基于新型納米復(fù)合材料的葡萄糖安培檢測器的制備和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種葡萄糖安培檢測器的制備和使用方法，該傳感器包括：碳納米管、鉑納米顆粒、聚合離子液體膜和葡萄糖氧化酶修飾的玻碳電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，甘汞電極為參比電極的三電極體系。檢測時(shí)在該三電極體系下，使用電化學(xué)工作站，對(duì)葡萄糖含量進(jìn)行測定。與傳統(tǒng)方法相比，具有更高靈敏度和特異性，檢測限低至1X10-7mol/L；同時(shí)，葡萄糖傳感器制備簡單、性能穩(wěn)定且可重復(fù)利用、樣品檢測時(shí)間短，操作方便。
【專利說明】基于新型納米復(fù)合材料的葡萄糖安培檢測器的制備和使用 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于鉑納米顆粒/離子液體聚合物膜-碳納米管的新型納米復(fù)合 材料的靈敏、快速、特異性的葡萄糖傳感器的制備和使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是目前全世界普遍存在的一類疾病，檢測人體血液中的葡萄糖含量對(duì)糖尿 病的診斷和控制非常重要。自從1%2年第一個(gè)葡萄糖酶電極成功構(gòu)建，到現(xiàn)在已開發(fā)出各 種類型的葡萄糖電化學(xué)生物傳感器。其中，以檢測電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物雙氧水為原理的葡萄糖 安培檢測器由于具有較好的靈敏度，選擇性，穩(wěn)定性，重現(xiàn)性，容易實(shí)現(xiàn)微型化等優(yōu)點(diǎn)而受 到廣泛關(guān)注。在葡萄糖安培檢測器的電極制備材料方面，由于碳納米管（CNTs)電子導(dǎo)電性 好，面積/體積比高，以及對(duì)電子傳遞的獨(dú)特的促進(jìn)作用，已經(jīng)在電化學(xué)生物傳感器中得到 了很好的應(yīng)用。CNTs修飾的電極可以催化兒茶酚，過氧化氫（H 202)，多巴胺，抗壞血酸，尿 酸，葡萄糖氧化酶（GOD)，等物質(zhì)在電極上的電化學(xué)反應(yīng)。酶與底物在氧氣的存在下反應(yīng)會(huì) 產(chǎn)生H 202，而鉑納米顆粒（PtNPs)對(duì)H202具有出色的催化活性，因?yàn)镻tNPs可以降低H 202的 氧化/還原過電位。，因此，PtNPs修飾的電極已經(jīng)頻繁地用于構(gòu)建安培酶生物傳感器。然 而，為了提高在Pt少量負(fù)載情況下的安培酶生物傳感器的性能，在CNT表面獲得高分散的 金屬顆粒仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。
[0003] 另一方面，由有機(jī)陰離子和無機(jī)陽離子組成的室溫離子液體作為修飾物質(zhì)已經(jīng)在 生物傳感器的構(gòu)造中廣泛使用。通常，離子液體單體是用物理方法混合至復(fù)合物中并固定 到電極上的，但由于它們?cè)谌芤褐腥芙庑院芎?，所以很容易流失，本發(fā)明基于聚合離子液體 修飾的CNTs (PIL-CNTs)材料，得到了 一種在PIL-CNTs表面制備高分散，粒徑分布窄的Pt 納米顆粒的方法。采用這種新型納米復(fù)合材料，以葡萄糖氧化酶（GOD)為模型酶，構(gòu)建了一 個(gè)具有優(yōu)異性能的葡萄糖安培傳感器。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種靈敏、快速、特異性的葡糖糖傳感器的制備及使用方法。
[0005] 一種葡萄糖檢測傳感器，包括：碳納米管、鉑納米顆粒、離子液體聚合膜和葡糖糖 氧化酶修飾的玻碳電極為工作電極，鉬絲為對(duì)電極，甘汞電極為參比電極的三電極體系。
[0006] 所述的碳納米管、鉑納米顆粒、離子液體聚合膜和葡糖糖氧化酶修飾的玻碳電極 的制備方法如下： 將200 mg CNTs加入到含有1-乙烯基-3-乙基四氟硼酸鹽[VEIM]BF4(200-220 mg)和 偶氮二異丁腈AIBN(6-8 mg)的甲醇溶液中，超聲1〇_20分鐘后轉(zhuǎn)移至50 "^的圓底燒瓶內(nèi)， 70-90 〇C且氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流攪拌16小時(shí)。然后將該混合物用二次蒸饋水稀釋，過濾，用丙 酮將一些物理吸附在CNTs表面的聚合物和[VEIM]BF 4單體洗去，干燥得到離子液體聚合物 膜包裹的碳納米管（PIL-CNTs)。
[0007] 20 mg PIL-CNTs 與 650-675 μ? H2PtCl6(38. 6 ηιΜ) -起混合在 20-30 mL 乙二醇 中，用1 Μ KOH將混合液的pH值調(diào)至8-9,超聲30 min，用微波（800 W) 110-130 °C下還原 30 min。將反應(yīng)后的混合液用二次水稀釋，過濾，用二次水和丙酮交替洗滌數(shù)次后干燥得到 PtNPs/PIL-CNTs納米復(fù)合物。
[0008] 將玻碳電極依次在0· 5和0· 05 μπι的氧化鋁漿上打磨至光亮，然后用超純水沖洗 干凈，氮?dú)獯蹈伞?br> [0009] 將Pt納米顆粒/聚合離子液體-碳納米管復(fù)合物（PtNPs/PIL-CNTs)分散在水中， 配成1 mg mL_1的溶液，將此溶液超聲振蕩至分散均勻，然后用移液槍取3-8 μ?的上述溶 液，滴到玻碳電極上，室溫下自然風(fēng)千。然后在修飾了催化劑的電極上滴3-8 μ? G0D，4 °C 下干燥。最后用3-8 PL 1 wt.% Nafion乙醇溶液覆蓋電極表面，防止GOD流失，得到PtNPs/ PIL-CNTs/GC 電極。
[0010] 上述的葡萄糖檢測傳感器的使用方法： 用磷酸緩沖液配制葡萄糖樣品溶液；此后，再以碳納米管、鉑納米顆粒、離子液體聚合 膜和葡糖糖氧化酶修飾的玻碳電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，甘汞電極為參比電極的三 電極體系下，使用電化學(xué)工作站，采用電流-時(shí)間相應(yīng)工作方式，對(duì)不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的葡萄糖 進(jìn)行檢測，制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的測定。
[0011] 上述使用方法中具體是將4mL?20mL、pH值為6-8、濃度為0· 03mol/L~0. 2〇 mol/ L的磷酸緩沖液與4mm〇l~20mm〇l的葡萄糖混合，制備濃度為lmol/L的葡萄糖樣品溶液；然 后每次取1 μ?上述制備好的1 mol/L的葡萄糖樣品溶液，連續(xù)添加到5 mL、pH值為7. 0、 濃度為0. lmol/L的磷酸緩沖液中進(jìn)行測定；檢測時(shí)，在磁力攪拌速率150rmp條件下進(jìn)行。 檢測條件為：運(yùn)用電壓范圍為0. 6 V。
[0012] 本發(fā)明原理如下： 葡萄糖與葡萄糖氧化酶（G0D)發(fā)生酶催化反應(yīng)，葡萄糖氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯，而G0D內(nèi) 的活性中心FAD被還原成FADH2。然后GOD (FADH2)又被溶液中共存的氧氣氧化回GOD (FAD)， 同時(shí)生成過氧化氫（H202)。利用過氧化氫在電極上的電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的電流信號(hào)來指示酶 催化反應(yīng)中葡萄糖的含量，以此原理構(gòu)建的傳感器也叫葡萄糖安培檢測器。
[0013] pH 6-8、濃度為0· 1 mol/L的磷酸緩沖液用作支持電解液。電流-時(shí)間曲線在磁力 攪拌速率150rmp下，電壓于0. 6V下檢測電位測定修飾電極對(duì)葡萄糖溶液的響應(yīng)電流。圖 1 :連續(xù)加入ImM葡萄糖在Pt納米顆粒/聚合離子液體-碳納米管復(fù)合物-葡萄糖氧化酶 修飾電極上的電流響應(yīng)圖，加入不同濃度的葡萄糖可引起圖譜上電流值發(fā)生改變。圖 2: 連續(xù)加入5. 6 mM葡萄糖、0· 1 mM抗壞血酸（AA)和〇· 5 mM尿酸（UA)(箭頭指示）的電流 響應(yīng)曲線。干擾離子對(duì)本分方法檢測葡萄糖影響不大。
[0014] 本發(fā)明中合成的Pt納米顆粒/聚合離子液體-碳納米管復(fù)合物-葡萄糖氧化酶 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，檢測信號(hào)重現(xiàn)性好，電化學(xué)性能突出。PIL的正電荷和GOD (FAD)的負(fù)電荷之間的 靜電作用保持了 G0D的活性，也減緩了 G0D的流失。
[0015] 通過本發(fā)明，我們實(shí)現(xiàn)了對(duì)血清樣中的葡萄糖濃度特異性、快速檢測。與傳統(tǒng)方法 相比，具有更高的靈敏度和特異性，檢測限低至1 X 1(Γ7 mol/L;同時(shí)，葡萄糖傳感器制備簡 單、性能穩(wěn)定且可重復(fù)利用、樣品檢測時(shí)間短、操作方便。綜上，說明本發(fā)明方法是一種靈 敏、快速、特異性的檢測葡糖糖的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1 :連續(xù)加入ImM葡萄糖及不同濃度葡萄糖的電流響應(yīng)曲線； 圖2 :連續(xù)加入5. 6 mM葡萄糖、〇. 1碰抗壞血酸（AA)和0· 5 mM尿酸（UA)(箭頭指示） 的電流響應(yīng)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0018] 利用本發(fā)明我們實(shí)現(xiàn)了對(duì)某醫(yī)院提供的血清樣品中葡萄糖濃度的簡便、快速、特 異性檢測。
[0019] 制備本發(fā)明的葡萄糖傳感器： 將200 mg CNTs加入到含有1-乙烯基-3-乙基四氟硼酸鹽[VEnflBF4(210 mg)和偶氮 二異丁腈AIBN(6. 9 mg)的甲醇溶液中，超聲15分鐘后轉(zhuǎn)移至50 mL的圓底燒瓶內(nèi)，80 °C 且氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流攪拌16小時(shí)。然后將該混合物用二次蒸餾水稀釋，過濾，用丙酮將一些 物理吸附在CNTs表面的聚合物和[VEM]BF 4單體洗去，干燥得到離子液體聚合物膜包裹的 碳納米管（PIL-CNTs)。
[0020] 20 mg PIL-CNTs 與 665 μ? H2PtCl6(38.6 mM)-起混合在 25 mL 乙二醇中，用 1 Μ Κ0Η將混合液的pH值調(diào)至8-9,超聲30 min，用微波（800 W) 120 °C下還原30 min。將反應(yīng)后 的混合液用二次水稀釋，過濾，用二次水和丙酮交替洗滌數(shù)次后干燥得到PtNPs/PIL-CNTs 納米復(fù)合物。
[0021] 將玻碳電極依次在0. 5和0. 05 μηι的氧化鋁漿上打磨至光亮，然后用超純水沖洗 干凈，氮?dú)獯蹈伞?br> [0022] 將Pt納米顆粒/聚合離子液體-碳納米管復(fù)合物（PtNPs/PIL-CNTs)分散在水 中，配成1 mg mL/1的溶液，將此溶液超聲振蕩至分散均勻，然后用移液槍取5 μ?的上述溶 液，滴到玻碳電極上，室溫下自然風(fēng)千。然后在修飾了催化劑的電極上滴5 ML GOD,4 °C 下干燥。最后用4 ML 1 wt.% Nafion乙醇溶液覆蓋電極表面，防止GOD流失，得到PtNPs/ PIL-CNTs/GC 電極。
[0023] 檢測血清中的葡萄糖含量時(shí)以碳納米管、鉑納米顆粒、離子液體聚合膜和葡糖糖 氧化酶修飾的玻碳電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，甘汞電極為參比電極的三電極體系下， 使用電化學(xué)工作站，采用電流-時(shí)間相應(yīng)工作方式，對(duì)不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的葡萄糖進(jìn)行檢測，制 作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。將0. 5 mL血清加入到10 mL PBS (0· 1 M，pH 7· 0)中，檢測電位為〇· 6 V， 記錄響應(yīng)電流，通過之前繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出對(duì)應(yīng)的葡萄糖濃度，結(jié)果顯示在表1中?？梢?發(fā)現(xiàn)，由本章中所制備的電極檢測的血糖濃度與醫(yī)院提供的結(jié)果基本一致。 表丨人體龜清樣a中11菌叇含1的檢S

【權(quán)利要求】
1. 一種葡萄糖安培檢測器，其特征在于，包括：碳納米管、鉬納米顆粒、聚合離子液體 膜和葡萄糖氧化酶修飾的玻碳電極為工作電極，鉬絲為對(duì)電極，甘汞電極為參比電極的三 電極體系。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖安培檢測器，其特征在于，所述的碳納米管、鉬納米顆 粒、聚合離子液體膜和葡萄糖氧化酶修飾的玻碳電極的制備方法如下：將200 mg CNTs加 入到含有1-乙烯基-3-乙基四氟硼酸鹽[VEM]BF4(210. 1 mg)和偶氮二異丁腈AIBN(6. 9 mg)的甲醇溶液中，超聲15分鐘后轉(zhuǎn)移至50 mL的圓底燒瓶內(nèi)，80 °C且氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流攪 拌16小時(shí)；然后將該混合物用二次蒸餾水稀釋，過濾，用丙酮將一些物理吸附在CNTs表面 的聚合物和[呢頂扣匕單體洗去，干燥得到離子液體聚合物膜包裹的碳納米管（PIL-CNTs); 20 mg PIL-CNTs 與 665 μ? H2PtCl6(38. 6 mM) -起混合在 25 mL 乙二醇中，用 1 Μ KOH 將 混合液的pH值調(diào)至8-9,超聲30 min，用微波（800 W) 120 °C下還原30 min ;將反應(yīng)后的 混合液用二次水稀釋，過濾，用二次水和丙酮交替洗滌數(shù)次后干燥得到PtNPs/PIL-CNTs納 米復(fù)合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的葡萄糖安培檢測器，其特征在于：玻碳電極依次在0.5和 0. 05 Mm的氧化鋁漿上打磨至光亮，然后用超純水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈桑粚t納米顆粒/聚 合離子液體-碳納米管復(fù)合物（PtNPs/PIL-CNTs)分散在水中，配成1 mg ml/1的溶液，將此 溶液超聲振蕩至分散均勻，然后用移液槍取5 μ?的上述溶液，滴到玻碳電極上，室溫下自然 風(fēng)干；然后在修飾了催化劑的電極上滴5 PL G0D，4 °C下干燥；最后用4 μ? 1 wt.% Nafion 乙醇溶液覆蓋電極表面，防止GOD流失，得到碳納米管、鉬納米顆粒、聚合離子液體膜和葡 萄糖氧化酶修飾的玻碳電極。
4. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的葡萄糖安培檢測器的使用方法，其特征在于，用磷酸緩 沖液制備葡萄糖樣品溶液；此后再以碳納米管、鉬納米顆粒、聚合離子液體膜和葡萄糖氧化 酶修飾的玻碳電極為工作電極，鉬絲為對(duì)電極，甘汞電極為參比電極的三電極體系下，使用 電化學(xué)工作站；采用電流-時(shí)間響應(yīng)工作方式，對(duì)不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的葡萄糖進(jìn)行檢測，制定標(biāo) 準(zhǔn)工作曲線，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的測定。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的使用方法，其特征在于，將4mL~20mL、pH值為7. 0、濃度為 0· 03mol/L?0· 20 mol/L的磷酸緩沖液與4mmol?20mmol的葡萄糖混合，制備濃度為lmol/L 的葡萄糖樣品溶液；然后每次取1 KL上述制備好的1 mol/L的葡萄糖樣品溶液，連續(xù)添加 到5 mL、pH值為7. 0、濃度為0. lmol/L的磷酸緩沖液中進(jìn)行測定。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的使用方法，其特征在于，檢測時(shí)，在磁力攪拌速率150rmp條件 下進(jìn)行。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的使用方法，其特征在于，檢測條件為：運(yùn)用電壓范圍為0.6 V。
【文檔編號(hào)】G01N27/26GK104297310SQ201410601264
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月1日
【發(fā)明者】吳玲 申請(qǐng)人:吳玲