一種采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法，其包括以下步驟：a、選擇電泳芯片；b、抽取血清或者血漿樣品；c、樣品稀釋及染料預(yù)染；d、將10μL電泳凝膠介質(zhì)加入至電泳芯片的緩沖池內(nèi)，用1mL針筒空氣加壓至電泳芯片的樣品鏈接和分離管道；e、電泳芯片的樣品池加入10μL稀釋及預(yù)染的血清或者血漿樣品；f、將加樣后的電泳芯片放在微流控芯片檢測儀上進行微流控芯片自動電泳；g、計算機對微流控芯片檢測儀所得到的結(jié)果進行自動處理分析。通過上述工藝步驟設(shè)計，本發(fā)明能夠簡便、快速且自動化地完成高密度脂蛋白亞型和低密度脂蛋白亞型分離作業(yè)，進而有助于更加準(zhǔn)確評估心血管疾病診斷和指導(dǎo)治療。
【專利說明】一種采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]微流芯片技術(shù)，通常稱為芯片上實驗室，是指在芯片上很小的體積內(nèi)能進行迅速復(fù)雜生物樣品分析。一個芯片上實驗室系統(tǒng)通常整合自動化和數(shù)字化定量和定性多種生物化學(xué)分析于一個容易使用的儀器工作平臺之內(nèi)。結(jié)合有機合成和生物化學(xué)技術(shù)，微流芯片儀器現(xiàn)開始集成電子，光學(xué)和物理測量與微流體特征一起組成新的基于芯片功能的技術(shù)系統(tǒng)。微流芯片技術(shù)的優(yōu)點包括快速，敏感，準(zhǔn)確，節(jié)省試劑，可自動化和容易操作等。微流芯片技術(shù)發(fā)展正促使超敏感臨床醫(yī)學(xué)快速分子診斷的形成和應(yīng)用。
[0003]大量研究一致認為異常油脂新陳代謝對冠狀動脈病(冠心病)的發(fā)病原理有重要作用，例如過高的低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯(TG)血清水平以及低的高密度脂蛋白(HDL)血清水平，都預(yù)示有高的心血管疾病發(fā)病風(fēng)險；盡管這些脂蛋白在冠心病發(fā)病中的重要性，但在個體之中，影向心血管事件和冠心病程度有很大的不同，例如，盡管總高密度脂蛋白和總低密度脂蛋白水平都正常，患者仍然發(fā)作心臟病。實際上，超過一半冠心病突發(fā)病人(譬如心肌梗塞)或者不穩(wěn)定的心膠痛病人，他們的總膽固醇(總低密度脂蛋白和總高密度脂蛋白)都在正常范圍，這說明僅測量總膽固醇(總低密度脂蛋白總高密度脂蛋白)并不能準(zhǔn)確估計心血管疾病的風(fēng)險。
[0004]這些可變性也許一部分可歸結(jié)于這些脂蛋白的高度功能復(fù)雜性和非均勻性。血清脂蛋白主要有三個亞型(classes):高密度脂蛋白(HDL)、LDL (低密度脂蛋白)以及VLDL(非常低密度脂蛋白)，而每個脂蛋白亞型，通過適當(dāng)?shù)姆蛛x手段，可以進一步分成它的亞組分(sub-fract1ns)，這些脂蛋白亞型的主要不同在于它們的微粒直徑、密度以及油脂構(gòu)成；因而，每個脂蛋白亞型可能致動脈粥樣硬化程度亦不同，例如高密度脂蛋白被認為是好的膽固醇，它通過在血管壁逆轉(zhuǎn)運膽固醇，抑制炎癥和抗生物氧化反應(yīng)起保護心臟作用，但是HDL包含幾種亞組分，即顆粒較大和輕的HDL2以及顆粒較小的HDL3;累積證據(jù)顯示顆粒較大的HDL2提供主要的防護作用，顆粒小的HDL3具體功能依然不完全明了，但有資料顯示過高的HDL3可能對心血管疾病有害；同樣的，LDL(低密度脂蛋白)在超速離心處理和梯度膠凝電泳法中可辨認出至少有五種顆粒亞組分和至少有二種LDL表現(xiàn)型:表現(xiàn)型A，主要由大而輕的LDL顆粒組成(顆粒大于25.5 nm)；表現(xiàn)型B，為小而密集的LDL微粒(顆粒小于25.5 nm)組成；但只有LDL表現(xiàn)型B與增加心血管疾病發(fā)病率密切相關(guān)。
[0005]因此，對脂蛋白亞組分進行精細分析并進一步分離高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)能提供更可靠和準(zhǔn)確的心血管疾病的預(yù)測、診斷以及治療。
[0006]分離血脂蛋白亞類作為心血管疾病的研究已進行幾十年，幾種常用方法包括密度梯度高速離心分析法(Analytical and Density Gradient Ultracentrifugat1n,AD⑶C)、梯度膠凝電泳分析法(Gradient Gel Electrophoresis, GGE)、管膠凝體電泳法(Tube Gel Electrophoresis, TGE)、核磁共振光譜分析法(核磁共振)、高性能液相色譜分析法(HPLC)以及垂直自動分離法(Vertical Auto Profile, VAP)。
[0007]梯度膠凝電泳分析法(GGE)已被臨床實驗室應(yīng)用于分離HDL亞型和LDL亞型近三十年；根據(jù)GGE分析，HDL至少可被分成5個亞型，即HDL2a、HDL2b和HDL3a，HDL3b和HDL3c，其中，HDL2b是最大的HDL亞型。據(jù)信HDL2b水平與患者的臨床后果有密切相關(guān)，但其它HDL亞型的臨床意義仍是未知的。
[0008]同樣的，LDL(低密度脂蛋白)也可以用GGE方法定亞型，至少有二種LDL表現(xiàn)型:表現(xiàn)型A，主要由大而輕的LDL顆粒組成(顆粒大于25.5 nm);表現(xiàn)型B，為小而密集的LDL微粒(顆粒小于25.5 nm)組成，LDL表現(xiàn)型B與增加心血管疾病發(fā)病率密切相關(guān)。
[0009]GGE分離脂蛋白亞型根據(jù)脂蛋白微粒的大小，分辨力比較高，但樣品分析很費時且不能自動化；對于分析樣品時間，一個周期通常需要大約一個星期，這種時間長和費力的過程限制了它在臨床診斷實驗室的應(yīng)用。其它方法譬如核磁共振、密度梯度超速離心處理、垂直自動分離法(VAP)以及管膠凝體電泳法，由于設(shè)備昂貴，技術(shù)上挑戰(zhàn)性或費力費時，難以自動化操作和結(jié)果數(shù)碼化的本質(zhì)都難以被廣泛接受應(yīng)用在臨床實驗室。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法，本方法能夠簡便、快速且自動化地完成高密度脂蛋白亞型和低密度脂蛋白亞型分離作業(yè)，進而有助于更加準(zhǔn)確評估心血管疾病診斷和指導(dǎo)治療。
[0011]提供一種采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法，包括有以下步驟:
a、設(shè)計一種電泳芯片:電泳芯片設(shè)置有十字形微管道，十字形微管道包括有橫向微管道以及與橫向微管道交錯布置的縱向微管道，橫向微管道包括有位于縱縱向微管道左端側(cè)的左橫向微管道以及位于縱向微管道右端側(cè)的右橫向微管道，縱向微管道的前端延伸至橫向微管道的前端側(cè)，左橫向微管道、右橫向微管道的末端分別設(shè)置有朝后延伸且與縱向微管道平行布置的平行段，各平行段的末端分別設(shè)置有至少兩條分支微管道，各分支微管道的末端以及縱向微管道的前端分別設(shè)置有樣品池，左橫向微管道、右橫向微管道的中部分別設(shè)置有朝后延伸的支向微管道，各支向微管道的末端分別設(shè)置有緩沖池，縱向微管道的后端設(shè)置有廢液池，在廢液池的前部縱向微管道上設(shè)置有檢測點；連通樣品池和廢液池之間的微管道構(gòu)成進樣通道；連通緩沖池和廢液池之間的微管道構(gòu)成分離通道；
b、抽取血清或者血漿樣品；
C、樣品稀釋及染料預(yù)染:取5 PL血漿或者血清樣品，用凝膠電泳緩沖液進行1:50倍稀釋且預(yù)染5分鐘,凝膠電泳緩沖液由250 mmol/L的緩沖液與5Mmol/L的脂蛋白染料組成；
d、將1PL電泳凝膠介質(zhì)通過電泳芯片的分離通道加入緩沖池內(nèi)，用ImL針筒空氣加壓至電泳芯片的進樣通道和分離通道，電泳凝膠介質(zhì)由200 mmol/L的緩沖液、濃度為0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%或者10%的多聚體凝膠體、0.15 Mmol/L的脂蛋白染料組成；
e、通過電泳芯片的進樣通道對樣品池加入10PL稀釋及預(yù)染的血清或者血漿樣品；
f、將加樣后的電泳芯片放在微流控芯片檢測儀上進行微流控芯片自動電泳； g、計算機對微流控芯片檢測儀所得到的結(jié)果進行自動處理分析。
[0012]在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法中，所述凝膠電泳緩沖液以及所述電泳凝膠介質(zhì)中的緩沖液為TE緩沖液或者N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸，且緩沖液的PH值可在下列數(shù)值中選擇:7.0、7.5、8.0或者8.5。
[0013]在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法中，所述脂蛋白染料為下列中的一種:蘇丹黑B、l，l'-雙十八烷基_3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽、1，1'-雙十八烷基_3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰花青，4-氯苯鹽或者C6-NBD神經(jīng)酰胺。
[0014]在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法中，所述多聚體凝膠體為下列中的一種:聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧化乙烯、聚N，N- 二甲基丙烯酰胺或者羥基纖維素。
[0015]在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法中，所述微管道的橫截面呈方形，其深度可在下列范圍內(nèi)選擇:8?35 μ m，寬度可在下列范圍內(nèi)選擇:50?150 μ m0
[0016]本發(fā)明提供的方法，步驟簡單，速度快，能夠簡便、快速且自動化地完成高密度脂蛋白亞型和低密度脂蛋白亞型分離作業(yè)，進而有助于更加準(zhǔn)確評估心血管疾病診斷和指導(dǎo)治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明方法中電泳芯片的構(gòu)造圖。

【具體實施方式】
[0018]參照圖1所示:
設(shè)計一種采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法，包括有以下步驟:a、設(shè)計一種電泳芯片:電泳芯片設(shè)置有十字形微管道，十字形微管道包括有橫向微管道5以及與橫向微管道5交錯布置的縱向微管道9，橫向微管道5包括有位于縱縱向微管道9左端側(cè)的左橫向微管道8以及位于縱向微管道9右端側(cè)的右橫向微管道7，縱向微管道9的前端延伸至橫向微管道5的前端側(cè)，左橫向微管道8、右橫向微管道7的末端分別設(shè)置有朝后延伸且與縱向微管道9平行布置的平行段10、11，各平行段的末端分別設(shè)置至少兩條分支微管道12、13，各分支微管道的末端以及縱向微管道9的前端分別設(shè)置有樣品池1，左橫向微管道8、右橫向微管道7的中部分別設(shè)置有朝后延伸的支向微管道14，各支向微管道14的末端分別設(shè)置有緩沖池2，縱向微管道9的后端設(shè)置有廢液池3，在廢液池3的前部縱向微管道9上設(shè)置有檢測點4 ;連通樣品池I和廢液池3之間的微管道構(gòu)成進樣通道；連通緩沖池2和廢液池3之間的微管道構(gòu)成分離通道；為提高分離效果，可將分離通道的形狀設(shè)置成S形，相當(dāng)于延長了分離通道的長度。
[0019]b、抽取血清或者血漿樣品；
C、樣品稀釋及染料預(yù)染:取5 PL血漿或者血清樣品，用凝膠電泳緩沖液進行1:50倍稀釋且預(yù)染5分鐘,凝膠電泳緩沖液由250 mmol/L的緩沖液與5Mmol/L的脂蛋白染料組成；
d、將1PL電泳凝膠介質(zhì)通過電泳芯片的分離通道加入緩沖池內(nèi)，用ImL針筒空氣加壓至電泳芯片的進樣通道和分離通道，電泳凝膠介質(zhì)由200 mmol/L的緩沖液、濃度為0.1%、
0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%或者10%的多聚體凝膠體、0.15 μπιοΙ/L的脂蛋白染料組成；
e、通過電泳芯片的進樣通道對樣品池加入10PL稀釋及預(yù)染的血清或者血漿樣品；
f、將加樣后的電泳芯片放在微流控芯片檢測儀上進行微流控芯片自動電泳；
g、計算機對微流控芯片檢測儀所得到的結(jié)果進行自動處理分析。
[0020]在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法中，所述凝膠電泳緩沖液以及所述電泳凝膠介質(zhì)中的緩沖液為TE緩沖液或者N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸，且緩沖液的PH值可在下列數(shù)值中選擇:7.0、7.5、8.0、8.5。
[0021]在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法中，所述脂蛋白染料為下列中的一種:蘇丹黑B、l，l'-雙十八烷基_3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽、1，1'-雙十八烷基_3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰花青，4-氯苯鹽或者C6-NBD神經(jīng)酰胺。
[0022]在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法中，所述多聚體凝膠體為下列中的一種:聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧化乙烯、聚N，N- 二甲基丙烯酰胺或者羥基纖維素。
[0023]在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法中，所述微管道的橫截面呈方形，其深度可在下列范圍內(nèi)選擇:8?35 μ m，寬度可在下列范圍內(nèi)選擇:50?150 μ m0
【權(quán)利要求】
1.一種采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法，其特征在于，包括有以下步驟: a、設(shè)計一種電泳芯片:電泳芯片設(shè)置有十字形微管道，十字形微管道包括有橫向微管道以及與橫向微管道交錯布置的縱向微管道，橫向微管道包括有位于縱縱向微管道左端側(cè)的左橫向微管道以及位于縱向微管道右端側(cè)的右橫向微管道，縱向微管道的前端延伸至橫向微管道的前端側(cè)，左橫向微管道、右橫向微管道的末端分別設(shè)置有朝后延伸且與縱向微管道平行布置的平行段，各平行段的末端分別設(shè)置與至少兩條分支微管道，各分支微管道的末端以及縱向微管道的前端分別設(shè)置有樣品池，左橫向微管道、右橫向微管道的中部分別設(shè)置有朝后延伸的支向微管道，各支向微管道的末端分別設(shè)置有緩沖池，縱向微管道的后端設(shè)置有廢液池，在廢液池的前部縱向微管道上設(shè)置有檢測點；連通樣品池和廢液池之間的微管道構(gòu)成進樣通道；連通緩沖池和廢液池之間的微管道構(gòu)成分離通道； b、抽取血清或者血漿樣品； C、樣品稀釋及染料預(yù)染:取5 PL血漿或者血清樣品，用凝膠電泳緩沖液進行1:50倍稀釋且預(yù)染5分鐘,凝膠電泳緩沖液由250 mmol/L的緩沖液與5Mmol/L的脂蛋白染料組成； d、將1PL電泳凝膠介質(zhì)通過電泳芯片的分離通道加入緩沖池內(nèi)，用ImL針筒空氣加壓至電泳芯片的進樣通道和分離通道，電泳凝膠介質(zhì)由200 mmol/L的緩沖液、濃度為0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%或者10%的多聚體凝膠體、0.15 μπιοΙ/L的脂蛋白染料組成； e、通過電泳芯片的進樣通道對樣品池加入10PL稀釋及預(yù)染的血清或者血漿樣品； f、將加樣后的電泳芯片放在微流控芯片檢測儀上進行微流控芯片自動電泳； g、計算機對微流控芯片檢測儀所得到的結(jié)果進行自動處理分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法，其特征在于:所述凝膠電泳緩沖液以及所述電泳凝膠介質(zhì)中的緩沖液為TE緩沖液或者N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸，且緩沖液的PH值可在下列數(shù)值中選擇:7.0、7.5、8.0或者8.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法，其特征在于:所述脂蛋白染料為下列中的一種:蘇丹黑B、l，I'-雙十八烷基_3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽、1，I'-雙十八烷基_3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰花青，4-氯苯鹽或者C6-NBD神經(jīng)酰胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法，其特征在于:所述多聚體凝膠體為下列中的一種:聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧化乙烯、聚N，N- 二甲基丙烯酰胺或者羥基纖維素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法，其特征在于:所述微管道的橫截面呈方形，其深度可在下列范圍內(nèi)選擇:8?35 μ m，寬度可在下列范圍內(nèi)選擇:50?150 μ m。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亞型精細亞組分的方法，其特征在于:所述分離通道的形狀設(shè)置成S形結(jié)構(gòu)。
【文檔編號】G01N27/447GK104297327SQ201410590606
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】鄧杏飛 申請人:鄧杏飛