一種髓過氧化物酶定量檢測方法及檢測試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及基于髓過氧化物酶與特異性單克隆抗體結(jié)合的免疫反應(yīng)及其自身酶活性的免疫吸附檢測方法。該方法是在酶標(biāo)板上包被經(jīng)篩選的髓過氧化物酶單克隆抗體，可與待測樣品中髓過氧化物酶特異性結(jié)合，但并不影響髓過氧化物酶自身酶活性反應(yīng)，通過吸附的髓過氧化物酶直接對底物TMB催化作用，實現(xiàn)對髓過氧化物酶的定量檢測。該檢測方法特異性好；且具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性；操作簡便；避免了現(xiàn)有ELISA檢測方法中辣根過氧化物檢測系統(tǒng)對髓過氧化物酶檢測的影響，為髓過氧化物酶的檢測開辟了一條新途徑。
CCTCC NO：C2014165
2014.09.10
【專利說明】一種髓過氧化物酶定量檢測方法及檢測試劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種髓過氧化物酶定量檢測方法及檢測 試劑。

【背景技術(shù)】
[0002] 髓過氧化物酶（myeloperoxidase, ΜΡ0)是一種來源于白細胞的亞鐵血紅素酶，主 要存在于髓系細胞（主要是嗜中性粒細胞和單核細胞）的嗜苯胺藍顆粒中，外界刺激可導(dǎo) 致中性粒細胞聚集,釋放ΜΡ0,血液中95 %的MPO是由活化的嗜中性粒細胞脫顆粒釋放入血 的。MPO的相對分子質(zhì)量約為150kDa，是由2個亞單位聚合而成的二聚體，每個亞單位又 由一條重鏈（ct鏈，相對分子質(zhì)量約59kDa左右）和一條輕鏈（β鏈，相對分子質(zhì)量約 15kDa)構(gòu)成，2個亞單位在α鏈處由1個二硫鍵相連。
[0003] 目前MPO測定方法常用的為比色法活性檢測和免疫學(xué)ELISA檢測。比色法直接 測定血液中MPO的酶活性，受血液中其他廣泛存在的過氧化物酶，如嗜酸性粒細胞過氧化 物酶等的干擾，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。而已有的特異性的免疫檢測ELISA法采用二株抗MPO抗 體，一株作為捕捉抗體，另一株作為酶標(biāo)抗體（顯色抗體），最常使用的是辣根過氧化物酶 (HRP)系統(tǒng)，但檢測的MPO具有過氧化物酶活性，可干擾辣根過氧化物酶活性，影響檢測結(jié) 果。因此本發(fā)明結(jié)合免疫反應(yīng)的特異性及過氧化物酶活性的檢測方法，可避免上述假性結(jié) 果的產(chǎn)生。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供基于髓過氧化物酶免疫反應(yīng)及自身酶活性的髓過氧化物酶 免疫吸附定量檢測方法（MPO-ISA)。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種基于髓過氧化物酶免疫反應(yīng)及自身酶活性的免疫吸附檢測方法，在酶標(biāo)板上 包被髓過氧化物酶單克隆抗體，利用酶標(biāo)板包被的髓過氧化物酶單克隆抗體與待測樣品中 的髓過氧化物酶特異性結(jié)合，通過吸附的髓過氧化物酶直接催化底物ΤΜΒ，實現(xiàn)髓過氧化物 酶的定量檢測，MPO-ISA檢測示意圖見附圖1。
[0007] 其中，所述的髓過氧化物酶單克隆抗體為經(jīng)過篩選的高特異性的單克隆抗體，能 夠與髓過氧化物酶結(jié)合，且不影響其底物結(jié)合中心、催化中心等與酶活性相關(guān)的位點。
[0008] 所述的髓過氧化物酶單克隆抗體優(yōu)選保藏號為CCTCC NO :C2014165的雜交瘤細 胞株MCMl分泌的抗人髓過氧化物酶單克隆抗體mcml。
[0009] 一株抗人髓過氧化物酶單克隆抗體的雜交瘤細胞株MCMl，于2014年9月10日保 藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :C2014165。
[0010] 用于髓過氧化物酶定量檢測的單克隆抗體mcml，由所述的雜交瘤細胞株MCMl分 泌。
[0011] 所述的雜交瘤細胞株MCM1、所述的單克隆抗體mcml在制備髓過氧化物酶檢測試 劑中的應(yīng)用，優(yōu)選在制備髓過氧化物酶定量檢測試劑中的應(yīng)用。
[0012] 一種髓過氧化物酶定量檢測試劑盒，含有包被所述的髓過氧化物酶單克隆抗體 mcml的固相材料。
[0013] 其中，所述的固相材料選自酶標(biāo)板、磁性微球、玻璃珠。
[0014] 有益效果：
[0015] 本發(fā)明利用髓過氧化物酶免疫反應(yīng)和自身過氧化物酶的催化活性，僅使用一株單 克隆抗體，就能實現(xiàn)髓過氧化物酶的定量檢測，具有操作簡便，縮短了檢測時間，減少了經(jīng) 費支出的優(yōu)點。相比現(xiàn)有ELISA法，還避免與辣根過氧化物酶交叉干擾檢測結(jié)果。本方法 具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
[0016] 本發(fā)明利用人髓過氧化物酶（人白細胞提?。槊庖咴?jīng)過腹腔免疫及脾內(nèi)免 疫、常規(guī)細胞融合、篩選及克隆化，獲得了一株能夠穩(wěn)定分泌抗髓過氧化物酶單克隆抗體的 雜交瘤細胞株MCMl (CCTCC NO :C2014165)。經(jīng)ELISA、免疫印跡等方法鑒定，該雜交瘤細胞 所分泌的單克隆抗體mcml能夠特異性識別髓過氧化物酶，并且抗原抗體結(jié)合反應(yīng)不影響 抗原的酶活性。利用該特性，在酶標(biāo)板上包被mcml，與待測樣品中的髓過氧化物酶特異性結(jié) 合，通過吸附的髓過氧化物酶直接催化底物TMB，使髓過氧化物酶的定量檢測具有更高的準(zhǔn) 確性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖I. MPO-ISA檢測方法示意圖。
[0018] 圖2. Western blot鑒定制備的抗人MPO單克隆抗體mcml。所用抗原為MPO標(biāo)準(zhǔn) 品500叩(8厘80，來源于人白細胞，購自芬蘭!15^681:，1^(1.公司），111〇111濃度1(^8/1]1]^。18137 為抗人MPO單抗，購自芬蘭Hytest, Ltd.公司，在本實驗中作為陽性對照，濃度10 μ g/mL。 Marker 為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，購自 Bio-Rad Laboratories, Inc. (#161-0374)。
[0019] 圖3.間接ELISA法比較MPO對HRP及AP顯色系統(tǒng)的影響
[0020] 圖4.抗MPO單抗選擇，hWBC:人白細胞裂解液
[0021] 圖5. mcml單抗不同包被濃度吸光度值比較，曲線為經(jīng)Sigmoidal擬合，η = 4。
[0022] 圖6. MPO-ISA方法孵育時間（A)及顯色時間（B)選擇，η = 3
[0023] 圖7. MPO-ISA方法典型標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為1. 95?250ng/mL，Y = 0· 0104X-0. 0104, r2 = 0· 9989, ρ〈0· 0001。
[0024] 圖8.不同種屬白細胞裂解液MPO-ISA檢測結(jié)果（h:人；c:豚鼠；r:大鼠；m:小 鼠 ），n = 6圖9.MP0-ISA與上市產(chǎn)品（武漢華美生物⑶SABIO公司人MPO ELISA試劑盒 CSB - E08721h)對照檢測。A :⑶SABIO公司人MPO ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品對照檢測結(jié)果；B : Hytest公司人MPO標(biāo)準(zhǔn)品對照檢測結(jié)果；C :人白細胞裂解液對照檢測結(jié)果
[0025] 生物材料保藏信息
[0026] 雜交瘤細胞株MCMl，于2014年9月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號 為CCTCC NO :C2014165,保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。

【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0028] 實施例1.單克隆抗體的制備
[0029] 步驟1、免疫動物
[0030] 第1天取人MPO抗原（P257-5,購自英國SCIPAC Ltd公司）按80 μ g/只與等體 積的弗氏完全佐劑混勻并充分乳化，腹腔注射3只6周齡與骨髓瘤細胞同種系的雌性BALB/ c小鼠（南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）。第21天，1%戊巴比妥鈉10yL/g腹腔麻醉小鼠， 打開腹腔并暴露脾臟，取40 μ g MPO溶于100 μ L無菌PBS中，以彎頭鑷輕輕提起脾臟尾端 系膜，用胰島素注射器從脾臟尾端注入脾臟，每次注射后停滯30s以防回流，放回脾臟并分 層縫合。第24天，小鼠剪尾采血用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測免疫小鼠血清中MPO多克 隆抗體的效價，效價高則進行細胞融合。
[0031] 步驟2、細胞融合
[0032] 無菌制備上述步驟1免疫小鼠脾細胞懸液，與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0(購自中 科院上海細胞庫）以6:1的比例在PEG(購自Sigma公司）作用下融合，融合按常規(guī)法 (Nature. 1975 ;256:495-497)進行，用ImL PEG，1分鐘內(nèi)緩慢加完，反應(yīng)時間為90秒，無血 清的DMEM(購自Gibco BRL公司）培養(yǎng)基終止反應(yīng)，IOOOrpm離心lOmin，HAT (H次黃嘌呤、A 氨基蝶呤、T胸腺嘧啶核苷，購自Gibco BRL公司）完全DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至I X IO6/ mL，加入已預(yù)先鋪有飼養(yǎng)細胞（BALB/c小鼠的腹腔巨噬細胞）的96孔培養(yǎng)板，100 μ L/孔， 37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天觀察并換液，10天后以HT DMEM(GibC〇 BRL公司）培 養(yǎng)基換液，1周后換為完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0033] 步驟3、間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞
[0034] 用1^0抗原（?257-5，1.4 48/1^)包被96孔酶標(biāo)板，41：過夜；3%牛血清白蛋 白（BSA)封閉，4°C過夜，加入上述步驟2制得的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，37°C孵育1小時， SP2/0培養(yǎng)上清為陰性對照；堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(購自Sigma公司）37°C孵育1 小時；PNPP底物顯色10min，0. 2mol/L NaOH終止反應(yīng)。每步完成均用含0. 05% Tween 20 的 PBS 充分洗漆，Ultra Microplate Reader (EL808Ultra Microplate Reader BI0-TEK Instruments, Inc.，Winooski, VT)測OD 405值。挑選所測的OD 405比陰性對照高10倍的 孔，進行亞克隆化，
[0035] 并進行擴增凍存。
[0036] 步驟4、陽性雜交瘤細胞的克隆化-采用有限稀釋法
[0037] 將上述步驟3篩選得到的細胞用HT DMEM培養(yǎng)基稀釋至每孔1個細胞，鋪于U型 96孔細胞培養(yǎng)板，4小時內(nèi)光鏡下觀察每孔實際細胞數(shù)，記錄單個細胞孔，待其長成克隆且 ELISA鑒定抗體分泌呈陽性，即獲得單克隆抗體分泌株，大量擴增并凍存，長期傳代培養(yǎng)后， 以相同的方法再次克隆化并鑒定，從而獲得了穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株三株， 培養(yǎng)上清間接ELISA法測定抗體效價大于10 2。雜交瘤細胞染色體核型示細胞染色體數(shù)目 大于100條，符合雜交瘤細胞染色體核型。
[0038] 步驟5、抗體獲得
[0039] 雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，用細胞數(shù)IO6/只接種BALB/c小鼠，體內(nèi)誘生法制備單抗腹 水，腹水效價大于1〇 5。腹水用Protein A親和層析純化后獲得濃度為3-5mg/mL的抗體溶 液。純化的單抗SDS-PAGE電泳呈現(xiàn)明顯的兩條帶，分子量分別約為50000和25000,與IgG 輕鏈和重鏈位置一致。Western blot鑒定與購買的Hytest公司標(biāo)準(zhǔn)MP0(8M80,來源于人 白細胞）能特異性結(jié)合。見附圖2。
[0040] 實施例2、MPO-ISA方法的建立和條件優(yōu)化
[0041] 步驟1、MPO-ISA方法建立的背景
[0042] 具活性的MPO在體外亦具有過氧化物酶活性，可直接用于酶活性法檢測（J Immunol Methods. 1990 ; 126 (1) : 125-133)，因此 ELISA 檢測方法中 MPO 可能會干擾 HRP 系 統(tǒng)的檢測，影響檢測結(jié)果。我們用間接ELISA法比較HRP (辣根過氧化物酶）系統(tǒng)和AP (堿 性磷酸酶）系統(tǒng)檢測MPO進行了驗證。以MPO抗原（P257-5, 1. 4 μ g/mL)包板，一抗采用抗 人 MPO 單克隆抗體 18B7,分為 0ng/mL、8. lng/mL、81ng/mL、810ng/mL 四組，37°C溫育 Ih,然 后再分別以HRP標(biāo)記二抗A0168 (1:2000)，AP標(biāo)記二抗A3562 (I :5000)，顯色。結(jié)果可見附 圖3, HRP系統(tǒng)檢測光密度值明顯高于AP系統(tǒng)，不加抗體（即Ong/mL) HRP顯色光密度值明 顯增高，說明包被MPO可干擾HRP系統(tǒng)的檢測，影響檢測結(jié)果。據(jù)此，我們設(shè)想建立MPO免 疫吸附法（MPO-ISA):利用一株抗MPO單抗對標(biāo)本中MPO進行捕捉，隨后利用MPO自身酶活 性進行顯色，系統(tǒng)中不再引入HRP酶聯(lián)抗體，避免影響檢測結(jié)果。
[0043] 步驟2、抗體選擇
[0044] 分別用包被液稀釋三株實施例1制備的MPO單克隆抗體，濃度為10 μ g/mL，每孔 200 μ L，4°C包被過夜；常規(guī)方法洗滌與封閉后備用。用市售武漢華美生物⑶SABIO公司已 包被MPO抗體酶標(biāo)條及備用的MPO單抗酶標(biāo)條，加入人白細胞裂解液（從全血中提取人白 細胞，反復(fù)凍融四次得到含MPO的白細胞裂解液，用0.5%牛血清白蛋白PBS稀釋1 :50? I :1600)，200 μ L/ 孔，置 37°C孵育 2h，洗滌 5 次；分別加 TMB 液（Sigma, St. Louis, MO, USA) 顯色20分鐘。終止液終止后450nm讀取吸光度（A)值，比較不同抗體A值與人白細胞裂解 液MPO濃度關(guān)系（附圖4)。其中一株自制抗體及市售抗體顯色無變化，提示此兩株抗體不 能吸附人白細胞裂解液ΜΡ0,或者是其與MPO的結(jié)合影響了 MPO的酶活性。另外兩株抗體包 被酶標(biāo)板后能吸附人白細胞裂解液ΜΡ0,且不影響MPO酶活性，選擇其中一株抗體mcml作 為MPO-ISA吸附抗體，其分泌的雜交瘤細胞株MCMl于2014年9月10日保藏在中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :C2014165。亞型測定mcml為IgGl型。
[0045] 步驟3、抗體包被濃度選擇
[0046] 用包被液將抗人MPO單克隆抗體mcml(CCTCC NO :C2014165)稀釋成20、10、5、2· 5 和1.25 μ g/mL 5個濃度，包被酶標(biāo)板。檢測不同濃度梯度的MPO (0、31.25、62. 5、125、250、 500ng/mL)，TMB顯色37°C孵育20min。終止液終止后450nm讀取吸光度（A)值，經(jīng)Sigmoidal 擬合，以同一濃度的MPO的A值達到飽和的抗體濃度為最適包被抗體濃度。結(jié)果顯示同一 濃度的MPO檢測A值隨包被抗體濃度的增加逐漸增加（附圖5)，至抗體為10 μ g/mL A值接 近飽和，最佳抗體濃度為10 μ g/mL。
[0047] 步驟4、孵育時間選擇
[0048] 用包被MPO單克隆抗體mcml (CCTCC NO :C2014165)的酶標(biāo)板，加入濃度為125ng/ mL ΜΡ0,分別 37°C孵育 60min、90min、120min、150min。加 TMB 液 37°C顯色 20min，終止液終 止后450nm讀取吸光度（A)值進行比較，結(jié)果顯示當(dāng)孵育時間增加到120min時，其A值增 加很大，再延長孵育時間，A值變化平緩，最佳孵育時間選擇120min，見附圖6A。
[0049] 步驟5、顯色時間選擇
[0050] 用包被MPO單克隆抗體mcml (CCTCC NO :C2014165)的酶標(biāo)板，加入濃度為125ng/ mL MPO 孵育 120min 后，加 TMB 37°C分別孵育 10min、20min、30min、40min、50min、60minj* 止液終止后450nm讀取吸光度（A)值進行比較，結(jié)果顯示，10?20min范圍，A值逐漸增加， 20min后逐漸降低，最佳顯色時間選擇20min，見附圖6B。
[0051] 實施例3、MPO-ISA方法性能評估
[0052] 步驟1、標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0053] 用0.5%牛血清白蛋白PBS稀釋MPO標(biāo)準(zhǔn)品（8M80,來源于人白細胞，購自芬 蘭 Hytest, Ltd.公司），濃度范圍為 1. 95、3· 9、7· 8、15· 6、3L 25、62. 5、125、250ng/mL， 用實施例2建立的MPO-ISA方法檢測。以濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。結(jié)果顯示MPO標(biāo)準(zhǔn)線性范圍為0?250ng/mL，見附圖7, Y = 0. 0104X-0. 0104，r2 = 0· 9989, ρ〈0· 0001)。MPO-ISA最低檢測限濃度為3. 68ng/mL，是依據(jù)由20次0值標(biāo)本A值 的平均值+3SD所對應(yīng)的MPO濃度計算而得。
[0054] 步驟2、方法回收率
[0055] 將MPO濃度為31. 25和125ng/mL的標(biāo)本，分別與MPO標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為50、200、 500ng/mL)按體積比為9:1混合，用實施例2建立的MPO-ISA方法測定其混合液的濃度， 依據(jù)測定值與理論值，計算回收率。結(jié)果顯示MPO-ISA的回收率90. 99?107. 07%，平均 101. 02%，具體數(shù)據(jù)見表1。
[0056] 表 I MPO-ISA 方法回收率（η = 4)

【權(quán)利要求】
1. 一種基于免疫反應(yīng)及自身酶活性的髓過氧化物酶檢測方法，其特征在于在酶標(biāo)板 上包被經(jīng)選擇的髓過氧化物酶單克隆抗體，利用酶標(biāo)板包被的髓過氧化物酶單克隆抗體與 待測樣品中髓過氧化物酶的特異性結(jié)合，通過吸附的髓過氧化物酶直接對底物TMB催化作 用，實現(xiàn)對樣品中髓過氧化物酶的定量檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的髓過氧化物酶檢測方法，其特征在于所述的髓過氧化物酶單 克隆抗體為髓過氧化物酶單克隆抗體mcml，由雜交瘤細胞株MCMl分泌，雜交瘤細胞株MCMl 于2014年9月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :C2014165。
3. -株用于髓過氧化物酶檢測的雜交瘤細胞株MCMl，于2014年9月10日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :C2014165。
4. 用于髓過氧化物酶定量檢測的單克隆抗體mcml，其特征在于由權(quán)利要求3所述的雜 交瘤細胞株MCMl分泌。
5. 權(quán)利要求3所述的雜交瘤細胞株、權(quán)利要求4所述的單克隆抗體在制備髓過氧化物 酶檢測試劑中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求3所述的雜交瘤細胞株、權(quán)利要求 4所述的單克隆抗體在制備髓過氧化物酶定量檢測試劑中的應(yīng)用。
7. -種髓過氧化物酶定量檢測試劑盒，其特征在于含有包被所述的髓過氧化物酶單克 隆抗體mcml的固相材料。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述的固相材料選自酶標(biāo)板、磁性微球、 玻璃珠。
【文檔編號】G01N33/577GK104316689SQ201410584670
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】卞智萍, 陳相健, 顧春榮, 吳恒芳, 徐晉妉, 楊笛 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院