膜透析-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定畜產(chǎn)品中多種β-受體興奮劑殘留的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于化學(xué)分析領(lǐng)域，涉及膜透析-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定畜產(chǎn)品中多種β-受體興奮劑殘留的方法。本發(fā)明根據(jù)待測(cè)物的分子量和膜的截留分子量(MWCO)，用膜透析技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行前處理，將大分子物質(zhì)截留在透析袋內(nèi)，目標(biāo)化合物通過透析滲入透析液中，選用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑對(duì)透析液中的藥物殘留進(jìn)行萃取，應(yīng)用膜透析技術(shù)建立了一種同時(shí)測(cè)定畜產(chǎn)品中18種β-受體興奮劑殘留量的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)方法。本發(fā)明靈敏度高，重現(xiàn)性好，經(jīng)濟(jì)，可用于畜產(chǎn)品中β-受體興奮劑動(dòng)劑殘留的檢測(cè)確證。
【專利說明】膜透析-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定畜產(chǎn)品中多種β-受體興 奮劑殘留的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及畜產(chǎn)品中β_受體興奮劑的檢測(cè)方法，具體涉及 利用膜透析-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定畜產(chǎn)品中18種β -受體興奮劑殘留的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] β -受體興奮劑是天然的兒茶酚胺類化學(xué)合成的衍生物，選擇性作用于β -腎上 腺受體。歐盟、日本、韓國(guó)等國(guó)家都規(guī)定禁止進(jìn)口含有此類藥物的肉制品。2002年我國(guó)農(nóng)業(yè) 部公告第176號(hào)明確規(guī)定鹽酸克倫特羅等7種β -受體激動(dòng)劑為禁用藥物，2010年農(nóng)業(yè)部 公告第1519號(hào)明確規(guī)定禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用苯乙醇胺Α等9種β -受體興奮劑， 兩個(gè)公告共禁用16種β-受體興奮劑。目前，動(dòng)物源性食品中β-受體興奮劑殘留的檢測(cè) 方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法等。高效液相色譜串聯(lián) 質(zhì)譜法因具有抗干擾能力好、靈敏度高、確證能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前主要的檢測(cè)和確 證方法。
[0003] 透析（dialysis)是通過小分子經(jīng)過半透膜擴(kuò)散到水(或緩沖液）的原理，將小分 子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)。目前透析在醫(yī)學(xué)上和廢水處理方面應(yīng)用較多， 應(yīng)用透析技術(shù)與分析儀器結(jié)合檢測(cè)β-受體興奮劑的方法主要局限于單一藥物的檢測(cè)，例 如Gonzalez等（1997)建立了雙向滲析膜技術(shù)與氣質(zhì)聯(lián)用儀結(jié)合技術(shù)檢測(cè)奶牛肝中鹽酸 克倫特羅含量，回收率達(dá)到99.3%，檢測(cè)限為250 --七（？.6〇1^&162，（：^.?6拉6，（：· Franco, B. Va' zquez, E. Quinto，A. Cepeda，Journal of Chromatography B，693 (1997) 321 - 326)。Fente等（1999)建立了雙向滲析膜技術(shù)與氣質(zhì)聯(lián)用儀結(jié)合技術(shù)檢測(cè)肉 牛毛中鹽酸克倫特羅含量，檢出限達(dá)5 ng/g，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)為7. 1%和 9. 5%(C. A. Fente，B. I. Va' zquez, C. Franco, A. Cepeda，P. G. Gigosos, Journal of Chromatography B，726 (1999) 133 - 139)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種可以同時(shí)檢測(cè)畜產(chǎn)品中18種β_受體興奮劑殘留 的方法，本發(fā)明18種β -受體興奮劑是萊克多巴胺（ractompamine ract)、克倫特羅 (clenbuterol clen)、沙丁胺醇（salbutamol sal)、溴布特羅（bromburerol bro )、 特布它林（terbutalin ter)、班布特羅（bambuterol bam)、噴布特羅（penbutolol pen)、非諾特羅（fenoterol fen)、齊帕特羅（zilpaterol zil)、苯乙醇胺 A (phenyl ethanolamine A phe)、阿福特羅（arformorerol arf)、西馬特羅（cimaterol cima)、苯氧丙酸胺（isoxsuprine iso)、妥布特羅（tulobuterol tul)、西布特羅 (cimbuterol cimb)、馬布特羅（mabuterol mab)、氯丙那林（clorprenaline clo)、 普奈洛爾（Propranolol pro)，該方法樣品處理方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，應(yīng)用于畜 產(chǎn)品中β -受體興奮劑殘留檢測(cè)可以縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是： 一種檢測(cè)畜產(chǎn)品中18種β-受體興奮劑殘留的方法，其包括步驟：將待測(cè)組織樣品經(jīng) 過樣品預(yù)處理后，提取上清液裝入透析袋中，將透析袋放入透析液中透析，收集透析液調(diào)節(jié) ΡΗ至9-10后用環(huán)己烷和乙酸乙酯的混合液萃取藥物樣品，萃取液濃縮后用于高效液相色 譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定藥物含量；其中， 所述透析袋采用標(biāo)準(zhǔn)再生纖維素膜RC，截留分子量MWC0為1000D ; 所述透析液為ΡΗ為4-5的乙酸銨緩沖溶液； 所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，是采用外標(biāo)法測(cè)定18種β -受體興奮劑的含量，其 液相色譜柱采用通用性，填料選自十八烷基鍵合相硅膠，流動(dòng)相：〇. 1%甲酸水溶液Α-乙 臆 Β，流速：0.2 mL /min，梯度洗脫：t= 0 min, 96%A, 4% B ; t= 2 min, 96%A, 4%B ; t=5 min, 77%A, 23% B ；t=12 min, 5%A, 95% B ；t=28 min, 44%A, 56% B ； t=24 min, 5%A, 95% B ; t=24. 1 min, 96%A,4% B ; t=32 min，96%A,4% B ;質(zhì)譜條件為：電噴霧電離源正離子掃 描（ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM);電噴霧電壓：5. 5 kV;離子源溫度：550 °C，霧化氣壓 力（GS1): 40 psi ;輔助氣流速（GS2): 60 psi，氣簾氣壓力（CUR): 40psi ;碰撞室入口電 壓（EP): 10 V;碰撞室出口電壓（CXP): 13 V，監(jiān)測(cè)分析物的離子對(duì)進(jìn)行藥物殘留確證分 析。
[0006] 本發(fā)明中，所述樣品預(yù)處理是準(zhǔn)確稱取5.00 g粉碎好的樣品，加入20 ml0.02mol/ L、PH4-5乙酸銨緩沖液，混勻，超聲20分鐘，8000轉(zhuǎn)離心5分鐘。
[0007] 本發(fā)明中，所述環(huán)己烷和乙酸乙酯的混合液優(yōu)選環(huán)已烷：乙酸乙酯=4 :1。
[0008] 本發(fā)明，透析時(shí)間彡6小時(shí)。
[0009] 本發(fā)明，本發(fā)明18中β -受體興奮劑線性范圍0. 5?10. 0 μ g/kg。
[0010] 本發(fā)明，本發(fā)明18中β-受體興奮劑的定量限為0.5 μ g/kg，進(jìn)樣兩20 μ L。
[0011] 本發(fā)明建立了完整的應(yīng)用膜透析技術(shù)檢測(cè)畜產(chǎn)品中18種β-受體興奮劑的高效 液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法，通過檢測(cè)應(yīng)用表明：該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，幾乎沒有基質(zhì) 效應(yīng)，能滿足β -受體激動(dòng)劑類藥物的殘留檢測(cè)任務(wù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1-圖18為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的特征離子色譜圖（0. 5 μ g/kg)。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 為了具體說明本發(fā)明，結(jié)合以下實(shí)施例具體說明，但本發(fā)明并局限于此。
[0014] 1.透析袋的制備 把透析膜(標(biāo)準(zhǔn)再生纖維素膜RC，截留分子量MWC0為1000D)剪成適當(dāng)長(zhǎng)度（10cm左 右）的小段，蒸餾水徹底清洗透析膜，不使用的透析膜放回儲(chǔ)存液中，密封保存，接觸透析膜 過程中必須戴手套。使用時(shí)，一端用下沉透析袋夾子夾緊，灌滿水后，用手指適當(dāng)加壓，檢查 不漏，方可裝入樣品。通常要留三分之一至一半的空間，以防透析過程中，袋外的水和緩沖 液過量進(jìn)入袋內(nèi)將袋漲破。裝完樣品后，用上浮夾子夾緊袋口，可在袋內(nèi)放一玻璃珠，以使 透析袋處于懸浮狀態(tài)，即可進(jìn)行透析。
[0015] 2.樣品的前處理 準(zhǔn)確稱取5. 00 g粉碎好的樣品，加入20 mlO. 02mol/L乙酸銨緩沖液（用乙酸調(diào)成 PH4-5)，混勻，超聲20分鐘，8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，上清液移入透析袋中，將透析袋浸入盛有 400-450 ml 0.02 mol/L乙酸銨緩沖液（PH4-5)的棕色燒杯中，放入轉(zhuǎn)子，將燒杯置于磁力 攪拌器上進(jìn)行透析，攪拌轉(zhuǎn)速以杯內(nèi)形成渦旋帶動(dòng)透析袋轉(zhuǎn)動(dòng)，透析袋不下沉為準(zhǔn)，杯外罩 上不透明袋子，時(shí)間為6 h。透析完成后取出透析袋，將燒杯中的透析液調(diào)PH至9-10,移入 1L的梨形分流漏斗中，加入40ml溶劑(環(huán)已烷：乙酸乙酯=4 :1)萃取2次，合并萃取液進(jìn)行 旋蒸，用〇. 1%甲酸水溶液（v/v)定容成1. 0 mL，供HPLC-MS/MS測(cè)定分析。
[0016] 3.液相色譜條件 本實(shí)施例采用的色譜柱為Thermo Hypersil Gold (2. 1 mm X100 mm，3 μπι)色譜 柱，Agilent Zorbax SB-C18、XDB-C18等十八烷基鍵合相硅膠也可以滿足分離要求。
[0017] 柱溫35 °C ;進(jìn)樣體積20 μ L。
[0018] 流動(dòng)相：Α :0. 1%甲酸水溶液，Β :乙腈，流速：0. 2 mL /min，梯度洗脫見表1 : 表1梯度洗脫程序

【權(quán)利要求】
1. 膜透析-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定畜產(chǎn)品中多種β-受體興奮劑殘留的方法，特征在 于，其包括步驟：將待測(cè)組織樣品經(jīng)過樣品預(yù)處理后，提取上清液裝入透析袋中，將透析袋 放入透析液中透析，收集透析液調(diào)節(jié)ΡΗ至9-10后用環(huán)己烷和乙酸乙酯的混合液萃取藥物 樣品，萃取液濃縮后用于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定藥物含量；其中： 所述β-受體興奮劑為以下18種β-受體興奮劑：萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇、 溴布特羅、特布它林、班布特羅、噴布特羅、非諾特羅、齊帕特羅、苯乙醇胺Α、阿福特羅、西馬 特羅、苯氧丙酰胺、妥布特羅、西布特羅、馬布特羅、氯丙那林、普奈洛爾； 所述透析袋采用標(biāo)準(zhǔn)再生纖維素膜RC，截留分子量MWCO為1000D ; 所述透析液為ΡΗ為4-5的乙酸銨緩沖溶液； 所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，是采用外標(biāo)法測(cè)定18種β -受體興奮劑的含量，其液 相色譜柱采用通用性，填料選自十八烷基鍵合相硅膠，流動(dòng)相：〇. 1%甲酸水溶液Α-乙腈 Β，流速：0· 2 mL /min，梯度洗脫：t= 0 min, 96%A, 4% B ; t= 2 min, 96%A, 4%B ; t=5 min, 77%A, 23% B ；t=12 min, 5%A, 95% B ；t=28 min, 44%A, 56% B； t=24 min,5%A, 95% B； t=24. 1 min, 96%A,4% B; t=32 min，96%A,4% B;質(zhì)譜條件為：電噴霧電離源正離子掃描 ESI+，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式MRM;電噴霧電壓：5.5 kV;離子源溫度：550 °C，霧化氣壓力GS1: 40 psi;輔助氣流速GS2: 60 psi，氣簾氣壓力CUR: 40psi;碰撞室入口電壓EP: 10 V;碰 撞室出口電壓CXP: 13 V，監(jiān)測(cè)分析物的離子對(duì)進(jìn)行藥物殘留確證分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述樣品預(yù)處理是準(zhǔn)確稱取5.00 g粉碎 好的樣品，加入20 mlO. 02mol/L、PH4-5乙酸銨緩沖液，混勻，超聲20分鐘，8000轉(zhuǎn)離心5 分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述環(huán)己烷和乙酸乙酯的混合液優(yōu)選環(huán) 已烷：乙酸乙酯=4 :1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：透析時(shí)間> 6小時(shí)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：18中β-受體興奮劑線性范圍0.5?10.0 μ g/kg。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：18中β -受體興奮劑的定量限為0. 5 μ g/ kg，進(jìn)樣量20yL。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104251898SQ201410562385
【公開日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】楊麗君, 徐成鋼, 梁君妮, 王美玲, 宋曉華, 安代志 申請(qǐng)人:威海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心