間隔0.1 s，運行時間300 s ；
(3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中注入10 μ?、10 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化，繪制工作曲線；
(4)用血清樣品溶液代替前列腺特異性抗原標(biāo)準溶液，按照工作曲線繪制的方法進行檢測，線性范圍為0.50 pg/mL?15 ng/mL,檢測限為0.12 pg/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器制備方法，其特征在于，步驟如下: (1)將直徑為4mm的玻碳電極用0.05 Mm的Al2O3拋光粉打磨，用超純水清洗干凈；將4^6 μ?、0.5^2 mg/mL的Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液滴加到處理好的裸電極上，放置4 °C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干； (2)將4飛μ?,8?12Pg/mL的前列腺癌標(biāo)志物一抗Ab1溶液滴加到電極表面，放置4 °C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干； (3)將3PL、質(zhì)量分數(shù)為0.5?3.0 %的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，放置4°C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4°C冰箱中晾干; (4)滴加4飛μ?、0.5 pg/mL?15 ng/mL的一系列不同濃度的前列腺癌標(biāo)志物抗原標(biāo)準溶液到電極表面，放置4°C冰箱中干燥后再用超純水沖洗，4°C冰箱中晾干； (5)將4飛μ?、3?6mg/mL的GS-CNT-PVAb2 二抗孵化物溶液滴涂于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干后，超純水沖洗，制得前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的一種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器制備方法，所述Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液，其特征在于，制備步驟如下: (I)金納米粒子溶液的制備 將100 mL、質(zhì)量分數(shù)為0.01?0.02%的HAuCl4溶液加熱至沸，滴加2.0?3.0 mL、質(zhì)量分數(shù)為0.5^1.5%的檸檬酸鈉水溶液，溶液顏色變?yōu)榧t棕色，冷卻至室溫； 氨基化石墨烯NH2-GS的制備 0.05、.2 g石墨烯分散在5?15 mL的乙醇中，超聲攪拌I h，加入0.廣0.3 mL、質(zhì)量分數(shù)為99%的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在70°C條件下加熱攪拌1.(Γ2.0 h ;加入0.lmL、質(zhì)量分數(shù)為80%的水合肼,95 °C加熱I h ;在9000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心2(T40 min ;在真空條件下干燥8?12 h，制得氨基化石墨烯NH2-GS ; (3)Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液的制備 稱取1(T20 mg的氨基化石墨烯NH2-GS置于小燒杯中，加入1(T20 mL金納米溶液，攪拌10?14 h，離心后在真空條件35?45 °C下干燥12 h，制得Au-NH2-GS納米復(fù)合材料，用水配制成0.5^2 mg/mL的Au-NH2-GS納米復(fù)合材料溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的一種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器制備方法，所述GS-CNT-PtAb2 二抗孵化物溶液，其特征在于，制備步驟如下: (1)氧化石墨烯的制備 將0.3 g的石墨和1.5^2.0 g高錳酸鉀混合，放入帶有磁子的500 mL的三口瓶中，力口入體積比為8?10: I的硫酸和磷酸混合液，將三口瓶放入油浴鍋，加熱到50 °C，反應(yīng)10?12 h;將樣品傾倒到40 mL的冰上，磁力攪拌下，滴加0.5?1.0 mL的過氧化氫，溶液變?yōu)橥咙S色，在8000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心0.5 h,依次用30 mL、0.2 mol/L的鹽酸及30 mL的無水乙醇離心洗滌3次，棄去上清液，用乙醚離心洗滌I次，棄去上清液，得到的固體樣品置于3(T40 °C的真空干燥箱中干燥12 h，制得氧化石墨烯棕黃色固體粉末； (2)三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT納米復(fù)合材料的制備 將2(T40 mg的碳納米管CNT加入到30 mL、l?3 mg/mL的氧化石墨烯的均勻分散液中，超聲30 min，將得到的混合物放入50 mL的高壓反應(yīng)釜中，加熱升溫至16(Tl90 °C，并保持12 h，冷卻至室溫，將得到的混合物冷凍干燥； (3)三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物的制備 在劇烈攪拌的條件下，將I mL、5?15 mmol/L的K2PtCl4溶液和5 mg的三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT納米復(fù)合材料加入到10 mL的超純水中，冰浴30 min, 7000 rpm下離心分離5 min,制得三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物，用水洗滌、離心分離3次，35?45 °C下真空干燥12h ； (4)GS-CNT-PtAb2 二抗孵化物溶液的制備 將3飛mg的三維結(jié)構(gòu)的GS-CNT-Pt納米復(fù)合物加入到3飛mL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入15(Γ300 μ?、10 Pg/mL的前列腺癌標(biāo)記物二抗Ab2溶液，4 °C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化24 h，3000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心10 min，加入I mL、pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，制得GS-CNT-PVAb2 二抗孵化物溶液，4 °C下保存?zhèn)溆谩?br> 4.如權(quán)利要求1所述的制備方法制備的一種前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器，用于前列腺癌標(biāo)志物的檢測，檢測步驟如下: (1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、3(T50 mmol/L的pH 5.9?8.0磷酸鹽緩沖溶液中進行測試； (2)用計時電流法對前列腺特異性抗原標(biāo)準溶液進行檢測，輸入電壓為-0.4 V，取樣間隔0.1 S，運行時間300 s ； (3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、3(T50 mmol/L的pH=5.9?8.0磷酸鹽緩沖溶液中注入10 PL、5?10 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化，繪制工作曲線； (4)用血清樣品溶液代替前列腺特異性抗原標(biāo)準溶液，按照工作曲線繪制的方法進行檢測。
【文檔編號】G01N33/574GK104297480SQ201410504836
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】曹偉, 田利會, 馬洪敏, 李月云, 閆濤, 魏琴 申請人:濟南大學(xué)