一種透明質(zhì)酸固相包被方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種透明質(zhì)酸的包被方法，由以下步驟組成：(1)透明質(zhì)酸用強酸水解，使用的酸過量；(2)用NaOH中和多余的酸，所述的NaOH濃度為0.5-5mol/L；(3)用硼酸鹽緩沖液進行透析或?qū)游鲋擕}；(4)用NHS活化的生物素和處理過的透明質(zhì)酸反應(yīng)，避光，2-8℃，震蕩反應(yīng)4h；(5)用磷酸鹽緩沖液透析或?qū)游鲋ノ唇Y(jié)合的生物素；(6)將鏈霉親和素包被到固相載體上；(7)將標(biāo)有生物素的透明質(zhì)酸鏈霉親和素包被的固相共同孵育，孵育溫度37℃，孵育時間1h。本發(fā)明的優(yōu)點是：生物素化的透明質(zhì)酸與鏈霉親和素固化更穩(wěn)定，且采用二次包被生物素，結(jié)構(gòu)比以試劑形式添加的生物素更穩(wěn)定，同時也縮短了反應(yīng)時間。
【專利說明】-種透明質(zhì)酸固相包被方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供一種透明質(zhì)酸固相包被方法。

【背景技術(shù)】
[000引透明質(zhì)酸曲aluronan，HA)是一種產(chǎn)生于間質(zhì)細胞的氨基多糖，由N-已醜氨基 葡萄糖及D-葡萄糖酵酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)組成的線形多糖結(jié)構(gòu)。分子式；（CuHwNNaOjn，分子量 4, 000-8, 000萬，由肝內(nèi)皮細胞攝取、降解，其廣泛存在于結(jié)締組織、皮膚、關(guān)節(jié)液及玻璃體 液中，是結(jié)締組織基質(zhì)的主要成份之一，是反映肝臟內(nèi)皮細胞功能和活動性纖維化的良好 指標(biāo)。
[0003] 透明質(zhì)酸（HA)定量檢測試劑盒的免疫反應(yīng)系統(tǒng)采用競爭法原理，將透明質(zhì)酸 (HA)與生物素偶聯(lián)后，將其包被于偶聯(lián)有鏈霉親和素的固相載體上（固相包括微孔板、磁 微粒、酶標(biāo)板等）。校準(zhǔn)品或樣品中的HA與固相上的HA競爭結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的透 明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，充分反應(yīng)后，洗掉游離成分，加入底物工作液，在氧化劑作用下，HRP催化 魯米諾生成處于激發(fā)態(tài)的氨基鄰苯二甲酸離子，其恢復(fù)到基態(tài)時，釋放出425nm的光子，于 第5-15分鐘測定各加樣本孔的發(fā)光值RLU。樣本的RLU與樣本HA濃度呈負相關(guān)。樣本中 的HA濃度依據(jù)由校準(zhǔn)品HA濃度和對應(yīng)的RLU建立的數(shù)學(xué)模型進行定量，從而檢測人血清 中的HA含量。
[0004] 對于生物素標(biāo)記的透明質(zhì)酸包被于偶聯(lián)有鏈霉親和素的固相載體上，得到組合物 不穩(wěn)定，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與精密性，針對此問題，本發(fā)明提供了一種新的包被方法， 使包被物更穩(wěn)定，檢測結(jié)果更可靠。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的問題是提供一種透明質(zhì)酸固相包被方法，該方法采用二次包被生 物素，結(jié)構(gòu)比W試劑形式添加的生物素更穩(wěn)定，同時也縮短了反應(yīng)時間。解決了生物素標(biāo)記 的透明質(zhì)酸包被于偶聯(lián)有鏈霉親和素的固相載體時得到組合物不穩(wěn)定，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn) 確性與精密性的問題。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：
[0006] -種透明質(zhì)酸固相包被方法，其特征在于，由W下步驟組成：
[0007] (1)透明質(zhì)酸用過量強酸水解；
[000引 似用化OH中和多余的酸；
[0009] (3)用測酸鹽緩沖液進行透析或?qū)游鲋擕}；
[0010] (4)用N服活化的生物素和處理過的透明質(zhì)酸反應(yīng)；反應(yīng)條件為；避光，2-8。震 蕩反應(yīng)化。
[0011] (5)用磯酸鹽緩沖液透析或?qū)游鲋ノ唇Y(jié)合的生物素；
[0012] (6)將鏈霉親和素包被到固相載體上；
[0013] (7)將標(biāo)有生物素的透明質(zhì)酸與鏈霉親和素包被的固相共同賠育，賠育溫度 37 C，賠育時間Ih。
[0014] 進一步，步驟（I)中所述的強酸是硫酸、鹽酸、硝酸、高猛酸或高氯酸。
[0015] 進一步，步驟（1)中所述強酸為鹽酸，濃度為0. 5-1. 5mol/L。
[001引 進一步，步驟（2)所述的化OH濃度為0. 5-1. 5mol/L0
[0017] 進一步，步驟（6)所述的固相載體為酶標(biāo)板、發(fā)光板或磁微粒。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點是；透明質(zhì)酸很難直接生物素化，使用強酸水解后，將N-己醜葡糖 胺水解成葡糖胺；使生物素化的透明質(zhì)酸與鏈霉親和素固化更穩(wěn)定，且采用二次包被生物 素，結(jié)構(gòu)比W試劑形式添加的生物素更穩(wěn)定，同時也縮短了反應(yīng)時間。本發(fā)明顯著提高了透 明質(zhì)酸定量檢測結(jié)果的精密性和可靠性，增強了試劑盒的穩(wěn)定性。

【具體實施方式】 [001引 實施例1 :
[0020] 1、透明質(zhì)酸的處理：
[00川 （1)稱取Smg透明質(zhì)酸溶于Iml蒸觸水中；
[002引 似加入0. Imll. Smol/L鹽酸，2-8°C反應(yīng)過夜；
[0023] 做加入 0. Imll. Smol/L NaOH,中和至中性；
[0024] (4)測酸鹽緩沖液透析2小時W除去多余的鹽離子；
[002引 2、N服活化的生物素和處理過的透明質(zhì)酸反應(yīng)：
[0026] (1)取 0. 5mgN服-LC-LC-Biotin 溶于 0. 5ml 蒸觸水中；將 Biotin 溶液加入 水解后的透明質(zhì)酸溶液中，暗置振蕩反應(yīng)4小時，得到HA-Biotin復(fù)合物、未結(jié)合的 畑S-LC-LC-Biotin混合溶液；
[0027] 似稱取53. 5mg畑典1溶解到Iml蒸觸水中，配制成Imol/LNACl溶液；
[002引 做將似巧幌的溶液加入到（1)中，在避光條件，2-8C下，震蕩反應(yīng)化；
[0029] (4)用磯酸鹽緩沖液于2-8C透析2化，得到HA-Motin復(fù)合物。
[0030] 4、鏈霉親和素固相包被：
[0031] (1)將鏈霉親和素按照2yg/ml的濃度包被到白色聚苯己帰塑料板上，每孔 IOOuL 37 °C條件下反應(yīng)化；
[0032] (2)洗板；用tris-tween洗液洗涂3次，甩干；
[0033] 5、HA-biotin 復(fù)合物二次包被：
[0034] (1)將HA-biotin復(fù)合物加入鏈霉親和素包被板中，每孔100uL，37°C反應(yīng)1小時； [00巧](2)洗板；用tris-tween洗液洗涂3次，甩干；
[003引 做用含有1%牛血清白蛋白的蛋白溶液進行封閉，每孔加入200uL封閉液，37°C 反應(yīng)化，棄去孔內(nèi)封閉液，甩干；
[0037] (4)將包被板置于37C烘箱化，即完成透明質(zhì)酸在固相塑料板上的包被，之后用 鉛鉛袋密封，存放于-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> [003引實施例2 ;包被板加速穩(wěn)定性試驗
[0039] 用本發(fā)明的方法包被96孔發(fā)光板，包被H批，每批分成兩部分，一部分放置于4C 冰箱，一部分放置于37C做加速穩(wěn)定性，于7天后取出，平衡至室溫，測校準(zhǔn)品、企標(biāo)、質(zhì)控 品，檢測包被板的精密性、靈敏度、線性，W判斷其穩(wěn)定性。實驗結(jié)果如下表：
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種透明質(zhì)酸固相包被方法，其特征在于，由以下步驟組成： (1) 透明質(zhì)酸用強酸水解，使用的酸過量； (2) 用NaOH中和多余的酸； (3) 用硼酸鹽緩沖液進行透析或?qū)游鲋擕}； (4) 用NHS活化的生物素和處理過的透明質(zhì)酸反應(yīng)，避光，2-8°C，震蕩反應(yīng)4h ; (5) 用磷酸鹽緩沖液透析或?qū)游鲋ノ唇Y(jié)合的生物素； (6) 將鏈霉親和素包被到固相載體上； (7) 將標(biāo)有生物素的透明質(zhì)酸與鏈霉親和素包被的固相共同孵育，孵育溫度37°C，孵 育時間lh。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種透明質(zhì)酸固相包被方法，其特征在于，步驟⑴中所述的 強酸是硫酸、鹽酸、硝酸、高錳酸或高氯酸中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種透明質(zhì)酸固相包被方法，其特征在于，步驟⑴中所述強 酸為鹽酸，濃度為〇· 5-5mol/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種透明質(zhì)酸固相包被方法，其特征在于，步驟⑴中所述強 酸為鹽酸，濃度為1. 5mol/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種透明質(zhì)酸固相包被方法，其特征在于，步驟（2)所述的 NaOH 濃度為 0· 5-5mol/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種透明質(zhì)酸固相包被方法，其特征在于，步驟（2)所述的 NaOH 濃度為 1. 5mol/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種透明質(zhì)酸固相包被方法，其特征在于，步驟（6)所述的固 相載體為酶標(biāo)板、發(fā)光板或磁微粒。
【文檔編號】G01N33/531GK104237500SQ201410520510
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】劉萍, 欒大偉, 張振斌, 陳露鸞, 侯玉文, 楊桂霞, 黃新城, 劉靳波 申請人:博奧賽斯（天津）生物科技有限公司