一種檢測抗cd52抗體的elisa反應體系與方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測抗CD52抗體的ELISA反應體系和方法，該方法包括構建CD52抗原多肽并對該抗原進行修飾，將該抗原進行包板捕捉樣品中抗CD52單抗，再通過進一步結合酶聯抗體，并通過加入合適底物而顯色，再通過與已知濃度標準品的對比，從而測出樣品中抗體的含量。本發(fā)明提供的用于檢測抗CD52抗體的ELISA反應體系與方法，該反應體系與方法可用于檢測培養(yǎng)上清液和生物樣本中抗CD52抗體的含量，本方法具有高度專屬性，生物樣本中的檢測靈敏度可達到0.1ug/ml。
【專利說明】-種檢測抗CD52抗體的ELISA反應體系與方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測抗CD52抗體的ELISA反應體系與方法。該反應體系與 方法可用于檢測培養(yǎng)上清液和生物樣本中抗CD52抗體的含量，本方法具有高度專屬性，生 物樣本中的檢測靈敏度可達到0. lug/ml。

【背景技術】
[0002] Alemuzumab (抗⑶52抗體，Campath-IH)是重組DNA轉染的CHO細胞表達的抗 CD52人源化的單克隆抗體，具有人抗體構架區(qū)和恒定區(qū)及鼠源的互補性決定區(qū)（CDR)的 IgGl kappa抗體?？贵w構建是將抗人CD52鼠源單克隆抗體（rat YTH 34. 5HL，Campath-IG) 的重鏈和輕鏈的CDR分別插入到人的IgGl重鏈和輕鏈可變區(qū)，替換人源抗體的CDR。 Alemtuzumab最早被批準用于慢性淋巴細胞白血病的治療，具有顯著的治療效果。由于其特 殊的作用機理，后續(xù)廣泛開展了多項自身免疫相關的臨床試驗，包括多發(fā)性硬化、GVHD等。 其中Alemtuzumab針對多發(fā)性硬化的治療已經被歐盟、加拿大等國家或地區(qū)的監(jiān)管機構批 準。
[0003] Alemtuzumab可特異性識別細胞表面⑶52抗原，在淋巴細胞分化過程中，淋巴細 胞表面表達⑶52抗原，單個細胞表面可表達約5xl05⑶52分子，構成抗體進攻淋巴細胞很 好的靶點。⑶52由12個氨基酸殘基組成，Asn-3是N-連接糖基化位點，抗原與細胞膜結合 位點是C-末端Ser-12,通過糖脂鍵連接細胞膜。純化的抗原組分不一致(糖基化）其分子 量21-28kD，N-Glycanase或Pronase處理后，分子量減少至6kD。⑶52抗原分子非常小，并 具有糖脂性，抗原決定簇靠近細胞膜，這些結構決定CD52抗原是很好的藥物靶點。
[0004] ⑶52抗原分子較小，難以直接用于ELISA檢測。另外Alemtuzumab分子主要組 成部分為人IgGl區(qū)域，而且各哺乳動物物種間IgGl的同源性非常高，因此對于生物樣 本中Alemtuzumab的特異性檢測一直欠缺特異性。Rebello P.等在Pharmacokinetics of CAMPATH-1H: assay development and validation. J Immunol ife從00? 2002?中 描述了一種基于HUT-78細胞系的檢測方法，但是基于細胞的檢測誤差較大，一般認為 會達到±25%，而且這種方法操作復雜，準備時間較長。Iman Jilani等描述了一種基 于 Alemtuzumab 中鼠源性 CDR 區(qū)的 ELISA 檢測方法 Alemtuzumab: validation of a sensitive and simple enzyme-linked immunosorbent assay. Leukemia Research 2004。該方法一定程度上提高了檢測的靈敏度，但穩(wěn)定性較差。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明建立了一套檢測抗⑶52抗體的ELISA反應體系和方法，包括構建⑶52多 肽抗原并對該抗原進行修飾，將該抗原進行包板捕捉樣品中抗CD52抗體，再通過進一步結 合標記抗體如酶聯抗體，并通過加入合適底物而顯色，通過與已知濃度標準品的對比，從而 測出樣品中抗體的含量。該方法檢測限值為〇. lug/ml，檢測范圍0. l~30ug/ml。
[0006] 本發(fā)明的一種檢測抗⑶52抗體的ELISA檢測方法，通常主要包括：合成⑶52多肽 抗原并對該多肽抗原進行修飾，將該多肽抗原配置成抗原溶液，包被于酶標板上；之后使用 洗滌液洗板，甩干后加入封閉液，然后再用洗滌液洗板；使用待測樣品緩沖液如PBST或相 應血清稀釋待測生物樣本，稀釋濃度根據待測生物樣本進行選取和調節(jié)，如KT5O倍稀釋， 之后加樣，加完樣的酶標板靜置反應，之后棄液，用洗滌液洗板；再加入標記抗體如酶聯抗 體進行反應，之后洗板；然后加入顯色液、終止液終止反應后將酶標板放至酶標儀內，0D450 讀數。然后通過與已知濃度標準品的對比，從而測出樣品中抗⑶52抗體的含量。
[0007] 本ELISA檢測方法的重要部分是⑶52多肽抗原的合成與修飾。⑶52序列為 (1-61): MKRFLFLLLT ISLLVMVQIQ TGLSGQNDTS QTSSPSASSN ISGGIFLFFV ANAIIHLFCFSjjf 述CD52多肽抗原的合成，其氨基酸序列為包含XTSQTX或XQTSSX的多肽或蛋白序列，其中 X代表任意氨基酸序列，特別是GQNDTSQTSSPS，為選取的12個氨基酸的抗體識別區(qū)，第25 至36個氨基酸：GQNDTSQTSSPS，對其進行人工合成。由于人工合成的抗原區(qū)域分子量較小， 難以進行包板，因此對該人工合成的抗原進行偶聯含有-OH基-SH基團的標簽蛋白如牛血 清白蛋白（BSA)修飾。牛血清白蛋白（BSA)，又稱第五組分，是牛血清中的一種白蛋白，包含 583個氨基酸殘基，分子量為66. 430 kDa，等電點為4. 7。牛血清白蛋白在生化實驗中有廣 泛的應用，例如在western blot中ELISA等中作為Blocking劑；在酶切反應緩沖液中加入 BSA，通過提高溶液中蛋白質的濃度，對酶起保護作用；防止酶的分解和非特異性吸附，能減 輕有些酶的變性，能減輕有些不利環(huán)境因素如加熱，表面張力及化學因素引起的變性。BSA 比較穩(wěn)定，常用于各種生物學反應中，作為蛋白保護劑及載體。除使用牛血清白蛋白之外， 也可使用其他偶聯物進行化學修飾，例如但不限于為BSA，PEG，PEI，GST，MBP等含有-OH 基-SH基團的標簽蛋白，直鏈或支鏈淀粉糖類，脂質體，瓊脂糖等疏水性載體。
[0008] 本發(fā)明中與已知濃度標準品的對比為與已知濃度標準品曲線進行對比，優(yōu)選通過 使用抗CD52抗體標準品與待測生物樣本進行平行試驗，獲得已知濃度標準品曲線。具體 地，通過使用含PBST的空白對照樣品梯度稀釋⑶52抗體標準品，并加樣，加樣后的酶標板 按照上述同樣步驟進行反應操作，并0D450讀數，根據所有讀數通過邏輯擬合獲得標準曲 線。該標準曲線要求R2 > 0.98。其中，⑶52抗體標準品的稀釋，通常按如下梯度：從40ug/ ml開始共做9個梯度，依次3倍稀釋。
[0009] 待測樣品緩沖液為常用緩沖液，如磷酸鹽緩沖液等，或用相應血清代替，相應血清 為待測生物樣本的血清，如猴、人、大鼠等； 所述生物樣本，可以為人或動物血清(血漿)、發(fā)酵培養(yǎng)上清液等。
[0010] 所述包被于酶標上的包板條件，為使用2. 5 y g/ml的⑶52多肽抗原溶液，并于4°C 冰箱放置過夜。
[0011] 所述洗板的洗滌液，為磷酸鈉鹽（pH 7. 4±0. 2)，洗板次數通?？梢詾?-6次。
[0012] 所述的封閉液為：5%脫脂奶粉或BSA或其他常用封閉液。
[0013] 所述稀釋步驟后的加樣過程，加樣時每個樣品做2個復孔，每孔lOOyl。
[0014] 所述標記抗體為發(fā)光物質標記的人IgG抗體，其標記物包括但不限于辣根過氧化 物酶（HRP)、生物素（Biotin)、異硫氰酸熒光素（FITC)、堿性磷酸酶（AP)等，其檢測形式可 以是化學發(fā)光、熒光、常規(guī)可見光等?？谷薎gG抗體可以常用的哺乳動物制備抗體，如兔抗、 鼠抗、羊抗等，也可以是重組的IgG抗體。一個非限制性例子例如：所述標記抗體為酶聯抗 體，具體例如但不限于為為酶聯標記的兔抗人IgG。此外，所述酶聯抗體也可用其他標記的 多種抗人IgG。
[0015] 所述加完樣的酶標板的靜置反應為抗體抗原結合反應，其反應溫度為31-37°C，時 間通常是1-4小時。
[0016] 所述的顯色液為TMB(3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺)，顯色反應時間為5-30min，反應 溫度為31-37°C ;所述終止液為95%濃硫酸。
[0017] -種用于檢測抗⑶52抗體的ELISA反應體系，主要包括以下組分：人工合 成并經過化學修飾的CD52多肽抗原，標記抗體，包被液，封閉液，洗滌液，酶標板，TMB (3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺）顯色液，終止液，待測樣品緩沖液或相應血清，待測生物樣本。
[0018] 該反應體系的包被液為磷酸鹽緩沖液，該磷酸鹽緩沖液可以配制得到，一個非限 制性例子如：配制時稱取碳酸鈉I. 272g，碳酸氫鈉2. 344g，加去離子水至30ml，然后調pH 至9. 4,加去離子水定容至40ml。保存于4°C冰箱，稀釋10倍使用。
[0019] 該反應體系的封閉液為脫脂奶粉或BSA或其他常用封閉液。
[0020] 所述洗滌液為PBST (磷酸鈉鹽）洗滌液。
[0021] 該反應體系的標記抗體為發(fā)光物質標記的人IgG抗體，其標記物包括但不限于辣 根過氧化物酶（HRP)、生物素（Biotin)、異硫氰酸熒光素（FITC)、堿性磷酸酶(AP)等，其檢 測形式可以是化學發(fā)光、熒光、常規(guī)可見光等?？谷薎gG抗體可以常用的哺乳動物制備抗 體，如兔抗、鼠抗、羊抗等，也可以是重組的IgG抗體。一個非限制性例子例如：可使用IOul HRP標記的兔抗人IgG原液加入到90ul PBS中震蕩混勻得1:10酶聯抗體。
[0022] 該反應體系的終止液用途是終止顯色反應，并且提高顯色的穩(wěn)定性，便于檢測。例 如HRP顯色體系的終止液可以是2M硫酸，AP顯色終止液可以是NaOH。
[0023] 與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下： 本發(fā)明提供了一種用于檢測抗CD52抗體的ELISA反應體系與方法，該反應體系與方法 可用于檢測培養(yǎng)上清液和生物樣本中抗CD52抗體的含量，本方法具有高度專屬性，生物樣 本中的檢測靈敏度可達到0. lug/ml。
[0024] 當然，實施本發(fā)明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明實施例1的標準曲線； 圖2是本發(fā)明實施例1的樣品測試曲線。

【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應該理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明，而不用于限定本發(fā)明的保護范圍。在實際應用中本領域技術人員根據本發(fā)明做出的改 進和調整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0027] 實施例1 本實施例以HRP標記的兔抗人IgG酶聯抗體檢測食蟹猴血清中抗CD52抗體為例說明 本發(fā)明的ELISA反應體系與方法。
[0028] 該方法具體步驟如下： 第一步，包板（Coating):取25 ii I lmg/ml的人工合成并經過化學修飾的⑶52多肽 抗原，加入到IOml包被液中混勻，配成濃度為2. 5 ii g/ml的抗原溶液，包被于酶標板上， 100 Ul/孔，于4°C冰箱放置過夜。所述人工合成并經過化學修飾的⑶52多肽抗原為選取 12個氨基酸的抗體識別區(qū)為第25至36個氨基酸：GQNDTSQTSSPS進行人工合成，并進行偶 聯牛血清白蛋白（BSA)修飾得到的。所述包被液為磷酸鹽緩沖液。
[0029] 第二步，封閉（Blocking):棄去孔中液體，使用洗漆液洗板3次，每次150rpm震蕩 lmin，甩干后加入250 iil/孔的封閉液，放37°C培養(yǎng)箱，作用3小時，再用洗滌液洗3次，每 次150rpm震蕩lmin。所述洗滌液為PBST (磷酸鈉鹽)洗滌液。所述封閉液為5%脫脂奶粉 或BSA或其他常用封閉液。
[0030] 第三步，標準品的稀釋：用含29T10%食蟹猴血清的PBST模擬待測樣品環(huán)境，梯度 稀釋抗⑶52抗體標準品：取8ul 2mg/ml⑶52抗體標準品加入到400ul 10%血清的PBST 中濃度為40ug/ml，取IlOul 40ug/ml抗CD52抗體加入到220ul 10%血清的PBST中稀釋為 13. 33ug/ml，依次3倍稀釋。從40ug/ml開始共做9個梯度。每個濃度做2個復孔。
[0031] 第四步，樣品稀釋：用PBST將待測生物樣品1(T50倍稀釋，加樣時每個樣品做2個 復孔，每孔IOOu 1。
[0032] 第五步，反應：加完樣的酶標板放37°C培養(yǎng)箱，靜置2小時進行抗原抗體結合反 應。之后棄液，用洗滌液洗板3次，每次150rpm震蕩lmin。取1:100酶聯抗體20ul，用PBST 稀釋500倍，混勻后每孔100 ill加至酶標板中，放37°C培養(yǎng)箱，反應1小時。棄液，用洗滌 液洗板3次，每次150rpm震蕩lmin。在干凈吸水紙上拍干。所述酶聯抗體為HRP標記的兔 抗人IgG酶聯抗體。
[0033] 第六步，顯色、終止、讀數：每孔加入TMB IOOiil，放37°C培養(yǎng)箱，反應IOmin顯色。 之后每孔加入終止液50iU，終止反應。將酶標板放至酶標儀內，0D450讀數。所述終止液 為95%濃硫酸。
[0034] 按照上述方法進行食蟹猴血清中抗⑶52抗體檢測，得到食蟹猴血清中抗⑶52抗 體標準曲線和待測樣品的OD值如下表1。
[0035] 表 1

【權利要求】
1. 一種檢測抗CD52抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，包括合成CD52多肽抗原并 對該CD52多肽抗原進行修飾，將該修飾后的CD52多肽抗原進行包板捕捉樣品中抗CD52抗 體，再進一步結合標記抗體，并通過加入顯色液、終止液而顯色，然后通過與已知濃度標準 品的對比，測出樣品中抗CD52抗體的含量。
2. 如權利要求1所述的檢測抗CD52抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述CD52多 肽抗原的合成，其氨基酸序列為包含XTSQTX或XQTSSX的多肽或蛋白序列，其中X代表任 意氨基酸序列。
3. 如權利要求2所述的檢測抗CD52抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述X為選 取的12個氨基酸的抗體識別區(qū)，第25至36個氨基酸：GQNDTSQTSSPS，對其進行人工合成。
4. 如權利要求1或2或3所述的檢測抗CD52抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，對 所述多肽抗原進行修飾的方法為：對所述多肽抗原進行偶聯含有-0H基-SH基團的標簽蛋 白的修飾。
5. 如權利要求4所述的檢測抗CD52抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述含有-0H 基-SH基團的標簽蛋白選自牛血清白蛋白，聚乙二醇，聚乙烯亞胺，谷胱甘肽巰基轉移酶， 麥芽糖結合蛋白，直鏈或支鏈淀粉糖類，脂質體，瓊脂糖的一種或幾種。
6. 如權利要求1所述的檢測抗CD52抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，將修飾后的 ⑶52多肽抗原進行包板捕捉樣品中抗⑶52抗體的方法為：將⑶52多肽抗原配置成⑶52多 肽抗原溶液，包被于酶標板上；使用洗滌液洗板，甩干后加入封閉液；使用待測樣品緩沖液 或相應血清稀釋待測生物樣本，并加樣；加完樣的酶標板靜置反應后，棄液，用洗滌液洗板。
7. 如權利要求6所述的檢測抗CD52抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述靜置反 應為抗體抗原結合反應，其反應溫度為31-37°C，時間是1-4小時。
8. 如權利要求1所述的檢測抗CD52抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述標記抗 體為發(fā)光物質標記的人IgG抗體。
9. 如權利要求1或8所述的檢測抗CD52抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述標 記抗體為酶聯標記的兔抗人IgG。
10. 如權利要求1所述的檢測抗CD52抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述的顯色 液為TMB (3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺)，顯色反應時間為5-30min，反應溫度為31-37°C ;所 述終止液為95%濃硫酸。
11. 如權利要求1所述的檢測抗CD52抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述與已 知濃度標準品的對比為與已知濃度標準品曲線的對比，所述已知濃度標準品曲線的R2 > 0. 98 〇
12. 如權利要求1所述的檢測抗⑶52抗體的ELISA檢測方法，其特征在于，所述ELISA 檢測方法的限值為0. lug/ml，檢測范圍0. l~30ug/ml。
13. -種用于檢測抗⑶52抗體的ELISA反應體系，其特征在于，主要包括以下組分：人工合成并經過化學修飾的CD52多肽抗原，標記抗體，包被液，封閉液，洗滌液，酶標板， 3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺顯色液，終止液，待測樣品緩沖液或相應血清，待測生物樣本。
14. 如權利要求13所述的用于檢測抗CD52抗體的ELISA反應體系，其特征在于，所述 人工合成并經過化學修飾的CD52多肽抗原通過選取12個氨基酸的抗體識別區(qū)為第25至 36個氨基酸：GQNDTSQTSSPS，并進行人工合成，之后偶聯含有-OH基-SH基團的標簽蛋白得 到。
【文檔編號】G01N33/558GK104360057SQ201410566000
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權日:2014年10月22日
【發(fā)明者】齊念民, 王鵬, 莊超, 曾晨 申請人:上海泰因生物技術有限公司