復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種復方氨基酸（15）雙肽（2）注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量檢測方法，該方法包括精密量取被測樣品及對照品溶液，注入帶磺酸基強酸性陽離子交換樹脂LCAK06/Na柱的色譜儀，通過流動相緩沖液A、B和再生液進行梯度洗脫與再生平衡，以及衍生試劑茚三酮溶液進行柱后衍生反應，在檢測波長為440nm和570nm下記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算。該方法能同時檢測出十五種氨基酸及甘氨酰谷氨酰胺含量，具有低廉、快速及靈敏度高的優(yōu)點，通過周密的方法學驗證，結果表明可用于同時檢測復方氨基酸（15）雙肽（2）注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量，考察穩(wěn)定性樣品中十七種主藥含量的變化。
【專利說明】復方氨基酸（15)雙肽（2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺 含量檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種氨基酸制劑的含量檢測方法，特別是復方氨基酸（15)雙肽⑵注 射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量檢測方法。

【背景技術】
[0002] 復方氨基酸（15)雙肽（2)注射液為15種氨基酸和2種二肽組成的滅菌水溶液， 處方為每 l〇〇〇ml 含有：L-丙氨酸（C3H7N02) 16. 00g，L-精氨酸（C6H14N402) 11. 30g，L-天冬 氨酸（C4H7N04)3.4g，L-谷氨酸（C 5H9N04)5 . 60g，L-組氨酸（C6H9N302)6.80g，L-異亮氨酸 (C 6H13N02) 5 . 60g，L-亮氨酸（C6H13N02)7 . 90g，L-賴氨酸醋酸鹽（C6H14N202 · C2H402) 12. 70g， L_ 蛋氨酸（C5HnN02S) 5. 60g，L-苯丙氨酸（C9HnN02) 5 . 85g，L-脯氨酸（C5H9N02) 6. 80g， L_ 絲氨酸（C3H7N03) 4. 50g，L-蘇氨酸（C4H9N03) 5. 60g，L-色氨酸（CnH12N202) 1. 90g，L-纈氨 酸（C5HnN02)7 . 30g，一水合甘氨酰谷氨酰胺（C7H13N304 · Η20)30· 27g，二水合甘氨酰酪氨酸 3. 45g(相當于甘氨酸0. 94g ;酪氨酸2. 28g)
[0003] 該產(chǎn)品含18種人體必須或非必須氨基酸組成的腸外營養(yǎng)注射劑，根據(jù)患者腸外 營養(yǎng)的需要提供相應的氨基酸，其中甘氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸三種氨基酸以甘氨酸-谷氨 酰胺、甘氨酰-酪氨酸的雙肽形式存在。兩種雙肽（甘氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-酪氨酸） 用于提供谷氨酰胺和酪氨酸以促進蛋白質的合成，在體內(nèi)直接完全分解為甘氨酸、谷氨酰 胺、酪氨酸三種游離氨基酸。
[0004] 由于復方氨基酸（15)雙肽（2)注射液中成分復雜，對其各組分進行定量分析較為 困難。現(xiàn)有技術如中國專利CN103134892A公開了復方氨基酸（15)雙肽（2)注射液的分析 方法，采用高效液相色譜檢測方法，色譜條件為采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反 相色譜柱檢測，檢測波長為265-280nm，流動相由流動相A和流動相B組成，流動相A為甲 醇，流動相B是通過緩沖溶液調節(jié)的pH值2. 0-4. 0的水溶液，但此方法只是測定的色氨酸 和甘氨酰-酪氨酸的含量；葉曉林等人在《復方氨基酸（15)雙肽（2)注射液中兩組分的含 量測定》（中國藥業(yè)，2008年07期）中報道了用反相高效色譜法測定氨基酸（15)雙肽（2) 注射液中兩種多肽，即甘氨酰-谷氨酰胺（GQ)和甘氨酰-酪氨酸（GY)的含量，該文獻公開 的方法，使用乙腈與〇. 〇5mol/L的磷酸二氫鈉溶液作為流動相，采用了梯度淋洗法，并且還 采用了 FDNB進行了柱前衍生化處理，該方法檢測方法復雜，操作步驟多，而且不能同時檢 測出十五中氨基酸的含量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點，提供一種復方氨基酸（15)雙肽（2)注射 液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量檢測方法，該方法能同時檢測出十五種氨基酸及甘氨酰谷 氨酰胺含量，具有低廉、快速及靈敏度高的優(yōu)點，通過周密的方法學驗證，結果表明可用于 同時檢測復方氨基酸（15)雙肽（2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量，考察穩(wěn)定性樣品 中十七種主藥含量的變化。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術方案來實現(xiàn)：復方氨基酸（15)雙肽（2)注射液氨基 酸和甘氨酰谷氨酰胺含量檢測方法，該方法包括精密量取被測樣品及對照品溶液，注入帶 磺酸基強酸性陽離子交換樹脂LCAK06/Na柱的色譜儀，通過流動相緩沖液A、B和再生液進 行梯度洗脫與再生平衡，以及衍生試劑茚三酮溶液進行柱后衍生反應，在檢測波長為440nm 和570nm下記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算；
[0007] 其中，所述流動相緩沖液A的配制為：二水合檸檬酸三鈉11. 8g、檸檬酸6. 0g、乙醇 65ml、37%的鹽酸5. 6ml、辛酸0. lml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，調pH至2?4 ;
[0008] 所述流動相緩沖液B的配制為：二水合檸檬酸三鈉19. 6g、氫氧化鈉3. lg、硼酸 5. 0g、辛酸0. lml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，調pH至10?11 ;
[0009] 所述再生液的配制為：氫氧化鈉20g、EDTAO. 2g置1000ml量瓶中，加水定容至刻 度；
[0010] 所述衍生試劑茚三酮溶液的配制為：取茚三酮2g，加乙醇溶解至100mL。
[0011] 作為優(yōu)選方案，所述流動相緩沖液A的pH為3. 45,流動相緩沖液B的pH為10. 85。
[0012] 作為優(yōu)選方案，所述方法包括以下步驟：
[0013] S1.制備被測樣品溶液：精念'稱取被測樣品5ml，直于50ml各量瓶中，用樣品稀釋 液定容至刻度，搖勻；再精密量取定溶液2ml，用樣品稀釋液定容至100ml，搖勻，即得；所述 樣品稀釋液為取36%鹽酸1. 5ml稀釋至1000ml ;
[0014] S2.制備對照品溶液：精患、稱取對照品，用樣品稀釋液制成每lml中含有門冬氣 酸0· 34mg、谷氨酸0· 56mg、絲氨酸0· 45mg、組氨酸0· 68mg、甘氨酰谷氨酰胺3. 027mg、精氨酸 1. 13mg、蘇氨酸0· 56mg、丙氨酸1. 6mg、脯氨酸0· 68mg、繳氨酸0· 73mg、甲硫氨酸0· 56mg、異 亮氨酸〇. 56mg、亮氨酸0. 79mg、苯丙氨酸0. 585mg、醋酸賴氨酸1. 27mg的對照品溶液；所述 樣品稀釋液為取36%鹽酸1. 5ml稀釋至1000ml ;
[0015] S3.上樣、分離及梯度洗脫：分別將待測樣品溶液和對照品溶液20 μ 1注入色譜 儀，通過流動相緩沖液A、Β和再生液進行梯度洗脫與再生平衡，于高溫反應器中采用衍生 試劑茚三酮溶液進行柱后衍生反應，在檢測波長為440nm和570nm下記錄色譜圖，按外標法 以峰面積計算；
[0016] 其中，色譜儀的色譜條件為：帶磺酸基強酸性陽離子交換樹脂LCAK06/Na柱；高 溫反應器溫度為：130°C ;茚三酮流速：0. 25ml/min ;茚三酮停止時間：47min ;采集時間： 50min ;流動相緩沖液A的流速：0. 45ml/min ;流動相緩沖液B的流速：0. 45ml/min ;再生液 的流速：〇. 45ml/min ;氨基酸分析柱溫：57?74°C。
[0017] 所述按外標法以峰面積計算公式為供試品標示含量（％) =(供試品溶液峰面積 /標準品溶液峰面積）X 100%。
[0018] 本發(fā)明中測定的氨基酸為：門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈 氨酸、甘氨酰谷氨酰胺（簡稱GQ)、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、醋酸賴 氨酸、精氨酸。
[0019] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明使用普通的磺酸基強酸性陽離子交換樹脂為色譜柱 填充劑，設備要求不高，流動相選用兩個介質普通易得，可行性高，操作過程簡單方便，重復 性好，樣品分析時間短，只需要約62分鐘，能同時檢測出十五種氨基酸及甘氨酰谷氨酰胺 含量，通過周密的方法學驗證，結果表明可用于同時檢測復方氨基酸（15)雙肽（2)注射液 氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量，考察穩(wěn)定性樣品中十七種主藥含量的變化。

【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的描述，本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所 述：
[0021] 實施例1 :
[0022] 1.測定條件
[0023] 儀器：德國sykam公司的S-433D氨基酸分析儀。
[0024] 色譜柱：采用陽離子交換色譜柱LCAK06/Na(4. 6X 150mm)磺酸基強酸性陽離子交 換樹脂
[0025] 2.測定法
[0026] S1.制備流動相緩沖液、再生液及衍生試劑
[0027] A.述流動相緩沖液A的配制為：二水合檸檬酸三鈉11. 8g、檸檬酸6. 0g、乙醇 65ml、37 %的鹽酸5. 6ml、辛酸0. lml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，調pH至2?4 ;
[0028] B.流動相緩沖液B的配制為：二水合檸檬酸三鈉19. 6g、氫氧化鈉3. lg、硼酸 5. 0g、辛酸0. lml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，調pH至10?11 ;
[0029] C.再生液的配制為：氫氧化鈉20g、EDTA0. 2g置1000ml量瓶中，加水定容至刻度；
[0030] D.衍生試劑茚三酮溶液的配制為：取茚三酮2g，加乙醇使溶解成100mL，即得。
[0031] S2.制備被測樣品溶液：精密稱取被測樣品5ml (生產(chǎn)廠商：四川科倫藥業(yè)股份有 限公司，生產(chǎn)批號為：H14092501)，置于50ml容量瓶中，用樣品稀釋液定容至刻度，搖勻；再 精密量取定溶液2ml，用樣品稀釋液定容至100ml，搖勻，即得；所述樣品稀釋液為取36%鹽 酸1. 5ml稀釋至1000ml ;
[0032] S3.制備對照品溶液：精密稱取對照品門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨 酸、丙氨酸、纈氨酸、甘氨酰谷氨酰胺（簡稱GQ)、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、 組氨酸、醋酸賴氨酸、精氨酸，用樣品稀釋液制成每lml中含有門冬氨酸0.34mg、谷氨酸 0· 56mg、絲氨酸0· 45mg、組氨酸0· 68mg、甘氨酰谷氨酰胺3. 027mg、精氨酸1. 13mg、蘇氨酸 0· 56mg、丙氨酸1. 6mg、脯氨酸0· 68mg、繳氨酸0· 73mg、甲硫氨酸0· 56mg、異亮氨酸0· 56mg、 亮氨酸〇. 79mg、苯丙氨酸0. 585mg、醋酸賴氨酸1. 27mg的對照品溶液；所述樣品稀釋液為取 36 %鹽酸1. 5ml稀釋至1000ml ;
[0033] S4.上樣、分離及梯度洗脫：分別將待測樣品溶液和對照品溶液20 μ 1注入色譜 儀，通過流動相緩沖液A、Β和再生液進行梯度洗脫與再生平衡，于高溫反應器中采用衍生 試劑茚三酮溶液進行柱后衍生反應，在檢測波長為440nm和570nm下記錄色譜圖，按外標法 以峰面積計算，計算公式為：
[0034] 供試品標示含量（％) =(供試品溶液峰面積/標準品溶液峰面積）X 100%
[0035] 其中，色譜儀的色譜條件為：帶磺酸基強酸性陽離子交換樹脂LCAK06/Na柱；高 溫反應器溫度為：130°C ;茚三酮流速：0. 25ml/min ;茚三酮停止時間：47min ;采集時間： 50min ;流動相緩沖液A的流速：0. 45ml/min ;流動相緩沖液B的流速：0. 45ml/min ;再生液 的流速：〇. 45ml/min ;氨基酸分析柱溫：57?74°C。
[0036] 柱溫程序如表1所示，泵梯度如表2所示。
[0037] 表1 :柱溫程序

【權利要求】
1. 復方氨基酸（15)雙肽（2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量檢測方法，其特征 在于，該方法包括精密量取被測樣品及對照品溶液，注入帶磺酸基強酸性陽離子交換樹脂 LCAK06/Na柱的色譜儀，通過流動相緩沖液A、B和再生液進行梯度洗脫與再生平衡，以及衍 生試劑諱三酮溶液進行柱后衍生反應，在檢測波長為440nm和570nm下記錄色譜圖，按外標 法以峰面積計算； 其中，所述流動相緩沖液A的配制為：二水合檸檬酸三鈉11. 8g、檸檬酸6. Og、乙醇 65ml、37%的鹽酸5. 6ml、辛酸0. lml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，調pH至2?4 ; 所述流動相緩沖液B的配制為：二水合檸檬酸三鈉19. 6g、氫氧化鈉3. lg、硼酸5. 0g、 辛酸0. lml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，調pH至10?11 ; 所述再生液的配制為：氫氧化鈉20g、EDTA 0. 2g置1000ml量瓶中，加水定容至刻度； 所述衍生試劑茚三酮溶液的配制為：取茚三酮2g，加乙醇溶解至100mL。
2. 如權利要求1所述的復方氨基酸（15)雙肽（2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量 檢測方法，其特征在于，所述流動相緩沖液A的pH為3. 45,流動相緩沖液B的pH為10. 85。
3. 如權利要求1所述的復方氨基酸（15)雙肽（2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含 量檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
51. 制備被測樣品溶液：精密稱取被測樣品5ml，置于50ml容量瓶中，用樣品稀釋液定 容至刻度，搖勻；再精密量取定溶液2ml，用樣品稀釋液定容至100ml，搖勻，即得；所述樣品 稀釋液為取36%鹽酸1. 5ml稀釋至1000ml ;
52. 制備對照品溶液：精患、稱取對照品，用樣品稀釋液制成每lml中含有門冬氣酸 0· 34mg、谷氨酸0· 56mg、絲氨酸0· 45mg、組氨酸0· 68mg、甘氨酰谷氨酰胺3. 027mg、精氨酸 1. 13mg、蘇氨酸0· 56mg、丙氨酸1. 6mg、脯氨酸0· 68mg、繳氨酸0· 73mg、甲硫氨酸0· 56mg、異 亮氨酸〇. 56mg、亮氨酸0. 79mg、苯丙氨酸0. 585mg、醋酸賴氨酸1. 27mg的對照品溶液；所述 樣品稀釋液為取36%鹽酸1. 5ml稀釋至1000ml ; 的對照品溶液；所述樣品稀釋液為取36%鹽酸1. 5ml稀釋至1000ml ;
53. 上樣、分離及梯度洗脫：分別將待測樣品溶液和對照品溶液20 μ 1注入色譜儀，通 過流動相緩沖液A、Β和再生液進行梯度洗脫與再生平衡，于高溫反應器中采用衍生試劑茚 三酮溶液進行柱后衍生反應，在檢測波長為440nm和570nm下記錄色譜圖，按外標法以峰面 積計算； 其中，色譜儀的色譜條件為：帶磺酸基強酸性陽離子交換樹脂LCAK06/Na柱；高溫反應 器溫度為：130°C ;茚三酮流速：0. 25ml/min ;茚三酮停止時間：47min ;采集時間：50min ;流 動相緩沖液A的流速：0. 45ml/min ;流動相緩沖液B的流速：0. 45ml/min ;再生液的流速： 0. 45ml/min ;氨基酸分析柱溫：57?74°C。
4. 如權利要求1-3中任意一項所述的復方氨基酸（15)雙肽（2)注射液氨基酸和甘氨 酰谷氨酰胺含量檢測方法，其特征在于，所述按外標法以峰面積計算公式為供試品標示含 量（％)=(供試品溶液峰面積/標準品溶液峰面積）X100%。
【文檔編號】G01N30/06GK104280475SQ201410604021
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權日:2014年10月30日
【發(fā)明者】鄧茂林, 伍丹, 何穎, 譚鴻波, 劉思川, 程志鵬, 葛均友, 萬陽浴, 饒小莉, 劉文軍, 羅成鑫, 吳小愚, 陳柯志 申請人:四川科倫藥業(yè)股份有限公司