一種抗非洲豬瘟病毒的特異性IgY抗體及制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗非洲豬瘟病毒p54蛋白的特異性IgY抗體及其制備方法，及利用該方法生產(chǎn)的IgY抗體在特異性檢測非洲豬瘟病毒抗體中的應(yīng)用。該特異性IgY抗體可以通過以下方法制備：利用基因重組表達的方法制備p54蛋白抗原，免疫23周齡海蘭蛋雞，共進行4次免疫，收集雞蛋，利用飽和硫酸銨沉淀法提取和純化卵黃免疫球蛋白(IgY抗體)?；谠撎禺愋訧gY抗體所建立的檢測非洲豬瘟血清抗體的競爭ELISA方法，效果良好，只有非洲豬瘟的陽性血清檢測結(jié)果呈陽性，與商品化ASFV抗體檢測ELISA試劑盒的平行檢測結(jié)果一致。該競爭ELISA方法可用于非洲豬瘟的血清流行病學(xué)普查和監(jiān)測，防控該病經(jīng)出入境口岸傳入國內(nèi)。
【專利說明】一種抗非洲豬瘟病毒的特異性IgY抗體及制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動物病毒抗體檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種抗非洲豬瘟病毒p54蛋白特異性IgY抗體及制備方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002]非洲豬瘟(African Swine Fever, ASF)是豬的一種烈性病毒病，自1909年首次在非洲發(fā)現(xiàn)以來，目前已蔓延擴散到整個非洲、歐洲、南美洲和亞洲等國家和地區(qū)，發(fā)病國家因此蒙受了巨大的經(jīng)濟損失，該病被國際動物衛(wèi)生組織(OIE)列為重要動物疫病。我國雖然還沒有發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟疫情，但根據(jù)周邊國家的發(fā)病情況，以及2006年以來我國部分省市暴發(fā)的豬流行性疫病給我們敲響了警鐘，我國已面臨ASF傳入和流行的嚴重威脅。
[0003]非洲豬痕病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)屬于非洲豬痕病毒科,是目前唯一已知的代表種，也是唯一的蟲媒DNA病毒。ASFV共有12個蛋白具有抗原表位，分別為p30 (CP204L)、p54(E183L)、p72 (B646L)、細菌組蛋白樣蛋白(A104R)、plO(K78R)、3 個非結(jié)構(gòu)蛋白(F334L、K196R 和 NP419L)和 4 個未定義的蛋白(B602L、C44L、Cp312R 和 K205R)，其中針對p54、K205R、A104R和B602L這4種蛋白的抗體滴度較高，維持時間也較長。p54是ASFV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，由E183L基因編碼，分子質(zhì)量約為25Ku，具有很好的抗原性，參與病毒中和反應(yīng)。在弱毒攻毒后7d?1d即可檢測到抗體，用該蛋白建立的ELISA抗體檢測方法，具有很高的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，是目前綜合評價最好的ELISA檢測抗原。
[0004]雞卵黃免疫球蛋白(IgY)作用等同于哺乳動物的IgG，但與其他哺乳動物制備多克隆抗體相比，特異性IgY抗體制備具有抗原用量少、制備周期短、成功率高、動物創(chuàng)傷小、產(chǎn)量大等優(yōu)勢。IgY與IgG相比，其穩(wěn)定性較強:室溫保存適宜溫度下可保存較長時間(6個月后中和病毒的活性沒有太大的改變)，但濃度較低時(低于0.lmg/mL)放置5個月其活性開始下降，耐高溫、耐酸，從而方便IgY抗體的運輸和使用。目前純化的IgY抗體已廣泛在免疫沉淀反應(yīng)、免疫電泳、ELISA、免疫電鏡、免疫吸附和Western-blot等檢測技術(shù)上應(yīng)用。
[0005]非洲豬瘟屬于一種外來疫病，目前我國還沒有該病的報道，但近鄰俄羅斯曾多次發(fā)生該病，最近的一次爆發(fā)于2014年8月，因此做好實驗室技術(shù)儲備，對于監(jiān)測和防控該病的傳入具有重要作用。目前關(guān)于ASFV p54蛋白的研究，主要集中在原核表達和鼠源單克隆抗體的制備以及基于此建立的ELISA方法，還未見特異性抗ASFV p54蛋白的雞IgY抗體制備的報道。本發(fā)明旨在建立抗ASFV-p54蛋白的特異性IgY抗體的制備方法及基于IgY抗體的檢測非洲豬瘟抗體的競爭ELISA方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗ASFV p54蛋白的特異性卵黃免疫球蛋白(抗體)及其制備方法，并進一步提供基于抗ASFV p54蛋白IgY抗體的檢測非洲豬瘟血清抗體的競爭ELISA方法。
[0007]本發(fā)明提供了一種抗非洲豬瘟病毒p54蛋白的特異性IgY抗體的制備方法，包括以下步驟:
[0008](I)制備非洲豬瘟病毒重組p54抗原，所述p54抗原是用連接有所屬重組p54蛋白基因的原核表達載體pET-52b(+)3C/LIC在大腸桿菌BL21(DE3)中表達得到的；
[0009](2)應(yīng)用(I)所述重組p54抗原免疫產(chǎn)蛋雞；所述免疫產(chǎn)蛋雞的方法如下:
[0010]第一次免疫:將免疫抗原與等量弗氏完全佐劑乳化，抗原免疫劑量為200 μ g/只；
[0011]第二次免疫:第一次免疫后14d，將免疫抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，抗原免疫劑量為200 μ g/只；
[0012]第三次免疫:第二次免疫后14d，將免疫抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，抗原免疫劑量為200 μ g/只；
[0013]第四次免疫:第三次免疫后30d，直接注射免疫抗原，不使用佐劑，抗原免疫劑量為 200 μ g/ 只；
[0014](3)收集雞蛋，分離蛋黃，提取卵黃免疫球蛋白，所述卵黃免疫球蛋白中即含有特異性的抗非洲豬瘟病毒P54蛋白的IgY抗體。
[0015]本發(fā)明的內(nèi)容還包括按照上述方法制備的抗非洲豬瘟病毒p54蛋白的特異性IgY抗體。
[0016]進一步的，本發(fā)明的內(nèi)容還包括所述的抗非洲豬瘟病毒P54蛋白在檢測非洲豬瘟病毒抗體的應(yīng)用。
[0017]具體的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0018](I)抗原制備
[0019]根據(jù)pET_52b (+) 3C/LIC質(zhì)粒試劑盒說明，設(shè)計引入特定序列的p54基因的上下游引物，從含有ASFV-p54基因的pMD 18-T-p54質(zhì)粒模板中PCR擴增該基因，通過T4DNA聚合酶的作用，將末端粘性化的P54基因克隆入pET-52b原核表達載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli BL21(DE3)菌株，挑取單菌落經(jīng)PCR和測序鑒定；陽性克隆以lmmol/L的異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)2h，提取表達產(chǎn)物用SDS-PAGE檢測；用蛋白純化試劑盒(N1-NTA Fast Start Kit, Qiagen公司)純化表達的重組蛋白，Western-blot檢測蛋白的免疫原性，用BAC法測定蛋白濃度，以此純化蛋白作為抗原備用。
[0020](2)動物免疫
[0021]將400 μ g/mL重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化，對23周齡的海蘭蛋雞進行首免，0.5mL/只，即200 μ g/只；分別間隔2周進行二免、三免，免疫原為400 μ g/mL p54純化蛋白與弗氏不完全佐劑等體積乳化后的乳劑，免疫劑量為200 μ g/只；間隔一個月后用不加佐劑的純化蛋白(200 μ g/只)進行第四次加強免疫；第一次免疫后開始收集雞蛋，編號4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0022](3)特異性IgY抗體的提取
[0023]卵黃水提液的制備:將收集的雞蛋以75%酒精消毒，破殼，流出蛋清，收集卵黃，用蒸餾水充分沖洗后在無菌濾紙上滾動，除去殘留的卵白蛋白，刺破卵黃膜，加卵黃液9倍體積pH5.2的蒸餾水稀釋，充分攪勻后4°C靜置過夜(12h)，次日取上清液以12 OOOrpm,4°C離心30min，取上清液備用。
[0024]硫酸銨沉淀法進一步提純:將上述制備的卵黃水提液分別以w/v終濃度為50%、33%的硫酸銨鹽析，4°C靜置過夜；12 000rpm，4°C離心30min，棄上清，沉淀用少量0.01M、PH7.2的PBS溶解，并用透析袋除鹽。
[0025]本發(fā)明進一步提供了基于上述抗ASFVp54蛋白的IgY抗體建立檢測ASF血清抗體的競爭ELISA方法，包括:
[0026]用pH值9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋ASFV-p54蛋白抗原至工作濃度，100 μ L/孔包被酶標(biāo)板(2.5yg/孔蛋白粗提物)，37°C包被2h或4°C過夜，甩干，備用；取酶標(biāo)板，加入1:10稀釋的ASFV陽性豬血清、陰性血清和待檢血清，100 μ L/孔，37°C作用Ih,洗滌液洗板5次；加入一定稀釋度的純化ASFV特異性雞IgY抗體，100 μ L/孔，37°C作用45min，洗滌液洗板5次；加入1:5000稀釋的酶標(biāo)抗體(HRP標(biāo)記的兔抗雞IgY)，100 μ L/孔，37°C作用45min，洗滌液洗板5次；加入底物，100 μ L/孔，室溫避光顯色10分鐘；加終止液終止反應(yīng)，50 μ L/孔，酶標(biāo)檢測儀測0D450的值。
[0027]本發(fā)明以重組ρ54蛋白為抗原免疫雞獲得了特異性的抗ASFV ρ54的IgY抗體，制備的特異性IgY抗體可用于ASF競爭ELISA檢測。與鼠源等動物的抗體相比，IgY物理性質(zhì)穩(wěn)定，具有不激活哺乳動物補體，不結(jié)合哺乳動物Fe受體或細菌，不與類風(fēng)濕因子發(fā)生非特異反應(yīng)，易于保存和運輸?shù)葍?yōu)點，可明顯降低檢測的假陽性率。
[0028]為了更好地理解和實施，下面結(jié)合附圖詳細說明本發(fā)明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1重組表達蛋白的SDS-PAGE鑒定
[0030]其中M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:陰性對照；2:空白對照；3:重組表達蛋白。
[0031]圖2重組表達蛋白的Western-blot分析
[0032]其中M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:大腸桿菌超聲裂解上清對照；2:純化的p54蛋白。
[0033]圖3抗ASFV p54蛋白的IgY抗體消長規(guī)律變化趨勢圖
[0034]圖4純化IgY抗體的SDS-PAGE分析
[0035]其中M:預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，2:純化的IgY抗體。
[0036]圖5純化IgY抗體的Western-blot分析
[0037]其中M:預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化的p54蛋白與IgY的雜交結(jié)果。

【具體實施方式】
[0038]以下實施例是為了進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0039]實施例1:非洲豬瘟病毒p54蛋白的表達和純化
[0040]1.1非洲豬瘟病毒p54蛋白的表達
[0041 ] 根據(jù)PET_52b (+) 3C/LIC質(zhì)粒試劑盒說明，設(shè)計引入特定序列的p54基因的上下游引物，從含有ASFV-p54基因的pMD18-T-p54質(zhì)粒模板中PCR擴增該基因，通過T4DNA聚合酶的作用，將末端粘性化的P54基因(GenBank登錄號:EU874328)克隆入pET_52b原核表達載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli BL21(DE3)菌株，在含100mg/L氨芐青霉素(Amp)的LB平板上培養(yǎng)，挑取單個菌落，接種于2mL含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C，200rpm恒溫搖床振蕩培養(yǎng)至0D600值為0.6左右，加入終濃度為ImM的異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)，誘導(dǎo)培養(yǎng)2h。將上述菌液4°C離心15min，去上清，收集菌體。用PBS重懸沉淀，40C 1000rpm離心15min，去上清。用破菌緩沖液重懸菌體，冰上超聲破碎，4°C離心15min，收集上清和沉淀。將沉淀用細菌細胞蛋白裂解液處理，用變性不連續(xù)的12% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，觀察電泳結(jié)果，光密度掃描分析抗原純度。
[0042]誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示，在分子量大小約為25Ku處出現(xiàn)一條特異性條帶，與理論推測結(jié)果一致，說明含有重組表達載體的大腸桿菌在IPTG的誘導(dǎo)下表達出了目的蛋白。
[0043]1.2非洲豬瘟病毒p54蛋白的純化
[0044]取出甘油菌，在20mL含氨芐青霉素的LB中擴大培養(yǎng)后，取出lmL，4400rpm離心1min,將上清倒掉，用500 μ L新鮮無菌LB重懸菌體。取100mL錐形瓶，加入200mL滅菌含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，將重懸的菌體加入到LB培養(yǎng)液中，370C，225rpm進行擴大培養(yǎng)，當(dāng)菌液的OD值達到1.0左右時加入IPTG誘導(dǎo)表達2h。利用蛋白純化試劑盒(N1-NTA FastStart Kit, Qiagen公司)對表達蛋白進行純化,純化步驟如下:
[0045]I)純化柱準(zhǔn)備:取出純化柱，上下輕輕顛倒幾次，使柱中的樹脂顆粒重懸。將純化柱豎直放置，打開純化柱的蓋子，移去柱子底部的密封帽，使柱中的液體在重力作用下自然過柱。
[0046]2)菌液收集:將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液加入到50mL的離心管中，常溫下4000 X g，離心1min,棄上清,收集菌體。
[0047]3)裂解:將離心好的菌體冰浴15min后，加入1mL native Lysis Buffer重懸菌體。冰浴30min，冰浴期間輕搖離心管2-3次，使菌體懸液混勻。
[0048]4)沉淀:將上述菌體混懸液在4?下，14000 Xg,離心30min,收集上清。
[0049]5)結(jié)合:將上清液加入到純化柱中，讓上清液在重力作用下自然過柱。
[0050]6)洗漆:加入4mL native Wash Buffer到純化柱中，重力作用下過柱,棄洗液。用該洗滌緩沖液重復(fù)洗滌一次。
[0051]7)洗脫:在純化柱下放置新的滅菌15mL離心管,加入2mL Elut1n Buffer,重力作用下過柱，收集洗脫液，此洗脫液即含有純化的表達蛋白。
[0052]用蛋白濃度測定試劑盒(Pierce BCA Protein Assay Kit)測定純化蛋白的濃度，然后保存于_20°C備用。
[0053]1.3 純化 p54 蛋白的 Western-blot 鑒定
[0054]采用Western-blot方法對純化后的蛋白進行抗原性分析,具體步驟如下:
[0055]I)取純化后的蛋白和誘導(dǎo)表達陰性對照細菌超聲裂解液，加入同體積的2 X Loading Buffer,混勻，95°C水浴 1min, 12000rpm 離心 2min,取上清進行 SDS-PAGE。
[0056]2)將處理好的樣品加入12%的膠中進行電泳，2011^，301^11，4011^，211。
[0057]3)轉(zhuǎn)膜:將PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，15V，30min。
[0058]4)封閉:轉(zhuǎn)膜后，將NC膜在轉(zhuǎn)膜緩沖液內(nèi)浸泡5min，轉(zhuǎn)移到TBST洗液中浸泡3min，然后在1% BSA的TBST中，4°C過夜封閉。棄封閉液，用TBST洗膜3次，5min/次。
[0059]5)加陽性血清:將膜浸在1:200稀釋的非洲豬瘟陽性血清中，37°C孵育lh。將膜取出，用TBST洗滌3次，5min/次。
[0060]6)加酶標(biāo)抗體:將膜浸在1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG (Sigma公司)中，37°C孵育Ih。將膜取出，用TBST洗滌3次，5min/次。
[0061]7)底物顯色:將膜浸在DAB顯色液中，室溫避光顯色5min。然后將膜取出，浸在雙蒸水中，觀察結(jié)果。
[0062]結(jié)果如圖2所示，重組表達蛋白p54可以和非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)，陰性對照的蛋白不與非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)，試驗結(jié)果表明原核重組表達的P54蛋白具有很好的抗原性。
[0063]實施例2:p54蛋白特異性IgY抗體的制備
[0064]2.1動物免疫
[0065]實驗動物分組:健康的23周齡待開產(chǎn)的海蘭蛋雞，共12只，隨機分為3組，每組4只。實驗分組如下:A組為p54抗原免疫組；B組為pET-52b (+) 3C/LIC陰性質(zhì)粒抗原對照組；C組為PBS對照組。
[0066]免疫接種程序:
[0067]首免的免疫原為p54抗原和陰性質(zhì)粒抗原分別與等體積的弗氏完全佐劑乳化后的乳化液，二免和三免的免疫原為P54抗原和陰性質(zhì)粒抗原分別與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后的乳化液，四免為不加佐劑的P54抗原和陰性質(zhì)?？乖?。
[0068]⑴A組(p54抗原免疫組):每只雞分別在第0、2、4、8周經(jīng)胸肌三點肌肉注射p54抗原，0.5mL/次，即200 μ g/只。
[0069](2)B組(陰性質(zhì)粒對照組):每只雞分別在第0、2、4、8周經(jīng)胸肌三點肌肉注射經(jīng)BL21誘導(dǎo)后的陰性質(zhì)粒，0.5mL/次，即200 μ g/只。。
[0070](3)C組(PBS空白對照組):每只雞分別在第0、2、4、8周經(jīng)胸肌肌肉注射無菌PBS，0.5mL/ 次。
[0071]收集血清:
[0072]分別于每次免疫前(即0、2、4周)、末次免疫后2周翅靜脈采血，置室溫自然凝固后,剝離血塊,2000rpm離心lOmin，分離血清，100 μ L/管分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0073]收集雞蛋:
[0074]—免后開始收集雞蛋，編號4 C保存?zhèn)溆谩?br> [0075]用間接ELISA方法檢測血清中ASFV_p54蛋白抗體滴度的變化，以推測雞蛋中特異性抗ASFV-p54蛋白的IgY抗體的產(chǎn)生情況。
[0076]2.2特異性IgY抗體的提取
[0077]2.2.1卵黃水提液(WSF)的制備
[0078]采用水稀釋法進行IgY的初步分離:免疫雞所產(chǎn)雞蛋的外殼用清水洗干凈(或用消毒過的濕布擦凈)后，用75%的酒精擦拭，打一小孔，流出蛋清，從小孔內(nèi)加入無菌去離子水，以盡量去除殘留蛋清，重復(fù)3次，盡量去除蛋清，取出卵黃，蒸餾水漂洗，將蛋黃在濾紙上滾動，除掉表面的蛋清，或用濾紙輕輕擦拭卵黃表面，盡可能去除卵黃表面殘余的蛋清，去除卵黃膜得到純的卵黃液(或刺破蛋黃膜，收集蛋黃液)，并量其體積，用蒸餾水稀釋9倍后調(diào)節(jié)pH至5.2，4°C靜置過夜(12h)，次日取其上清液以12 OOOrpm，4°C冷凍離心30min，去除沉淀取其上清液，其中上清液中包含所要提取的IgY，即卵黃水提液(WSF)。
[0079]2.2.2硫酸銨沉淀法進一步提純
[0080]在上述制備的卵黃水提液中滴加等體積飽和硫酸銨溶液使其飽和度達到50%，4°C靜置過夜后，12 OOOrpm, 4°C離心30min，棄上清，離心得到沉淀物。用等體積蒸餾水溶解后滴加飽和硫酸銨溶液使其飽和度達33%，4°C靜置Ih后，12 OOOrpm，4°C離心30min得到沉淀物，沉淀用少量0.01M、pH7.2的PBS溶解，并用透析袋除鹽。
[0081]用蛋白濃度測定試劑盒(Pierce BCA Protein Assay Kit)測定初步提純的IgY濃度，然后保存于_20°C備用。
[0082]2.3卵黃中IgY抗體效價的測定
[0083]采用ELISA方法測定卵黃中特異性IgY抗體的效價變化，具體操作步驟如下:
[0084]I)用pH值9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋ASFV_p54蛋白抗原至工作濃度，100 μ L/孔包被酶標(biāo)板(2.5 μ g/孔蛋白粗提物)，4°C過夜。
[0085]2)取出96孔板，棄去包被液，加入封閉液，37°C溫育2h，用PBST洗滌5次。
[0086]3)用抗體稀釋液(0.1 % BSA的PBST)將雞IgY抗體從1:200開始做倍比稀釋，每孔加入100 μ L，每個樣品做3個重復(fù)，同時設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照，37°C孵育lh，用PBST洗滌5次。
[0087]4)每孔加入100 μ L 1:5000用PBS稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗雞IgY(Sigma公司)，37°C孵育Ih，用PBST洗滌5次。
[0088]5)每孔加入100 μ L已經(jīng)配制好的TMB底物溶液，避光顯色5?15min。
[0089]6)每孔加入50 μ L終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定并記錄各孔0D450值，計算每個樣品的平均值。
[0090]7)結(jié)果判定:陰性對照孔OD450值記為N，陽性對照孔OD450值記為P，若Ρ/Ν彡2.1，且P — N > 0.2，即判定結(jié)果為陽性。
[0091]結(jié)果如圖3顯示，在首免后7d的雞蛋中即可檢測到抗ASFV p54蛋白的特異性IgY抗體，抗體滴度約為1:256，即1:28，而后隨著免疫次數(shù)的增加，抗體滴度也隨之升高，在三免后1d特異性IgY抗體滴度達到最高水平(1:4096，1:212);此后抗體滴度略有下降(1:1024，1:210)，四免后抗體滴度略有升高，接近1:4096，四免后一個月抗體滴度仍維持在該水平。因此采用三免后1d的雞蛋提取并純化特異性的IgY抗體后用于競爭ELISA檢測的研究。
[0092]2.4特異性IgY抗體的鑒定
[0093]采用SDS-PAGE方法分析提純的IgY抗體的純度，結(jié)果如圖4所示，還原后的IgY抗體電泳可見2條帶，相對分子質(zhì)量約為68Ku和25Ku，分別為IgY的重鏈和輕鏈。
[0094]采用Western-blot方法對初步提純后的特異性IgY抗體進行免疫原性分析，具體步驟參見實施例1中的1.3 (純化p54蛋白的Western-blot鑒定),只需將一抗更換為特異性IgY抗體，二抗更換為HRP標(biāo)記羊抗雞IgY即可。
[0095]Western-blot結(jié)果顯示(圖4),制備的特異性IgY抗體可與表達的p54蛋白反應(yīng)，在大小約為25Ku處形成特異性的反應(yīng)條帶，結(jié)果表明制備的IgY抗體是特異性針對ASFVP54蛋白的，且具有免疫活性，可用于后續(xù)的非洲豬瘟抗體的競爭ELISA檢測的研究。
[0096]實施例3:p54蛋白特異性IgY抗體在檢測非洲豬瘟抗體競爭ELISA中的應(yīng)用
[0097]利用原核表達的P54蛋白和特異性抗ASFV-p54蛋白的IgY多抗建立了檢測非洲豬瘟抗體的競爭ELISA方法，具體步驟如下:
[0098]I)用pH值9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋ASFV_p54蛋白抗原至工作濃度，100 μ L/孔包被酶標(biāo)板(2.5 μ g/孔蛋白粗提物)，4°C過夜。
[0099]2)取出96孔板，棄去包被液，加入封閉液，37°C溫育2h，PBST洗滌5次。
[0100]3)加入1:10稀釋的ASFV陽性豬血清、陰性血清和待檢血清，100 μ L/孔，37°C作用Ih，PBST洗滌5次。
[0101]4)加入1:400稀釋的純化ASFV特異性雞IgY抗體，100 μ L/孔，37°C作用45min，PBST洗滌5次。
[0102]5)每孔加入10yL 1:5000用PBS稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗雞IgY，37°C孵育45min，用PBST洗滌5次。
[0103]6)每孔加入100 μ L已經(jīng)配制好的TMB底物溶液，避光顯色lOmin。
[0104]7)每孔加入50 μ L終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定并記錄各孔0D450值。
[0105]8)結(jié)果判定:用該ELISA檢測60份健康豬血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清測定0D450值，計算抑制百分率:抑制率ΡΙ(% ) = [1-(檢測樣品0D450+標(biāo)準(zhǔn)陰性0D450) ] X 100%。計算檢測樣品的平均抑制率(ΡΙ’ )和標(biāo)準(zhǔn)偏差(S)。若待檢樣品PI >PI’ +3s，則判定為陽性，pi < Pr +3s，則判定為陰性。
[0106]競爭ELISA結(jié)果顯示，該方法除了對非洲豬瘟陽性血清檢測結(jié)果為陽性外，對豬傳染性胸膜肺炎陽性血清、豬瘟陽性血清、豬偽狂犬病陽性血清、豬口蹄疫陽性血清及豬藍耳病陽性血清的檢測結(jié)果均為陰性，與商品化ASFV抗體檢測ELISA試劑盒的平行檢測結(jié)果一致，說明特異性的IgY抗體可用于競爭ELISA方法檢測ASF抗體。
[0107]本發(fā)明未涉及部分均與現(xiàn)有技術(shù)相同或可采用現(xiàn)有技術(shù)加以實現(xiàn)。
[0108]以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種抗非洲豬瘟病毒P54蛋白的特異性IgY抗體的制備方法，包括以下步驟: (1)將非洲豬瘟病毒P54蛋白基因連接在原核表達載體pET-52b(+) 3C/LIC上，將所述表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，并誘導(dǎo)其表達，獲得所述非洲豬瘟病毒重組p54蛋白抗原； (2)應(yīng)用(I)所述重組p54抗原免疫產(chǎn)蛋雞；所述免疫產(chǎn)蛋雞的方法如下:第一次免疫:將免疫抗原與等量弗氏完全佐劑乳化，抗原免疫劑量為200 μ g/只； 第二次免疫:第一次免疫后14d，將免疫抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，抗原免疫劑量為200 μ g/只； 第三次免疫:第二次免疫后14d，將免疫抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，抗原免疫劑量為200 μ g/只； 第四次免疫:第三次免疫后30d，直接注射免疫抗原，不使用佐劑，抗原免疫劑量為200 μ g/ 只； (3)收集雞蛋，分離蛋黃，提取卵黃免疫球蛋白，所述卵黃免疫球蛋白中即含有特異性的抗非洲豬瘟病毒P54蛋白的IgY抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備獲得的抗非洲豬瘟病毒P54蛋白的特異性IgY抗體。
3.權(quán)利要求2所述的抗非洲豬瘟病毒p54蛋白在檢測非洲豬瘟病毒抗體的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/569GK104262484SQ201410553923
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】張彩虹, 花群義, 劉建利, 曹琛福, 陶虹, 宗卉, 楊俊興, 呂建強, 高又文, 孫潔, 曾少靈, 廖立珊, 唐金明, 黃超華 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心