一種用于間接ELISA檢測豬PRRSV病毒IgG或IgA抗體的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測試劑領(lǐng)域，涉及一種用于間接ELISA檢測豬PRRSV病毒IgG或IgA抗體的試劑盒。一種用于間接ELISA檢測豬血清或唾液PRRSV病毒IgG或IgA抗體的試劑盒，該試劑盒包含：a)抗體檢測板，b)HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體溶液或HRP標(biāo)記的羊抗豬IgA，c)陽性對照：PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清或唾液，d)陰性對照：PRRSV陰性血清或唾液，e)樣品稀釋液，f)10×濃縮洗滌液，g)底物顯色液，h)終止液。本發(fā)明試劑盒用于豬血清或唾液中PRRSV IgG或IgA抗體的有很好的PRRSV特異性和敏感性。重復(fù)性試驗也表明該試劑盒具有良好的重復(fù)性好。
【專利說明】-種用于間接ELISA檢測豬PRRSV病毒IgG或IgA抗體的 試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測試劑領(lǐng)域，涉及一種用于間接ELISA檢測豬PRRSV病毒IgG 或IgA抗體的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸障礙綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome， PRRS)又稱豬高致病性藍(lán)耳病，由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcinereproductive andrespiratorysyndromevirus,PRRSV)感染所致。該病在中國的流行和分布十分廣泛， 危害日趨嚴(yán)重，已成為制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染性疾病。該病在臨床上主要表現(xiàn)為持續(xù) 高熱、糞便干燥、呼吸障礙及繁殖性能下降，母豬在懷孕后期出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎以及木乃伊胎 [1]。具有發(fā)病率高、持續(xù)時間長、難治療和易反復(fù)等特點。
[0003] 目前豬群中PRRSV抗體檢測主要采用血清學(xué)方法，主要包括免疫過氧化物酶單層 試驗（IPMA)、間接免疫熒光試驗（IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)和血清中和試驗（SN) 等。血清學(xué)檢測技術(shù)因操作簡便，且敏感性和特異性較高，已成為豬繁殖與呼吸障礙綜合征 的主要檢測方法之一。然而，血清學(xué)檢測方法費(fèi)時、費(fèi)力，對豬產(chǎn)生的應(yīng)激較大，同時威脅著 操作者的安全。血清樣本難以滿足大量樣本數(shù)的要求，不能對動物隨機(jī)、隨時采樣。
[0004] 唾液采集方便，利用豬好奇心理及嗜好咀嚼的特性，將滅菌處理的棉球懸掛于豬 面前，將吸收唾液的棉球置于干凈的封口袋中，擠壓到離心管中，-20°c保存?zhèn)溆?。目前關(guān)于 用唾液來檢測疾病的方法已經(jīng)在人醫(yī)臨床上開始應(yīng)用，如在兒童孤獨(dú)癥、口干癥、乙型肝炎 表面抗原以及艾滋病等。但唾液樣本在獸醫(yī)臨床上尚未得到廣泛應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種用于間接ELISA檢測豬血清 或唾液中PRRSVIgG或IgA抗體的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007] -種用于間接ELISA檢測豬血清或唾液PRRSV病毒IgG或IgA抗體的試劑盒，該 試劑盒包含：a)抗體檢測板，b)HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體溶液或HRP標(biāo)記的羊抗豬IgA抗 體溶液，c)陽性對照：PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清或唾液，d)陰性對照：PRRSV陰性血清或唾液， e)樣品稀釋液，f) 10X濃縮洗滌液，g)底物顯色液，h)終止液，其中：所述的抗體檢測板為 包被PRRSVJXA1重組N蛋白的96孔酶標(biāo)板；所述的PRRSVJXA1重組N蛋白通過以下方法 制備得到：
[0008] 1)根據(jù)PRRSVJXA1株設(shè)計1對擴(kuò)增包括N蛋白全基因序列的特異性引物FI:SEQ IDNO. 1 和SEQIDNO. 2,以PRRSVJXA1 株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增PRRSVJXA1 株N蛋 白基因片段；
[0009] 2)將擴(kuò)增的片段插入pET-28a表達(dá)載體的EcoRI和Xhol酶切位點間得到重組表 達(dá)質(zhì)粒pET-28a-N，經(jīng)雙酶切及測序驗證；
[0010] 3)將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)基因工程菌誘導(dǎo)表 達(dá)目的蛋白；
[0011] 4)重組菌體離心后，純化得所述的PRRSVJXA1重組N蛋白。
[0012] 用于間接ELISA檢測豬血清PRRSV病毒IgG抗體的試劑盒中所述的酶標(biāo)板中抗原 包被濃度為1. 25yg/mL，使用的封閉液為3%BSA的PBST溶液；所述的HRP標(biāo)記的羊抗豬 IgG抗體溶液稀釋度為1:4000 ;陽性對照為用PBST溶液1:40稀釋的PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清； 陰性對照為用PBST溶液1:40稀釋的PRRSV陰性血清。
[0013] 用于間接ELISA檢測豬血清PRRSV病毒IgA抗體的試劑盒中所述的酶標(biāo)板中抗原 包被濃度為2. 5yg/mL，使用的封閉液為1 %BSA的PBST溶液；所述的HRP標(biāo)記的羊抗豬 IgA抗體溶液稀釋度為1:1000 ;陽性對照為用PBST溶液1:4稀釋的PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清； 陰性對照為用PBST溶液1:4稀釋的PRRSV陰性血清。
[0014] 用于間接ELISA檢測豬唾液PRRSV病毒IgG抗體的試劑盒中所述的酶標(biāo)板中抗原 包被濃度為2. 5yg/mL，使用的封閉液為1 %BSA的PBST溶液；所述的HRP標(biāo)記的羊抗豬 IgG抗體溶液稀釋度為1:2000 ;陽性對照為用PBST溶液1:2稀釋的PRRSV陽性唾液樣本； 陰性對照為用PBST溶液1:2稀釋的PRRSV陰性唾液樣本。
[0015] 用于間接ELISA檢測豬唾液PRRSV病毒IgA抗體的試劑盒中所述的酶標(biāo)板中抗原 包被濃度為2. 5yg/mL，使用的封閉液為1 %BSA的PBST溶液；所述的HRP標(biāo)記的羊抗豬 IgA抗體溶液稀釋度為1:1000 ;陽性對照為用PBST溶液1:2稀釋的PRRSV陽性唾液樣本； 陰性對照為用PBST溶液1:2稀釋的PRRSV陰性唾液樣本。
[0016] 所述的樣品稀釋液為所述的樣品稀釋液為PBST。
[0017] 本發(fā)明所述的PBST溶液為含5%Tween-20的PBS溶液。
[0018] 有益效果：
[0019]PRRSV病毒基因組約15kb，含8個閱讀框（ORFs)，其中0RF7長372bp，編碼PRRSV 的核衣殼蛋白N蛋白。N蛋白最為保守，歐洲型和美洲型毒株含有共同的N蛋白抗原決定 簇。N蛋白含量較高，占病毒結(jié)構(gòu)蛋白的20?40%，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，有較強(qiáng)的免疫 活性。本發(fā)明通過基因工程手段合成了重組E蛋白，以重組N蛋白為包被抗原，建立檢測豬 血清或唾液中PRRSV抗體的間接ELISA方法和間接ELISA試劑盒。血清交叉試驗證明，本發(fā) 明試劑盒用于豬血清或唾液中PRRSVIgG或IgA抗體的有很好的PRRSV特異性和敏感型。 重復(fù)性試驗也表明該試劑盒具有良好的重復(fù)性好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1N蛋白基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果
[0021] M:DL1000Marker ;1，2:N 蛋白基因
[0022] 圖2pET-28a_N重組質(zhì)粒雙酶切鑒定
[0023]:DL5000Marker ;1 :pET-28a-N基因PCR產(chǎn)物；2:pET-28a-N重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn) 物；3:pET-28a雙酶切產(chǎn)物
[0024] 圖3重組N蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析
[0025] M:蛋白 Marker ;1 :pET-28a/BL21(DE3)菌液，2 :pET-28a-N 誘導(dǎo)前菌液，3 : pET-28a-N誘導(dǎo)后菌裂解液上清，4 :pET-28a-N誘導(dǎo)后菌裂解液沉淀
[0026] 圖4重組N蛋白的親和層析純化
[0027]M:蛋白Marker;1:純化后的重組N蛋白
[0028] 圖5重組N蛋白的Western blot分析
[0029]M:預(yù)染蛋白Marker;1:純化后的重組N蛋白

【具體實施方式】
[0030] 實施例1重組N蛋白的表達(dá)及純化
[0031] 1.1N蛋白基因的擴(kuò)增
[0032] 根據(jù)美洲株P(guān)RRSVJXA1株（GenBank:KC422729)設(shè)計1對擴(kuò)增包括N蛋白全基因 序列的特異性引物:P1:5' -CCGGAATTCATGCCAAATAACAACGGCAAG-3'(SEQIDNO. 1)；
[0033]P2:5'-CCGCTCGAGTCATGCTGAGGGTGATGCTGT-3'(SEQIDNO. 2)，
[0034] 分別于上游和下游的5'端插入EcoRI和Xhol限制性酶切位點。引物由英駿生物 技術(shù)有限公司合成，該擴(kuò)增片段大小為372bp。從病毒細(xì)胞培養(yǎng)液中提取總RNA，按照試劑 盒說明進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增目的基因。PCR擴(kuò)增程序為：94°C預(yù)變性3min;94°C45s，55°C45s， 72°Clmin，35個循環(huán)；72°C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取5iiLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠 電泳檢查，結(jié)果顯示與預(yù)期大小相符（圖1)。
[0035] 1. 2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0036] 將N基因純化回收后，經(jīng)EcoRI和Xhol雙酶切后，克隆至經(jīng)EcoRI和Xhol雙酶 切消化后的pET_28a表達(dá)載體中，于16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，堿裂解法少制備 質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增及酶切鑒定，篩選陽性重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-N，雙酶切鑒定為陽性后，送 至測序公司進(jìn)行序列測定。pET-28a-N經(jīng)測序鑒定，與PRRSVJXAl(GenBank:KC422729)的 同源率達(dá)99%。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和Xhol雙酶切鑒定，1 %瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見約 5369bp和372bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2)。
[0037] 1. 3重組融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)
[0038] 將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21 (DE3)中，挑取陽性克隆，接種于新鮮LB液體 培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D_達(dá)到約0. 6左右，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為lmmol/L， 18°C誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后，離心收集菌體，SDS-PAGE檢測表達(dá)情況。離心后菌體經(jīng)超聲破碎后， 分別取上清和沉淀，SDS-PAGE分析表達(dá)蛋白的可溶性。經(jīng)12%SDS-PAGE電泳分析，空載 體菌pET-28a/BL21 (DE3)及pET-28a-N誘導(dǎo)前菌液沒有出現(xiàn)目的蛋白，超聲裂解液上清在 17kD左右出現(xiàn)目的蛋白，說明該表達(dá)蛋白為可溶性蛋白（圖3)。
[0039] 1. 4重組蛋白的純化及免疫學(xué)活性檢測
[0040] 37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)5h的200mL重組菌體離心后，用150mL50mmol/LPBS重懸菌體沉 淀，按約1:10的比例加入200yL質(zhì)量濃度為50g/L，含1 %TritonX-100的預(yù)冷的溶菌酶， 混合作用30min后，250W超聲裂解2h，離心之后上清用0. 22ym的濾器過濾。用3mL鎳瓊 脂糖凝膠基質(zhì)裝柱，自然沉降30min，加過濾后上清，然后依次用10?20倍柱床體積的PBS 緩沖液洗滌1次，用100、200、300、400mmol/L咪唑磷酸鹽緩沖液洗脫，與上清液和沉淀物進(jìn) 行12 %的SDS-PAGE檢測。12 %SDS-PAGE電泳分析表明，盡管有少量雜蛋白，但目的蛋白占 絕對多的含量，且純度可達(dá)90 %以上（圖4)。
[0041]按常規(guī)方法（DeaS,WilsonL,TherrienD,etal.CompetitiveELISAfor detectionofantibodiestoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus usingrecombinantE.coil-expressednucleocapsid),對純化N蛋白進(jìn)行Westernblot 分析，分別應(yīng)用PRRS標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG作為一抗和二抗，檢測重組融 合蛋白的免疫原性。結(jié)果顯示：純化N蛋白在目標(biāo)條帶處出現(xiàn)明顯印跡（圖5)。
[0042] 實施例2血清IgGELISA檢測方法的建立
[0043] 1. 1最佳抗原包被濃度與血清稀釋濃度的確定
[0044] 將實施例1中純化的N蛋白用PH9. 6, 0. 05M碳酸鹽緩沖液稀釋成6個稀釋度進(jìn)行 包被 10 y g/mL, 5 y g/mL, 2. 5 y g/mL, 1. 25 y g/mL, 0? 625 y g/mL 及 0? 313 y g/mL，每個稀釋 度重復(fù)兩孔，100 UL/孔，4°C包被過夜。PBST (含0.5 % Tween-20的roS)洗滌3次，每孔 加入lOOyL 3%BSA(稀釋于PBST中）于37°C溫箱中封閉2h。PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰 性血清分別于封閉液中進(jìn)行1:10, 1:20, 1:40, 1:80稀釋，每孔100 yL，37°C溫箱中孵育lh 進(jìn)行ELISA方陣實驗。HRP標(biāo)記的抗豬IgG抗體于PBST中1 :5000倍稀釋（說明書推薦稀 釋倍數(shù)），每孔100UL，37°C溫箱中孵育lh。加入100iiL顯色底物，37°C避光顯色10min。 100iiL 2mol/L 1^04終止反應(yīng)。測定各孔0D450nm值，根據(jù)陽性血清0D45Qnm值和陰性血清 〇D 45(lnm值之比（即P/N)的最大值，確定最佳抗原包被濃度與血清稀釋濃度。
[0045] 表1重組N蛋白最佳抗原包被濃度和血清最佳稀釋度的確立

【權(quán)利要求】
1. 一種用于間接ELISA檢測豬血清或唾液PRRSV病毒IgG或IgA抗體的試劑盒，其特 征在于該試劑盒包含：a)抗體檢測板，b)HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體溶液或HRP標(biāo)記的羊抗 豬IgA抗體溶液，c)陽性對照：PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清或唾液，d)陰性對照：PRRSV陰性血清 或唾液，e)樣品稀釋液，f) 10X濃縮洗滌液，g)底物顯色液，h)終止液，其中：所述的抗體 檢測板為包被PRRSV JXA1重組N蛋白的96孔酶標(biāo)板；所述的PRRSV JXA1重組N蛋白通過 以下方法制備得到： 1) 根據(jù)PRRSV JXA1株設(shè)計1對擴(kuò)增包括N蛋白全基因序列的特異性引物FI :SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2,以 PRRSV JXA1 株基因組 RNA 為模板，RT-PCR 擴(kuò)增 PRRSV JXA1 株 N 蛋 白基因片段； 2) 將擴(kuò)增的片段插入pET-28a表達(dá)載體的EcoRI和Xhol酶切位點間得到重組表達(dá)質(zhì) 粒pET-28a-N，經(jīng)雙酶切及測序驗證； 3) 將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)目 的蛋白； 4) 重組菌體離心后，純化得所述的PRRSV JXA1重組N蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于用于間接ELISA檢測豬血清PRRSV病毒 IgG抗體的試劑盒中所述的酶標(biāo)板中抗原包被濃度為1. 25 ii g/mL，使用的封閉液為3 % BSA 的PBST溶液；所述的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體溶液稀釋度為1:4000 ;陽性對照為用PBST 溶液1:40稀釋的PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；陰性對照為用PBST溶液1:40稀釋的PRRSV陰性血 清。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于用于間接ELISA檢測豬血清PRRSV病毒 IgA抗體的試劑盒中所述的酶標(biāo)板中抗原包被濃度為2. 5 ii g/mL，使用的封閉液為1% BSA 的PBST溶液；所述的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgA抗體溶液稀釋度為1:1000 ;陽性對照為用PBST 溶液1:4稀釋的PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；陰性對照為用PBST溶液1:4稀釋的PRRSV陰性血 清。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于用于間接ELISA檢測豬唾液PRRSV病毒 IgG抗體的試劑盒中所述的酶標(biāo)板中抗原包被濃度為2. 5 ii g/mL，使用的封閉液為1% BSA 的PBST溶液；所述的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體溶液稀釋度為1:2000 ;陽性對照為用PBST 溶液1:2稀釋的PRRSV陽性唾液樣本；陰性對照為用PBST溶液1:2稀釋的PRRSV陰性唾液 樣本。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于用于間接ELISA檢測豬唾液PRRSV病毒 IgA抗體的試劑盒中所述的酶標(biāo)板中抗原包被濃度為2. 5 ii g/mL，使用的封閉液為1 % BSA 的PBST溶液；所述的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgA抗體溶液稀釋度為1:1000 ;陽性對照為用PBST 溶液1:2稀釋的PRRSV陽性唾液樣本；陰性對照為用PBST溶液1:2稀釋的PRRSV陰性唾液 樣本。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的樣品稀釋液為PBST。
【文檔編號】G01N33/68GK104330572SQ201410583386
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】樊彥紅, 何成華, 趙秀美, 任喆, 夏兵兵, 汪袁 申請人:蘇州市吳江區(qū)畜牧獸醫(yī)站, 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)