基于氧化石墨烯、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于氧化石墨烯、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極及其制備方法和應(yīng)用,所述電極由氧化石墨烯、金納米管和鎖核酸探針修飾的金電極和信號放大探針組成,以該電極為工作電極、鉑電極為對電極、飽和甘汞電極為參比電極、含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的PBS溶液為測試底液組建電化學(xué)生物傳感器,可以快速、特異、靈敏地檢測NDM-1基因,為多重耐藥菌的檢測提供簡單、快速、靈敏、特異的工具,具有較好的市場價(jià)值。
【專利說明】基于氧化石墨婦、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極及其 制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于電化學(xué)檢測領(lǐng)域,具體涉及基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸 (locked nucleic acid, LNA)探針修飾的電極,還涉及該電極的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] NDM-I多重耐藥菌是指攜帶NDM-I耐藥基因的細(xì)菌,屬于革蘭陰性耐藥菌。NDM-I 全稱是"新德里金屬-目-內(nèi)醜胺酶",是1種高效耐藥酶。研究顯示,目前多重耐藥菌正在 全球快速傳播,并且已經(jīng)在人類重要的致病菌志賀氏菌中發(fā)現(xiàn)了 NDM-1。攜帶NDM-I耐藥基 因的細(xì)菌可W通過飲水等途徑傳染,表現(xiàn)癥狀為腸道感染,該類細(xì)菌對幾乎所有抗生素都 具有抗藥性,患者感染后死亡高??股貫E用是NDM-I出現(xiàn)的首要原因,NDM-I是一種新的 超級耐藥基因,可W在細(xì)菌之間傳播,從而使對抗生素敏感的細(xì)菌獲得耐藥性,快速上升的 耐藥性和新的抗菌藥物開發(fā)的缺乏,預(yù)示了全球NDM-I多重耐藥菌防控形勢極為嚴(yán)峻。因 此,研發(fā)NDM-I直接快速特異的檢測方法,對NDM-I基因的精確檢測及有效切斷多重耐藥菌 的傳播鏈均具有非常重要的意義。
[0003] 目前,NDM-I多重耐藥菌的診斷主要包括篩查、表型確認(rèn)和基因確證等3個(gè)步驟。 表型篩查是在細(xì)菌藥物敏感性測定中,W美洛培南或亞胺培南紙片法化-B法)或最低抑菌 濃度0OC)測定法對腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)酶情況進(jìn)行初步篩查;表型確認(rèn)是采用雙紙片協(xié)同實(shí) 驗(yàn)或亞胺培南(美洛培南)/邸TA復(fù)合紙片,進(jìn)行K-B法藥敏試驗(yàn)來判定產(chǎn)金屬酶;基因確 證是采用NDM-I的基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測序,確定菌株是否攜帶NDM-I基因。 但該些診斷方法存在著費(fèi)時(shí)煩瑣、敏感性和特異性較低及檢測成本高等缺陷。
[0004] 電化學(xué)DNA生物傳感器具有分析時(shí)間短、設(shè)備微型化、靈敏度高、檢測限低、使用 簡單W及成本低廉等著優(yōu)點(diǎn)。特異性和靈敏是評價(jià)傳感器檢測性能的重要指標(biāo),目前研究 報(bào)道的傳感器表面固定的大多是DNA探針,其缺點(diǎn)是靈敏度不高和特異性不強(qiáng)。由于DNA探 針與較長的祀序列雜交時(shí)結(jié)合力較弱常導(dǎo)致堿基錯(cuò)配,因而DNA探針的特異性相對較低。 另外,由于單鏈DNA無法與未解旋的雙鏈祀序列直接結(jié)合,所W待檢測的標(biāo)本需經(jīng)PCR擴(kuò)增 后才能與之結(jié)合,而DNA的新型人工模擬物鎖核酸可W完美解決上述問題。LNA是一種新型 寡核巧酸衍生物,具有超強(qiáng)的剛性的縮合結(jié)構(gòu),W及與DNA/RNA的強(qiáng)大雜交親和力、卓越的 堿基錯(cuò)配識別能力等優(yōu)勢。
[0005] 新型納米材料石墨帰和金納米管是良好的電極修飾材料。石墨帰是由一層碳原子 構(gòu)成的石墨薄片,其碳原子間靠共價(jià)鍵相連,是目前發(fā)現(xiàn)的最薄的二維材料。金納米管能有 效提高電子傳輸效率,具有良好的生物兼容性、導(dǎo)電性和極超強(qiáng)的生物分子吸附能力。金納 米管可有效保持生物分子的生物活性,可使修飾電極表面吸附更多的LNA的探針,從而進(jìn) 一步放大微小的電化學(xué)信號。石墨帰和金納米管的有機(jī)結(jié)合,具有比表面積高、導(dǎo)電性能 好、機(jī)械強(qiáng)度高、易于修飾、功能化等獨(dú)特的理化性質(zhì)。
[0006] 利用DNA人工模擬物鎖核酸的高特異性,針對NDM-I全基因組,設(shè)計(jì)NDM-I的特異 性LNA探針,將LNA探針與自主合成的納米材料氧化石墨帰和金納米管通過優(yōu)化配比固定 于電化學(xué)傳感器表面,創(chuàng)建了一種新型的電化學(xué)生物傳感器,用于NDM-I耐藥基因的快速 特異檢測,具有重要的市場價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 有鑒于此,本發(fā)明的目的之一在于提供基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針 修飾的電極;本發(fā)明的目的之二在于提供基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的 電極的制備方法;本發(fā)明的目的之H在于含有上述電極的電化學(xué)生物傳感器;本發(fā)明的目 的之四在于提供基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極或所述電化學(xué)傳感器 的應(yīng)用;本發(fā)明的目的之五是利用所述檢測NDM-I的電化學(xué)生物傳感器檢測NDM-I基因的 方法。
[000引為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0009] 1、基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極,所述電極由氧化石墨帰、 金納米管和鎖核酸探針修飾的金電極和信號放大探針組成;所述氧化石墨帰、金納米管和 鎖核酸探針修飾的金電極是在金電極表面依次修飾氧化石墨帰氧化鋒溶膠-凝膠復(fù)合物、 金納米管W及鎖核酸探針,最后封閉非特異性吸附位點(diǎn)而得,所述信號放大探針為游離的 金納米管和鎖核酸探針通過琉基結(jié)合形成的復(fù)合物,所述鎖核酸探針特異識別NDM-I基 因。
[0010] 優(yōu)選的,所述鎖核酸探針的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 2、所述基于氧化石墨帰、金納米管W及鎖核酸探針修飾的電極的制備方法,包括 如下步驟:
[0012] (1)制備氧化石墨帰氧化鋒溶膠-凝膠復(fù)合物;取氧化石墨帰用水溶解后,超聲制 備成氧化石墨帰息浮液,然后與氧化鋒溶膠-凝膠和無水己醇混勻,制備成氧化石墨帰化0 溶膠-凝膠復(fù)合物;
[001引似預(yù)處理電極;將金電極打磨,拋光,清潔,干燥,得預(yù)處理的電極,備用;
[0014] (3)修飾電極;將步驟(1)制備的氧化石墨帰ZnO凝膠-凝膠復(fù)合物滴涂于步驟 (2)所得預(yù)處理的電極表面,瞭干后,浸入金納米管溶液中,然后清洗,再在金納米管修飾的 電極表面滴加含鎖核酸探針的溶液,固定后清洗,最后用琉基己醇溶液封閉非特異性吸附 位點(diǎn),制備成氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的金電極;
[0015] (4)制備信號放大探針;將鎖核酸探針加入到金納米管溶液中,振蕩混勻、充分反 應(yīng),然后將反應(yīng)液離也,收集沉淀物,沉淀物用PBS洗涂后再離也,得信號放大探針溶于PBS 溶液中,保存?zhèn)溆谩?br>
[0016] 優(yōu)選的,所述步驟(1)中,氧化石墨帰息浮液的濃度為Img/ml,氧化石墨帰息浮 液、氧化鋒溶膠-凝膠和無水己醇的體積比為3:1: 2。
[0017] 優(yōu)選的,所述步驟(2)是將金電極分別用0. 3 U m、0. 05 U m的Al2〇3粉末打磨拋光, 每次打磨后用水洗凈,再分別于硝酸、丙麗和水中各超聲洗涂,干燥,備用。
[0018] 優(yōu)選的,所述步驟(3)中,將步驟(1)制備的氧化石墨帰化0凝膠-凝膠復(fù)合物滴 涂于步驟(2)所得預(yù)處理的電極表面,瞭干后,浸入金納米管溶液中浸泡2小時(shí),然后清洗, 再在金納米管修飾的電極表面滴加濃度為1. 5 y mol/L的鎖核酸溶液,固定后清洗,最后用 Immol/L的琉基己醇溶液封閉非特異性吸附位點(diǎn),制備成氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探 針修飾的金電極。
[0019] 優(yōu)選的,所述步驟(4)中,將lOmmol/L鎖核酸探針按體積比為6 ;50加入到金納米 管溶液中,混勻20小時(shí)、充分反應(yīng),然后將反應(yīng)液在4C、15(K)巧m條件下離也20min,收集沉 淀物,沉淀物用PBS洗涂后再離也,得信號放大探針,溶于PBS溶液中,保存?zhèn)溆谩?br>
[0020] 3、檢測NDM-I的電化學(xué)生物傳感器,包括工作電極、對電極、參比電極和測試底 液;所述工作電極為權(quán)利要求1或2所述基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的 電極,所述對電極為笛電極,所述參比電極為飽和甘隸電極,所述測試底液為抑7. 4的含 2mmol/LK3化(CN) e/K/e (CN) 6 和 Smmo化Cl 的 PBS 溶液。
[0021] 4、所述基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極或檢測NDM-I的電化 學(xué)生物傳感器在檢測NDM-I基因中的應(yīng)用。
[0022] 5、利用所述檢測NDM-I的電化學(xué)生物傳感器檢測NDM-I基因的方法,包括如下步 驟;將基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極與樣品溶液雜交后,然后W基于 氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極為工作電極,笛電極為對電極,飽和甘隸電 極為參比電極,pH 7. 4的含2mmol/L Ks化(CN) e-K4Fe (CN) e和5mmol/L KCl的PBS溶液為測 試底液構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器,采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測定,電位掃描范圍為-0. 3V? 0. 7V,電位掃描速率為50mv/s,根據(jù)雜交前后峰電流變化檢測NDM-I基因濃度。
[0023] 本發(fā)明的有益效果在于;本發(fā)明利用鎖核酸(LNA)的高特異性,然后結(jié)合石墨帰 和金納米管材料的理化優(yōu)勢,制備氧化石墨帰、金納米管W及鎖核酸修飾的電極,同時(shí)將鎖 核酸和金納米管通過琉基結(jié)合形成的復(fù)合物加入反應(yīng)體系作為游離狀態(tài)的信號放大探針, 再與電化學(xué)技術(shù)相融合獲得檢測NDM-I基因的電化學(xué)生物傳感器,從而構(gòu)建檢測NDM-I基 因的平臺,為臨床藥物和食品中潛在超級細(xì)菌的檢測提供簡單、快速、靈敏、特異、高通量的 工具。同時(shí)本發(fā)明通過將電化學(xué)領(lǐng)域的檢測手段引入到生物醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域,并探索了石墨帰、 金納米管和LNA電化學(xué)生物傳感器在液相中的響應(yīng)機(jī)理,為電化學(xué)生物傳感器在生物醫(yī)學(xué) 檢測中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚,本發(fā)明提供如下附圖:
[0025] 圖1為不同修飾電極的循環(huán)伏安圖。a ;氧化石墨帰化0溶膠-凝膠和金納米管 修飾電極;b ;氧化石墨帰化0溶膠-凝膠、金納米管和鎖核酸探針;C ;琉基己醇封閉氧化石 墨帰ZnO溶膠-凝膠、金納米管和鎖核酸探針修飾電極;d ;裸電極;e ;氧化石墨帰ZnO溶 膠-凝膠修飾電極;f ;琉基己醇封閉氧化石墨帰化0溶膠-凝膠、金納米管和鎖核酸探針修 飾電極檢測NDM-I。
[0026] 圖2為不同檢測物質(zhì)對傳感器響應(yīng)電流的影響。
[0027] 圖3為電化學(xué)生物傳感器檢測NDM-I的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面將結(jié)合附圖,對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0029] 本發(fā)明利用鎖核酸(LNA)的高特異性,針對NDM-I全基因組,設(shè)計(jì)一條與NDM-I互 補(bǔ)的特異性鎖核酸探針,鎖核酸探針的序列為;5' -SH- (CHg) e-gcttttggtggctgcctgat-3' (S H代表琉基基團(tuán),下劃線部分堿基經(jīng)鎖核酸修飾)(SEQ ID NO. 1),首先將該探針固定在電極 表面作為固相捕獲探針,其次將該探針加入反應(yīng)體系作為游離狀態(tài)的信號放大探針。上述 探針的5'端均修飾有琉基,并且與目標(biāo)基因的部分序列相互補(bǔ),然后結(jié)合石墨帰和金納米 管材料的理化優(yōu)勢,利用電化學(xué)方法創(chuàng)建了一種用于檢測NDM-I的基于氧化石墨帰、金納 米管、鎖核酸修飾的電極。制備方法是;首先在電極表面靜電吸附一層氧化石墨帰ZnO溶 膠-凝膠,再通過電沉積將金納米管沉積到電極表面,然后再利用金納米管具有極超強(qiáng)的 生物分子吸附能力將鎖核酸探針固定于電極表面,當(dāng)在溶液中含有目標(biāo)基因時(shí),捕獲探針 和信號放大探針分別與其對應(yīng)的互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交,此時(shí)信號放大探針5'端標(biāo)記有琉基可 通過Au-S鍵的化學(xué)鍵將雜交液中的金納米管結(jié)合到電極表面,形成"H明治"結(jié)構(gòu)的核酸 雜交復(fù)合物,形成的雜交復(fù)合物在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng),從而產(chǎn)生電化學(xué)信號,將組 裝好的生物傳感器置于抑7. 4的含2mmol/L K3[Fe(CN)e]/K4[Fe(CN)e]和5mmol/l KCl的 PBS溶液,利用循環(huán)伏安法表征修飾電極的電化學(xué)行為。如果檢測液中含有錯(cuò)配序列,鎖核 酸探針不能和序列很好的形成明治"結(jié)構(gòu)的雜交復(fù)合物,幾乎不產(chǎn)生電化學(xué)信號。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極的制備方法,包括如下氧化 石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾金電極和制備信號放大探針步驟:
[0032] (1)氧化石墨帰ZnO溶膠-凝膠復(fù)合物的制備;稱取0. OOlg氧化石墨帰于小燒杯 中,加入ImL的超純水,然后置于超聲儀中超聲制備成氧化石墨帰息浮液,取90 y L氧化石 墨帰息浮液、30 y L ZnO溶膠-凝膠和60 y L無水己醇混勻,制備成氧化石墨帰化0溶膠-凝 膠混合液,置4C避光保存?zhèn)溆茫?br>
[003引 似預(yù)處理的電極;取電極分別用0. 3 y m、0. 05 y m的AI2O3粉末打磨拋光成鏡面, 每次打磨后均用超純水沖洗,再分別于硝酸、丙麗及超純水中各超聲洗涂5min,干燥,得預(yù) 處理的電極,備用;
[0034] (3)制備基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的金電極,取20 UL步驟 (1)制備的氧化石墨帰ZnO凝膠-凝膠復(fù)合物滴涂于經(jīng)預(yù)處理的電極表面,室溫瞭干后,將 該修飾電極浸入金納米管溶液中浸泡化,用超純水清洗后,將20 y L濃度為1. 5 y mol/L的 鎖核酸探針固定于上述方法處理的電極表面,放置于4C冰箱中10小時(shí),取出用超純水清 洗,最后將修飾電極浸入ImmoVL琉基己醇溶液于37C封閉電極表面的非特異性附位點(diǎn)1 小時(shí),制備成氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極,制成的氧化石墨帰、金納米 管和鎖核酸探針修飾的電極不用時(shí)息置于PBS溶液中,4C下儲存;
[0035] (4)制備金納米管和鎖核酸探針復(fù)合物組成的信號放大探針:將60 U 1 lOmmol/L 鎖核酸探針加入到500 y 1金納米管溶液中,避光室溫下振蕩混勻24小時(shí);反應(yīng)完成后,將 反應(yīng)液在4°C、150化pm條件下離也20min,取沉淀物,用PBS液洗涂2次,再離也,得信號放 大探針,將修飾好的信號放大探針溶于400 y 1 PBS (pH7. 4,0. Imol/L PBS溶液)溶液中,置 4C避光保存?zhèn)溆谩?br>
[0036] 實(shí)施例2、組建電化學(xué)生物傳感器
[0037] W氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極作為工作電極,飽和甘隸電極 為參比電極,笛電極作為對電極,組建電化學(xué)生物傳感器。將組建的電化學(xué)生物傳感器連入 電化學(xué)工作站,于抑7. 4的含2mmol/L吃化(CN) e/K4Fe (CN) e和5mmo化Cl的PBS中進(jìn)行循環(huán) 伏安掃描,工作電位為-0. 3V?0. 7V,掃描速度為50mV/s。
[0038] 雜交反應(yīng);將氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的金電極浸入到在150 y 1 不同濃度的 NDM-I 祀序列溶液中(1〇-> g/L,IQ-S y g/L,1〇-4 y g/L,1〇-3 y g/L,1〇-2 y g/L, IO4 y g/L,I. 0 y g/L,1〇1,IO2 y g/L),再將信號放大探針加入到此反應(yīng)體系中,于37。直溫 雜交45分鐘。利用待測NDM-I祀序列的橋聯(lián)作用,可成功的將氧化石墨帰/ZnO凝膠凝膠 /金納米管修飾電極與信號放大探針連接到一起,形成明治型"結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)痕量NDM-I的 快速精確檢測。雜交過程中傳感器采用H電極體系測量電流變化。
[0039] 上述電化學(xué)生物傳感器檢測NDM-I的原理為:通過電極表面的鎖核酸探針與 NDM-I祀序列發(fā)生核酸雜交反應(yīng),生成的雜交復(fù)合物阻礙了電極表面的電子傳遞,使傳感器 響應(yīng)電流變化值增大。該信號變化的大小AI與發(fā)生在電極表面核酸雜交反應(yīng)進(jìn)行的程 度有關(guān),AI值越大,表明與電極表面固定的LNA探針結(jié)合的檢測物的量越多。用制備好的 LNA探針修飾的電極測定的初始還原峰電流記為I。;當(dāng)核酸雜交反應(yīng)結(jié)束后,W測定的還原 峰電流并記為I ;則峰電流在核酸雜交反應(yīng)前后變化AI = I - I。。
[0040] 實(shí)施例3、基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針的分步表征
[0041] 利用循環(huán)伏安法表征電極在修飾及檢測過程中的電化學(xué)特性,具體檢測方法為: 將修飾電極浸入到150 U L濃度為100 U g/L的NDM-I祀序列溶液中,然后向反應(yīng)體系中加 入鎖核酸探針溶液,于37C恒溫雜交45分鐘,雜交過程中傳感器采用H電極體系測量電流 變化,獲得不同電極在抑7. 4 含 2mmol/L K3[Fe(CN)e]/K4[Fe(CN)e]和 5mmol/l KCl 的 PBS 溶液中的循環(huán)伏安曲線(CV)圖,如圖1所示。
[0042] 圖1中,曲線a為氧化石墨帰ZnO溶膠-凝膠和金納米管修飾電極在pH7. 4含有 2mmol/LK3[Fe(CN)e]/K4[Fe(CN)e]和5mmol/l KCl的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線,由于金納 米管具有良好的導(dǎo)電性,能夠更好的促進(jìn)電極表面的電子傳遞,所W在電極表面再修飾金 納米管時(shí)氧化還原峰的峰電流明顯增大,界面峰電流值最大;曲線b是氧化石墨帰ZnO溶 膠-凝膠、金納米管和鎖核酸探針的循環(huán)伏安曲線,鎖核酸探針固定電極表面之后,由于鎖 核酸的磯酸骨架帶負(fù)電荷,溶液中的[Fe (CN) 6]3-同樣帶有負(fù)電荷,同種電荷相排斥,導(dǎo)致 [Fe(CN)6]3-的電子在金電極表面?zhèn)鬟f速度減慢,在一定程度上阻礙了溶液中導(dǎo)電離子在電 極表面的電子傳遞,因此氧化還原峰的峰電流值有所降低;當(dāng)鎖核酸探針修飾電極后,為了 防止鎖核酸探針"倒伏"在電極表面而出現(xiàn)非特異吸附,采用琉基己醇來封閉非特異性吸附 位點(diǎn);曲線C為琉基己醇封閉氧化石墨帰ZnO溶膠-凝膠、金納米管和鎖核酸探針修飾電 極,琉基己醇在封閉非特異性吸附位點(diǎn)的同時(shí)也阻礙了電子的傳輸,所W峰電流值也進(jìn)一 步有所減?。磺€d為裸金電極在抑7.4含有2mmol/L K3[Fe(CN)e]/K4[Fe(CN)J和5mmol/ I KCl的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線,出現(xiàn)了一對準(zhǔn)可逆的氧化還原峰;曲線e為氧化石墨 帰 ZnO 溶膠-凝膠修飾電極在抑7. 4 含 2mmol/L Ks [Fe (CN) e] /? [Fe (CN) e]和 5mmol/l KCl 的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線,由于氧化石墨帰含有大量的含氧官能團(tuán)如-COOH,導(dǎo)電性能 差,阻礙了電子傳遞,及氧化石墨帰電極表面的負(fù)電荷排斥鐵氯化物和亞鐵氯化物離子通 過電荷傳遞達(dá)到電極表面,此外,ZnO凝膠-凝膠薄膜在一定程度上液阻礙了溶液中導(dǎo)電離 子再電極上的電子傳遞,因此峰電流值明顯降低;曲線f為琉基己醇封閉氧化石墨帰化0溶 膠-凝膠、金納米管和鎖核酸探針修飾電極與含有IOOy g/L NDM-I的溶液反應(yīng)的循環(huán)伏安 曲線,由于電極表面的核酸雜交復(fù)合物是沒有電活性的生物大分子,進(jìn)一步阻礙了電極表 面的電子傳輸,與曲線C相比,氧化還原峰的峰電流在賠育前后響應(yīng)電流大幅降低。W上不 同修飾電極的電化學(xué)表征,表明基于氧化石墨帰、金納米管、鎖核酸探針修飾的電極能夠檢 測NDM-I祀序列,并且組建的電化學(xué)生物傳感器也能檢測NDM-I祀序列。
[0043] 實(shí)施例4、檢測NDM-I的電化學(xué)生物傳感器的靈敏度和特異性
[0044] (1)電化學(xué)生物傳感器的特異性
[0045] 將基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極分別與W下溶液共賠育30 分鐘;溶液①含有100 y g/L NDM-I標(biāo)準(zhǔn)品;溶液②含有100 U g/L NDM-I標(biāo)準(zhǔn)品及干擾物質(zhì) (Img/L大腸桿菌、金黃色葡萄球菌);③只含有干擾物質(zhì)(Img/L大腸桿菌、金黃色葡萄球 菌);④空白(PBS溶液)。賠育完成后,將基于氧化石墨帰/金納米管/鎖核酸探針修飾的電 極與笛電極、飽和參比電極構(gòu)建成電化學(xué)生物傳感器,W抑7. 4含有2mmol/L Ks [Fe (CN) e] / KJFe(CN) J和5mmol/l KCl的PBS溶液為測試底液,在室溫下采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描 測定,電位掃描范圍為-0. 3V?0. 7V,電位掃描速率為50mv/s,分別記錄響應(yīng)電流值,并將 所得峰電流值進(jìn)行比較,評價(jià)電化學(xué)生物傳感器的特異性,評價(jià)結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯 示,在溶液①及溶液②中賠育的電極在賠育前后響應(yīng)電流變化值(Al)分別為42.9UA和 39. 3 y A,而在僅含有干擾物質(zhì)的溶液③和空白溶液④中賠育的電極在賠育前后響應(yīng)電流 基本保持不變。上述結(jié)果表明,本發(fā)明構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器抗干擾能力強(qiáng),對NDM-I具 有良好的選擇性,并能對NDM-I進(jìn)行精確檢測。
[0046] (2)電化學(xué)生物傳感器的靈敏度
[0047] 用檢測一個(gè)周期的基于氧化石墨帰、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極再檢測 終濃度分別為 10-6 y g/L,10-5 y g/L,IQ-4U g/L,10-3 y g/L,10-2 y g/L,10-1 y g/L,1. Oil g/L, l〇i y g/L,l〇2 y g/L的NDM-I濃度,操作步驟相同。檢測祀序列溶液進(jìn)行雜交反應(yīng)所引起 的電流響應(yīng)差值A(chǔ) I及反應(yīng)所需時(shí)間,并對響應(yīng)電流變化差值A(chǔ) I與NDM-I濃度做線性回 歸,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值,結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在雜交反應(yīng)初始階段,隨著 NDM-I濃度從1(TV g/L增加到IOOy g/l,雜交反應(yīng)引起的相位變化值呈先上升后趨于飽和 的曲線方式,且W IO2U g/LNDM-1濃度為飽和點(diǎn)。并且NDM-I濃度在1(TV g/L?IO2U g/ L的范圍內(nèi)時(shí),其濃度的對數(shù)值與峰電流呈良好的線性關(guān)系。其中線性回歸方程為;y = 5. 3015X+31. 662,相關(guān)系數(shù)為0. 9916。該是由于在NDM-I濃度逐漸升高的過程中,電極表面 固定的特異性LNA探針也逐漸結(jié)合上更多的NDM-1,從而引起了更大的響應(yīng)電流變化值,當(dāng) NDM-I濃度升高至1〇2 y g/L時(shí),電極表面固定的特異性探針與NDM-I的結(jié)合已全部飽和,因 此當(dāng)繼續(xù)增加NDM-I濃度時(shí),已經(jīng)無法引起更大的響應(yīng)電流變化值。同樣,當(dāng)NDM-I濃度低 于1(TV g/L時(shí),由于電極表面固定的特異性探針無法結(jié)合到足夠數(shù)量的NDM-I而無法進(jìn)行 精確檢測。W上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本發(fā)明組建的電化學(xué)生物傳感器具有較寬的線性范圍和較 低的檢測限。
[0048] 最后說明的是,W上優(yōu)選實(shí)施例僅用W說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制,盡管通 過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述,但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,可W在 形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變,而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 基于氧化石墨烯、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極,其特征在于:所述電極由氧 化石墨烯、金納米管和鎖核酸探針修飾的金電極和信號放大探針組成;所述氧化石墨烯、金 納米管和鎖核酸探針修飾的金電極是在金電極表面依次修飾氧化石墨烯氧化鋅溶膠-凝 膠復(fù)合物、金納米管以及鎖核酸探針,最后封閉非特異性吸附位點(diǎn)而得,所述信號放大探針 為游離的金納米管和鎖核酸探針通過巰基結(jié)合形成的復(fù)合物,所述鎖核酸探針特異識別 NDM-1基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于氧化石墨烯、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極,其特征 在于:所述鎖核酸探針的序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述基于氧化石墨烯、金納米管以及鎖核酸探針修飾的電極的制備 方法,其特征在于,包括如下步驟: (1) 制備氧化石墨烯氧化鋅溶膠-凝膠復(fù)合物:取氧化石墨烯用水溶解后,超聲制備成 氧化石墨烯懸浮液,然后與氧化鋅溶膠-凝膠和無水乙醇混勻,制備成氧化石墨烯ZnO溶 膠-凝膠復(fù)合物; (2) 預(yù)處理電極:將金電極打磨,拋光,清潔,干燥,得預(yù)處理的電極,備用; (3) 修飾電極:將步驟(1)制備的氧化石墨烯ZnO凝膠-凝膠復(fù)合物滴涂于步驟(2)所 得預(yù)處理的電極表面,晾干后,浸入金納米管溶液中,然后清洗,再在金納米管修飾的電極 表面滴加含鎖核酸探針的溶液,固定后清洗,最后用巰基己醇溶液封閉非特異性吸附位點(diǎn), 制備成氧化石墨烯、金納米管和鎖核酸探針修飾的金電極; (4) 制備信號放大探針:將鎖核酸探針加入到金納米管溶液中,振蕩混勻、充分反應(yīng), 然后將反應(yīng)液離心,收集沉淀物,沉淀物用PBS洗滌后再離心,得信號放大探針,溶于PBS溶 液中,保存?zhèn)溆谩?br>
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于:所述步驟(1)中,氧化石墨烯懸浮液 的濃度為lmg/ml,氧化石墨烯懸浮液、氧化鋅溶膠-凝膠和無水乙醇的體積比為3:1:2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于:所述步驟(2)是將金電極分別用 0. 3 μ m、0. 05 μ m的A1203粉末打磨拋光,每次打磨后用水洗凈,再分別于硝酸、丙酮和水中 各超聲洗滌,干燥,備用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于:所述步驟(3)中,將步驟(1)制備的 氧化石墨烯ZnO凝膠-凝膠復(fù)合物滴涂于步驟(2)所得預(yù)處理的電極表面,晾干后,浸入金 納米管溶液中浸泡2小時(shí),然后清洗,再在金納米管修飾的電極表面滴加濃度為1. 5 μ mol/ L的鎖核酸溶液,固定后清洗,最后用lmmol/L的巰基己醇溶液封閉非特異性吸附位點(diǎn),制 備成氧化石墨烯、金納米管和鎖核酸探針修飾的金電極。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于:所述步驟⑷中,將10mm〇l/L鎖核 酸探針按體積比為6 :50加入到金納米管溶液中,振蕩混勻24小時(shí)、充分反應(yīng),然后將反應(yīng) 液在4°C、1500rpm條件下離心20min,收集沉淀物,沉淀物用PBS洗滌后再離心,得信號放大 探針,溶于PBS溶液中,保存?zhèn)溆谩?br>
8. 檢測NDM-1的電化學(xué)生物傳感器,其特征在于:包括工作電極、對電極、參比電極和 測試底液;所述工作電極為權(quán)利要求1或2所述基于氧化石墨烯、金納米管和鎖核酸探針修 飾的電極,所述對電極為鉬電極,所述參比電極為飽和甘汞電極,所述測試底液為PH7. 4的 含 2mmol/L K3Fe (CN) 6/K4Fe (CN) 6 和 5mmolKCl 的 PBS 溶液。
9. 權(quán)利要求1?2任一項(xiàng)所述基于氧化石墨烯、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極或 權(quán)利要求8所述檢測NDM-1的電化學(xué)生物傳感器在檢測NDM-1基因中的應(yīng)用。
10. 利用權(quán)利要求8所述檢測NDM-1的電化學(xué)生物傳感器檢測NDM-1基因的方法,其特 征在于,包括如下步驟:將基于氧化石墨烯、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極與樣品溶液 雜交后,然后以基于氧化石墨烯、金納米管和鎖核酸探針修飾的電極為工作電極,鉬電極為 對電極,飽和甘汞電極為參比電極,pH 7. 4的含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KC1的PBS溶液為測試底液構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器,采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測定,電位掃 描范圍為-0. 3V?0. 7V,電位掃描速率為50mv/s,根據(jù)雜交前后峰電流變化檢測NDM-1基 因濃度。
【文檔編號】G01N27/48GK104237352SQ201410557116
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】王云霞, 張立群, 府偉靈 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院