一種檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否斷裂的方法
【專利摘要】一種檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否斷裂的方法，是采用碘乙酸與蛋白質(zhì)中的游離巰基反應(yīng)，通過超濾去除未反應(yīng)的碘乙酸，再運用二硫蘇糖醇切斷蛋白質(zhì)中的二硫鍵，進(jìn)而采用碘乙酰胺與新產(chǎn)生的巰基反應(yīng)，運用胰蛋白酶將蛋白質(zhì)水解成多肽，借助高分辨率質(zhì)譜檢測多肽的質(zhì)荷比信息，與天然蛋白質(zhì)的二硫鍵信息進(jìn)行對比，確定二硫鍵是否發(fā)生斷裂。本發(fā)明可有效用于確定巰基是以游離或者二硫鍵的形式存在；碘乙酸和碘乙酰胺與巰基反應(yīng)后引起的質(zhì)量差在1Da以內(nèi)，因此運用高分辨率質(zhì)譜能十分準(zhǔn)確的斷定二者的差別；蛋白質(zhì)二硫鍵是否發(fā)生斷裂的準(zhǔn)確判斷能為相關(guān)理論研究奠定基礎(chǔ)，為特定的蛋白質(zhì)修飾及實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
【專利說明】一種檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否斷裂的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否斷裂的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]二硫鍵是由2個巰基被氧化而形成的-S-S-形式的共價鍵。二硫鍵分兩種，即分子內(nèi)和分子間二硫鍵，分子內(nèi)二硫鍵存在于單獨的多肽鏈中用來穩(wěn)固蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，而分子間二硫鍵存在于肽鏈之間用來穩(wěn)定蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。二硫鍵的斷裂會促使蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的改變，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的生物特性及反應(yīng)活性，例如，二硫鍵的斷裂會加速卵清蛋白發(fā)生糖基化反應(yīng)。目前，人類正不斷嘗試通過某種技術(shù)改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而改造其性能。例如，通過超聲波技術(shù)可以改變牛血清白蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)而加速其發(fā)生糖基化反應(yīng)的速率。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變是否和二硫鍵斷裂有關(guān)？這一問題的回答有利于指導(dǎo)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的定向改造，因此，尋找一種能夠準(zhǔn)確檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否發(fā)生斷裂的方法顯得十分必要。
[0003]本發(fā)明采用碘乙酸與蛋白質(zhì)中的游離巰基反應(yīng)，通過超濾去除未反應(yīng)的碘乙酸，再運用二硫蘇糖醇斷裂蛋白質(zhì)的二硫鍵產(chǎn)生新的巰基，采用碘乙酰胺與蛋白質(zhì)中新產(chǎn)生的巰基反應(yīng)，運用胰蛋白酶將被碘乙酰胺作用后的蛋白質(zhì)水解成多肽，借助高分辨率質(zhì)譜檢測多肽的質(zhì)荷比信息，與天然蛋白質(zhì)的二硫鍵信息進(jìn)行對比，確定二硫鍵是否發(fā)生斷裂。本發(fā)明采用碘乙酸與蛋白質(zhì)的游離巰基反應(yīng)、碘乙酰胺與經(jīng)二硫蘇糖醇斷裂蛋白質(zhì)二硫鍵得到的巰基反應(yīng)，運用高分辨率質(zhì)譜進(jìn)行檢測，國內(nèi)外未有文獻(xiàn)進(jìn)行相關(guān)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否斷裂的方法，采用碘乙酸與蛋白質(zhì)的游離巰基反應(yīng)、碘乙酰胺與經(jīng)二硫蘇糖醇斷裂蛋白質(zhì)二硫鍵得到的巰基反應(yīng)，運用高分辨率質(zhì)譜進(jìn)行檢測，與天然蛋白質(zhì)的二硫鍵信息進(jìn)行比對，確定二硫鍵是否發(fā)生斷裂。
[0005]其具體工藝步驟如下：
I、蛋白質(zhì)游離巰基與碘乙酸反應(yīng)
(1)蛋白質(zhì)溶液的配制：用IO-IOOmM的碳酸氫氨溶液溶解得到O.1-2. O mg/ml的蛋白質(zhì)溶液；
(2)碘乙酸溶液的配制：用超純水配制50-150mM的碘乙酸溶液；
(3)蛋白質(zhì)游離巰基與碘乙酸反應(yīng)：將10-30μ I蛋白質(zhì)溶液與3-10 μ I碘乙酸溶液混合，混勻后，避光放置20-60 min ；
(4)去除未參與反應(yīng)的碘乙酸：采用1000-10000Da的超濾離心管去除未參與反應(yīng)的多余碘乙酸。
[0006]2、二硫蘇糖醇斷裂蛋白質(zhì)二硫鍵
(O 二硫蘇糖醇溶液配制：用超純水配制50-150mM的二硫蘇糖醇溶液；
(2)二硫蘇糖醇斷裂蛋白質(zhì)二硫鍵：向蛋白質(zhì)溶液中加入二硫蘇糖醇溶液2-10 μ 1，50-100°C處理3-30min，冷卻至室溫；
3、碘乙酰胺與經(jīng)二硫蘇糖醇斷裂二硫鍵得到的巰基反應(yīng)
(1)碘乙酰胺溶液的配制：用超純水配制50-150mM的碘乙酰胺溶液；
(2)碘乙酰胺與經(jīng)二硫蘇糖醇斷裂二硫鍵得到的巰基反應(yīng)：向蛋白質(zhì)溶液中加入碘乙酰胺溶液5-15 μ 1，混勻后，避光放置20-60 min ；
4、胰蛋白酶酶解蛋白質(zhì)
(O胰蛋白酶的配制：用超純水配制O. 1-1. Omg/ml的胰蛋白酶溶液；
(2)胰蛋白酶酶解蛋白質(zhì)：按照蛋白質(zhì)與胰蛋白酶質(zhì)量比g/g為100:1-100:1，將胰蛋白酶與蛋白質(zhì)溶液混合，在30-50°C的搖床中放置8-24h ；
(3)中止胰蛋白酶的水解反應(yīng)：加入1-10%的三氟乙酸2-10μ I中止胰蛋白酶的水解反應(yīng)，得到最終的蛋白質(zhì)水解混合物。
[0007]5、高分辨率質(zhì)譜檢測
(1)上樣：將2-15μ g的蛋白質(zhì)水解物注射入高效液相色譜儀，脫鹽3-10min ；
(2)高分辨率質(zhì)譜檢測：連接高效液相色譜儀和高分辨率質(zhì)譜設(shè)備，采譜30-60min，記錄蛋白質(zhì)水解物的質(zhì)譜信息；
6、數(shù)據(jù)分析
(1)質(zhì)譜圖譜分析：整理蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的質(zhì)譜信息，碘乙酸與巰基反應(yīng)會使多肽質(zhì)量增加57. 09-58. 02Da，碘乙酰胺與巰基反應(yīng)會使多肽質(zhì)量增加57. 01-57. 03Da ；
(2)蛋白質(zhì)中巰基游離情況分析：根據(jù)蛋白質(zhì)水解物的質(zhì)荷比增加信息，斷定巰基是與碘乙酸發(fā)生反應(yīng)還是與碘乙酰胺發(fā)生反應(yīng)，若與碘乙酸發(fā)生反應(yīng)則說明蛋白質(zhì)中的巰基是游離的，若與碘乙酰胺發(fā)生反應(yīng)則說明蛋白質(zhì)中的巰基是結(jié)合的，即以二硫鍵的形式存在；
(3)確定蛋白質(zhì)中的二硫鍵是否發(fā)生斷裂：根據(jù)數(shù)據(jù)庫中天然蛋白質(zhì)的二硫鍵存在信息，對比實驗中得到的二硫鍵信息，確定蛋白質(zhì)中的二硫鍵是否發(fā)生斷裂。
[0008]本專利技術(shù)特征：采用碘乙酸與蛋白質(zhì)的游離巰基反應(yīng)、碘乙酰胺與經(jīng)二硫蘇糖醇斷裂蛋白質(zhì)二硫鍵得到的巰基反應(yīng)，運用高分辨率質(zhì)譜進(jìn)行檢測，根據(jù)質(zhì)譜圖譜給出的二硫鍵信息，對比天然蛋白質(zhì)的二硫鍵信息，準(zhǔn)確判斷蛋白質(zhì)的二硫鍵是否發(fā)生斷裂。
[0009]本發(fā)明的有益效果：
I、碘乙酸和碘乙酰胺都可以與游離巰基發(fā)生反應(yīng)，但是反應(yīng)后二者引起的質(zhì)量增加情況不同，可以有效用于確定巰基是以游離或者二硫鍵的形成存在；2、碘乙酸和碘乙酰胺與巰基反應(yīng)后引起的質(zhì)量差在IDa以內(nèi)，因此，運用高分辨率質(zhì)譜能十分準(zhǔn)確的斷定二者的差別；3、蛋白質(zhì)二硫鍵是否發(fā)生斷裂的準(zhǔn)確判斷能為相關(guān)理論研究奠定基礎(chǔ)，為特定的蛋白質(zhì)修飾及實際生產(chǎn)提供依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖I為本發(fā)明的工藝流程圖。

【具體實施方式】
[0011]實施例一 I、蛋白質(zhì)游離巰基與碘乙酸反應(yīng)
(1)蛋白質(zhì)溶液的配制：用50mM的碳酸氫氨溶液溶解得到I.O mg/ml的蛋白質(zhì)溶液；
(2)碘乙酸溶液的配制：用超純水配制IOOmM的碘乙酸溶液；
(3)蛋白質(zhì)游離巰基與碘乙酸反應(yīng)：將10μ I蛋白質(zhì)溶液與3μ I碘乙酸溶液混合，混勻后，避光放置30min ；
(4)去除未參與反應(yīng)的碘乙酸：采用3000Da的超濾離心管去除未參與反應(yīng)的多余碘乙酸。
[0012]2、二硫蘇糖醇斷裂蛋白質(zhì)二硫鍵
(O 二硫蘇糖醇溶液配制：用超純水配制IOOmM的二硫蘇糖醇溶液；
(2) 二硫蘇糖醇斷裂蛋白質(zhì)二硫鍵：向蛋白質(zhì)溶液中加入二硫蘇糖醇溶液2 μ 1，95°C處理5 min,冷卻至室溫；
3、碘乙酰胺與經(jīng)二硫蘇糖醇斷裂二硫鍵得到的巰基反應(yīng)
(1)碘乙酰胺溶液的配制：用超純水配制IOOmM的碘乙酰胺溶液；
(2)碘乙酰胺與經(jīng)二硫蘇糖醇斷裂二硫鍵得到的巰基反應(yīng)：向蛋白質(zhì)溶液中加入碘乙酰胺溶液5 μ 1，混勻后，避光放置20min ；
4、胰蛋白酶酶解蛋白質(zhì)
(O胰蛋白酶的配制：用超純水配制O. lmg/ml的胰蛋白酶溶液；
(2)胰蛋白酶酶解蛋白質(zhì)：按照蛋白質(zhì)與胰蛋白酶質(zhì)量比50:1(g/g)，將胰蛋白酶與蛋白質(zhì)溶液混合，在37 °C的搖床中放置12 h ;
(3)中止胰蛋白酶的水解反應(yīng)：加入10%的三氟乙酸2μI中止胰蛋白酶的水解反應(yīng)，得到最終的蛋白質(zhì)水解混合物。
[0013]5、高分辨率質(zhì)譜檢測
(1)上樣：將3μ g的蛋白質(zhì)水解物注射入高效液相色譜儀，脫鹽5 min ；
(2)高分辨率質(zhì)譜檢測：連接高效液相色譜儀和高分辨率質(zhì)譜設(shè)備，采譜60min，記錄蛋白質(zhì)水解物的質(zhì)譜信息；
6、數(shù)據(jù)分析
(1)質(zhì)譜圖譜分析：整理蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的質(zhì)譜信息，碘乙酸與巰基反應(yīng)使多肽質(zhì)量增加58. 005?a，碘乙酰胺與巰基反應(yīng)會使多肽質(zhì)量增加57. 0215Da ；
(2)蛋白質(zhì)中巰基游離情況分析：根據(jù)蛋白質(zhì)水解物的質(zhì)荷比增加信息，斷定巰基是與碘乙酸發(fā)生反應(yīng)還是與碘乙酰胺發(fā)生反應(yīng)，若與碘乙酸發(fā)生反應(yīng)則說明蛋白質(zhì)中的巰基是游離的，若與碘乙酰胺發(fā)生反應(yīng)則說明蛋白質(zhì)中的巰基是結(jié)合的，即以二硫鍵的形式存在；
(3)確定蛋白質(zhì)中的二硫鍵是否發(fā)生斷裂：根據(jù)數(shù)據(jù)庫中天然蛋白質(zhì)的二硫鍵存在信息，對比實驗中得到的二硫鍵信息，實驗結(jié)果顯示為游離巰基但是天然蛋白質(zhì)信息中顯示是以二硫鍵形成存在，說明蛋白質(zhì)的二硫鍵發(fā)生了斷裂。
[0014]實施例二
I、蛋白質(zhì)游離巰基與碘乙酸反應(yīng)
(1)蛋白質(zhì)溶液的配制：用IOOmM的碳酸氫氨溶液溶解得到I.O mg/ml的蛋白質(zhì)溶液；
(2)碘乙酸溶液的配制：用超純水配制IOOmM的碘乙酸溶液； (3)蛋白質(zhì)游離巰基與碘乙酸反應(yīng)：將20μ I蛋白質(zhì)溶液與3μ I碘乙酸溶液混合，混勻后，避光放置30min ；
(4)去除未參與反應(yīng)的碘乙酸：采用2000Da的超濾離心管去除未參與反應(yīng)的多余碘乙酸。
[0015]2、二硫蘇糖醇斷裂蛋白質(zhì)二硫鍵
(O 二硫蘇糖醇溶液配制：用超純水配制IOOmM的二硫蘇糖醇溶液；
(2)二硫蘇糖醇斷裂蛋白質(zhì)二硫鍵：向蛋白質(zhì)溶液中加入二硫蘇糖醇溶液2 μ 1，95°C處理10 min,冷卻至室溫；
3、碘乙酰胺與經(jīng)二硫蘇糖醇斷裂二硫鍵得到的巰基反應(yīng)
(1)碘乙酰胺溶液的配制：用超純水配制IOOmM的碘乙酰胺溶液；
(2)碘乙酰胺與經(jīng)二硫蘇糖醇斷裂二硫鍵得到的巰基反應(yīng)：向蛋白質(zhì)溶液中加入碘乙酰胺溶液5 μ I,混勻后,避光放置40min ；
4、胰蛋白酶酶解蛋白質(zhì)
(O胰蛋白酶的配制：用超純水配制O. lmg/ml的胰蛋白酶溶液；
(2)胰蛋白酶酶解蛋白質(zhì)：按照蛋白質(zhì)與胰蛋白酶質(zhì)量比20:1(g/g)，將胰蛋白酶與蛋白質(zhì)溶液混合，在37°C的搖床中放置18h ；
(3)中止胰蛋白酶的水解反應(yīng)：加入5%的三氟乙酸2μI中止胰蛋白酶的水解反應(yīng)，得到最終的蛋白質(zhì)水解混合物。
[0016]5、高分辨率質(zhì)譜檢測
(1)上樣：將5μ g的蛋白質(zhì)水解物注射入高效液相色譜儀，脫鹽5min ；
(2)高分辨率質(zhì)譜檢測：連接高效液相色譜儀和高分辨率質(zhì)譜設(shè)備，采譜45min，記錄蛋白質(zhì)水解物的質(zhì)譜信息；
6、數(shù)據(jù)分析
(1)質(zhì)譜圖譜分析：整理蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的質(zhì)譜信息，碘乙酸與巰基反應(yīng)使多肽質(zhì)量增加58. 004?a，碘乙酰胺與巰基反應(yīng)會使多肽質(zhì)量增加57. 0225Da ；
(2)蛋白質(zhì)中巰基游離情況分析：根據(jù)蛋白質(zhì)水解物的質(zhì)荷比增加信息，斷定巰基是與碘乙酸發(fā)生反應(yīng)還是與碘乙酰胺發(fā)生反應(yīng)，若與碘乙酸發(fā)生反應(yīng)則說明蛋白質(zhì)中的巰基是游離的，若與碘乙酰胺發(fā)生反應(yīng)則說明蛋白質(zhì)中的巰基是結(jié)合的，即以二硫鍵的形式存在；
(3)確定蛋白質(zhì)中的二硫鍵是否發(fā)生斷裂：根據(jù)數(shù)據(jù)庫中天然蛋白質(zhì)的二硫鍵存在信息，對比實驗中得到的二硫鍵信息，實驗結(jié)果顯示為游離巰基但是天然蛋白質(zhì)信息中顯示是以二硫鍵形成存在，說明蛋白質(zhì)的二硫鍵發(fā)生了斷裂。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是: A、蛋白質(zhì)游離巰基與碘乙酸反應(yīng)； B、二硫蘇糖醇斷裂蛋白質(zhì)二硫鍵； C、碘乙酰胺與經(jīng)二硫蘇糖醇斷裂二硫鍵得到的巰基反應(yīng)； D、胰蛋白酶酶解蛋白質(zhì)； E、高分辨率質(zhì)譜檢測； F、數(shù)據(jù)分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是: 所述蛋白質(zhì)游離巰基與碘乙酸反應(yīng)包括如下步驟: (1)用10-100mM的碳酸氫氨溶液溶解得到0.1-2.0mg/ml的蛋白質(zhì)溶液； (2)用超純水配制50-150mM的碘乙酸溶液；(3)將10-30μ 1蛋白質(zhì)溶液與3-10 μ 1碘乙酸溶液混合，混勻后，避光放置20-60min ； (4)采用1000-10000Da的超濾離心管去除未參與反應(yīng)的多余碘乙酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是: 所述二硫蘇糖醇斷裂蛋白質(zhì)二硫鍵包括如下步驟: (1)用超純水配制50-150mM的二硫蘇糖醇溶液； (2)向蛋白質(zhì)溶液中加入二硫蘇糖醇溶液2-1(^1，50-1001:處理3-301^11，冷卻至室溫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是: 所述碘乙酰胺與經(jīng)二硫蘇糖醇斷裂二硫鍵得到的巰基反應(yīng)包括如下步驟: (1)用超純水配制50-150mM的碘乙酰胺溶液； (2)向蛋白質(zhì)溶液中加入碘乙酰胺溶液5-15μ 1，混勻后，避光放置20-60min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是: 所述胰蛋白酶酶解蛋白質(zhì)包括如下步驟: (1)用超純水配制0.1-1.0mg/ml的胰蛋白酶溶液； (2)按照蛋白質(zhì)與胰蛋白酶質(zhì)量比g/g為100:1-100:1，將胰蛋白酶與蛋白質(zhì)溶液混合，在30-50°C的搖床中放置8-24h ； (3)加入1-10%的三氟乙酸2-10μ 1中止胰蛋白酶的水解反應(yīng)，得到最終的蛋白質(zhì)水解混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是: 所述高分辨率質(zhì)譜檢測包括如下步驟: (1)將2-15μ g的蛋白質(zhì)水解物注射入高效液相色譜儀，脫鹽3-10min ； (2)連接高效液相色譜儀和高分辨率質(zhì)譜設(shè)備，采譜30-60min，記錄蛋白質(zhì)水解物的質(zhì)譜信息。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測蛋白質(zhì)二硫鍵是否斷裂的方法，其特征是: 所述數(shù)據(jù)分析包括如下步驟: (1)整理蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的質(zhì)譜信息，碘乙酸與巰基反應(yīng)會使多肽質(zhì)量增加.57.09-58.02Da，碘乙酰胺與巰基反應(yīng)會使多肽質(zhì)量增加57.01-57.03Da;(2)根據(jù)蛋白質(zhì)水解物的質(zhì)荷比增加信息，斷定巰基是與碘乙酸發(fā)生反應(yīng)還是與碘乙酰胺發(fā)生反應(yīng)，若與碘乙酸發(fā)生反應(yīng)則說明蛋白質(zhì)中的巰基是游離的，若與碘乙酰胺發(fā)生反應(yīng)則說明蛋白質(zhì)中的巰基是結(jié)合的，即以二硫鍵的形式存在；(3)根據(jù)數(shù)據(jù)庫中天然蛋白質(zhì)的二硫鍵存在信息，對比實驗中得到的二硫鍵信息，確定蛋白質(zhì)中的二硫鍵是否發(fā)生斷裂。
【文檔編號】G01N30/88GK104237439SQ201410526145
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】涂宗財, 沙小梅, 肖輝, 王輝, 段鄧樂, 陳媛, 劉光憲 申請人:江西師范大學(xué)