內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測(cè)腎毒性方面的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了基于代謝組學(xué)的內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測(cè)腎毒性方面的應(yīng)用。其中內(nèi)源性小分子物質(zhì)指7個(gè)腎毒性生物標(biāo)記物肌酸酐、花生四烯酸以及溶血磷脂酰膽堿類(lèi)[溶血磷脂酰膽堿(16:1)、溶血磷脂酰膽堿(20:5)、溶血磷脂酰膽堿(20:3)、溶血磷脂酰膽堿(20:2)、溶血磷脂酰膽堿(22:5)]；同時(shí)也指3個(gè)腎毒性專(zhuān)屬生物標(biāo)記物溶血磷脂酰膽堿(20:3)、溶血磷脂酰膽堿(20:2)和溶血磷脂酰膽堿(22:5)。本發(fā)明篩選得到的腎毒性生物標(biāo)記物能夠比生化指標(biāo)更加快速、靈敏地判斷腎臟是否受到損傷，有效地彌補(bǔ)臨床腎功能生化評(píng)價(jià)指標(biāo)缺乏靈敏性的不足，使腎毒性以及腎臟疾病的診斷更加靈敏、可靠。
【專(zhuān)利說(shuō)明】?jī)?nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測(cè)腎毒性方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到使用代謝組學(xué)技術(shù)尋找腎毒性生物標(biāo)記物，然后對(duì)其進(jìn)行專(zhuān)屬性考 察，接著使用支持向量機(jī)（SVM)對(duì)它們進(jìn)行驗(yàn)證與優(yōu)化。更具體地說(shuō)是內(nèi)源性小分子物質(zhì) 在快速檢測(cè)腎毒性以及腎臟疾病方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，藥物安全性問(wèn)題受到人們極大的關(guān)注。由于腎臟是機(jī)體主要的排泄器官， 因此它特別容易受到藥物的影響，從而導(dǎo)致藥物腎毒性在臨床中較為常見(jiàn)。血清肌酐（Scr) 和尿素氮（BUN)是臨床常用的腎功能評(píng)價(jià)指標(biāo)，然而其在臨床檢測(cè)中缺乏靈敏性，不利于腎 毒性的檢測(cè)和診斷。因此，我們亟需尋找靈敏、專(zhuān)屬、高效的藥物腎毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)。隨著研 究的不斷深入，代謝組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于藥物毒性評(píng)價(jià)。它是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部 分，運(yùn)用現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)考察生物體系受外界刺激所引起的內(nèi)源性小分子物質(zhì)變化狀況及其 變化規(guī)律。目前，核磁共振（i-NMR)，氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS) 是代謝組學(xué)常用的分析技術(shù)，其中LC-MS由于高靈敏度、寬的動(dòng)態(tài)范圍、良好的分離能力， 被越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于代謝組學(xué)研究。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，超高效液相色譜串聯(lián)四極桿 飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC/Q-T0F-MS)分析技術(shù)為無(wú)靶向代謝組學(xué)在繁雜的內(nèi)源性物質(zhì)中篩選標(biāo) 記物并且鑒定其結(jié)構(gòu)提供了可靠的技術(shù)平臺(tái)，因此它彰顯出越來(lái)越大的優(yōu)勢(shì)。為了更好的 發(fā)掘數(shù)據(jù)中包含的潛在信息，SVM已經(jīng)逐漸發(fā)揮出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前，SVM在人臉識(shí)別、 圖像處理、疾病診斷等領(lǐng)域中占據(jù)越來(lái)越重要的地位。SVM作為一種智能模式識(shí)別技術(shù)，它 以VC維理論為基礎(chǔ)，根據(jù)樣本信息找到能夠區(qū)分兩類(lèi)別的最優(yōu)線性分界面，可以有效地解 決二分類(lèi)問(wèn)題。因此，可以通過(guò)SVM特征選擇和分類(lèi)預(yù)測(cè)的特性，為代謝組學(xué)中相關(guān)生物標(biāo) 記物的研究提供可靠的數(shù)據(jù)分析技術(shù)，進(jìn)一步為代謝組學(xué)的應(yīng)用提供更加廣闊的空間。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)與SVM相結(jié)合發(fā)現(xiàn)腎毒性生物標(biāo)記物，排除了非專(zhuān)屬物 質(zhì)的干擾來(lái)達(dá)到靈敏、準(zhǔn)確的要求，可以有效地彌補(bǔ)臨床腎功能生化評(píng)價(jià)指標(biāo)缺乏靈敏性 的不足，使腎毒性以及腎臟疾病的診斷更加靈敏、可靠。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了如下的技術(shù)方案： 內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測(cè)腎毒性方面的應(yīng)用，特別是在快速判斷腎臟是否 受到損傷方面的應(yīng)用。其中所述的內(nèi)源性小分子物質(zhì)指腎毒性生物標(biāo)記物，它們是基 于代謝組學(xué)技術(shù)篩選出來(lái)的，包括肌酸酐、花生四烯酸以及溶血磷脂酰膽堿類(lèi)[溶血 磷脂酰膽堿（16:1) [LPC(16:1)]、溶血磷脂酰膽堿（20:5) [LPC(20:5)]、溶血磷脂酰膽 堿（20:3)[LPC(20:3)]、溶血磷脂酰膽堿（20:2)[LPC(20:2)]、溶血磷脂酰膽堿（22:5) [LPC(22:5)]]，它們能夠快速檢測(cè)腎毒性。在腎毒性生物標(biāo)記物的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)SVM驗(yàn) 證與優(yōu)化的內(nèi)源性小分子物質(zhì)指腎毒性專(zhuān)屬生物標(biāo)記物，包括溶血磷脂酰膽堿（20:3) [LPC (20:3)]、溶血磷脂酰膽堿（20:2) [LPC (20:2)]、溶血磷脂酰膽堿（22:5) [LPC (22:5)]， 它們能夠快速判斷腎臟是否受到損傷。
[0005] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了基于代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合SVM的腎毒性生物標(biāo)志物的篩選方 法，包括樣品前處理、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理(多元統(tǒng)計(jì)分析)、生物標(biāo)記物的專(zhuān)屬性考察、專(zhuān)屬 生物標(biāo)記物的驗(yàn)證與優(yōu)化等步驟。其特征在于：在數(shù)據(jù)采集中使用梯度洗脫的條件：〇_〇. 5 min，A: 99%-99%;0. 5-2 min, A: 99%-50%;2-9 min, A: 50%-1%;9-10 min, A: 1%-1%; 10-10. 5 min，A: 1%-99% ;10· 5-12 min，A: 99%-99%，其中流動(dòng)相 A 指 0· 1% 甲酸的水，流 動(dòng)相B指0. 1 %甲酸的乙腈；在專(zhuān)屬生物標(biāo)記物的驗(yàn)證與優(yōu)化中使用MATLAB R2010a軟件 (USA)基于腎毒性生物標(biāo)記物建立SVM預(yù)測(cè)模型，該過(guò)程如下：將生物標(biāo)記物在生理鹽水 組和各個(gè)藥物組中的峰面積作為輸入變量，隨機(jī)選擇數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集和測(cè)試集建立預(yù)測(cè)模 型，通過(guò)優(yōu)化找到最優(yōu)的懲罰參數(shù)（c)和核函數(shù)（g)，然后以逐一排除一個(gè)生物標(biāo)志物為基 礎(chǔ)，利用SVM進(jìn)行分類(lèi)預(yù)測(cè)，得到相應(yīng)的模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，分析準(zhǔn)確度，對(duì)其是否與腎毒性 密切相關(guān)進(jìn)行區(qū)分。
[0006] 我們經(jīng)過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)篩選出腎毒性生物標(biāo)記物，具體是肌酸酐、花生四烯酸、 溶血磷脂酰膽堿（16:1) [LPC (16:1)]、溶血磷脂酰膽堿（20:5) [LPC(20:5)]、溶血磷脂酰 膽堿（20:3) [LPC (20:3)]、溶血磷脂酰膽堿（20:2) [LPC(20:2)]、溶血磷脂酰膽堿（22:5) [LPC(22:5)]。腎毒性生物標(biāo)記物經(jīng)過(guò)專(zhuān)屬性考察、驗(yàn)證與和優(yōu)化后得到腎毒性專(zhuān)屬生物標(biāo) 記物，具體是溶血磷脂酰膽堿（20:3) [LPC (20:3)]、溶血磷脂酰膽堿（20:2) [LPC(20:2)]、 溶血磷脂酰膽堿（22: 5) [LPC (22:5)]。
[0007] 本發(fā)明更加詳細(xì)的技術(shù)方案如下： 1、樣品前處理：樣品處理前將血漿在室溫下解凍。然后，將300 μ L乙腈加入到100 μ L 血漿中，并渦旋混合1分鐘。接著將混合物在冰水浴中超聲10分鐘，然后以13000轉(zhuǎn)在4°C 下離心15分鐘。收集上清液用于UPLC/Q-T0F-MS分析。
[0008] 2、數(shù)據(jù)采集：使用UPLC/Q-T0F-MS系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司）對(duì)大鼠血漿樣品進(jìn)行 信息采集。色譜柱用 ACQUITY UPLC HSS C18 (2.1X100 mm，L7ym，美國(guó) Waters 公司）， 柱溫為40°C，流速為0. 3mL/min，進(jìn)樣量為5 μ L。UPLC分離系統(tǒng)包括二元溶劑系統(tǒng)，用流 動(dòng)相A (0.1%甲酸的水）和流動(dòng)相Β (0.1%甲酸的乙腈)。采用梯度洗脫，具體洗脫條 件：0-0· 5 min，A: 99%-99% ;0· 5-2 min，A: 99%-50% ;2-9 min，A: 50%-1% ;9-10 min，A: 1%-1%;10-10.5 min，A: 1%-99%;10.5-12 min，A: 99%-99%。質(zhì)譜采用電噴霧電離（ESI) 源，在正離子電離模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。MS參數(shù)如下：干燥氣流速為10mL/min，干燥氣體溫 度為325°C，霧化氣氣壓為350 psi，脫溶劑氣流量600L/h，毛細(xì)管電離電壓3. 5 kV，四極桿 掃描范圍m/z50-1000。蒸發(fā)氣體和輔助氣體是高純度氮。用（[M+H]+= 556. 2771，[Μ-ΗΓ =554. 26)作為參考離子來(lái)確保光譜采集過(guò)程中的精度。為了確保代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集的可 靠性，我們從每個(gè)樣品中吸取等量的血漿混合成為QC樣品，用它們對(duì)儀器的穩(wěn)定性、方法 精密度進(jìn)行監(jiān)控，直到整個(gè)系統(tǒng)在一個(gè)良好穩(wěn)定的狀態(tài)下才能開(kāi)始樣品信息采集。同時(shí)在 24小時(shí)之內(nèi)，QC樣品每4個(gè)小時(shí)檢測(cè)一次，用來(lái)監(jiān)測(cè)整個(gè)采集過(guò)程中樣品與系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
[0009] 3、數(shù)據(jù)處理：數(shù)據(jù)分析過(guò)程如下：我們使用MarkerLynx V4. 1 (美國(guó)Waters公 司）將腎毒性三個(gè)藥物組的原始信息分別進(jìn)行處理轉(zhuǎn)化為Excel格式。然后分別將其導(dǎo)入 SIMCA-P +11. 5軟件（Umetrics，瑞典）進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA)，選擇VIP>1的 物質(zhì)作為候選代謝產(chǎn)物。接著分別用SPSS17. 0它們進(jìn)行t檢驗(yàn)，將p〈0. 05的物質(zhì)作為候 選代謝物進(jìn)行下一步的篩選與分析。我們將三個(gè)腎毒性藥物組各自的候選代謝物進(jìn)行整合 化分析（http://bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index. html)，篩選出它們共同的 代謝物。然后，通過(guò)HMDB (http://www.hmdb. ca/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到潛在生物標(biāo)志物。最 后，通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)品和樣品之間的指紋圖譜來(lái)鑒定物質(zhì)。如果沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品，我們分析它們的 MS/MS信息來(lái)識(shí)別它們。我們鑒定得到的物質(zhì)認(rèn)為是腎毒性共同生物標(biāo)記物。然后，我們用 它們的m/z值在非腎毒性藥物組中篩選代謝組數(shù)據(jù)。然后進(jìn)行t檢驗(yàn)和含量變化等分析， 初步確定腎毒性專(zhuān)屬生物標(biāo)志物。接下來(lái)，我們使用MATLAB R2010a軟件（USA)基于這些 初步的腎毒性專(zhuān)屬生物標(biāo)記物建立SVM預(yù)測(cè)模型。該過(guò)程如下：將生物標(biāo)記物的峰面積作 為輸入變量，隨機(jī)選擇數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集和測(cè)試集建立預(yù)測(cè)模型，通過(guò)優(yōu)化找到最優(yōu)的懲罰 參數(shù)（c)和核函數(shù)（g)。然后，我們以逐一排除一個(gè)生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)，利用SVM進(jìn)行分類(lèi) 預(yù)測(cè)，得到相應(yīng)的模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。分析準(zhǔn)確度，對(duì)其是否與腎毒性密切相關(guān)進(jìn)行區(qū)分。 [0010] 本發(fā)明具有的有益效果在于： 臨床中用Scr和BUN作為腎損傷的檢測(cè)指標(biāo)，但是它們常在腎臟組織出現(xiàn)明顯病理性 損傷之后才會(huì)發(fā)生顯著性變化，表明用生化指標(biāo)來(lái)診斷腎損傷具有延后性。因此，及時(shí)發(fā) 現(xiàn)、預(yù)防、治療腎損傷就顯得十分重要。首先，通過(guò)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的腎毒性生物標(biāo)記物能夠比 生化指標(biāo)更加快速、靈敏地判斷腎臟是否受到損傷，有助于我們對(duì)腎損傷進(jìn)行及時(shí)地預(yù)防 和治療。其次，它們能從代謝水平上揭示藥物對(duì)體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響情況，并且從它 們所涉及的生物學(xué)意義為切入點(diǎn)解釋藥物腎毒性的發(fā)生機(jī)制。最后，關(guān)于相關(guān)毒性的專(zhuān)屬 生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，為建立一套基于代謝組學(xué)技術(shù)的藥物毒性評(píng)價(jià)方法有著推動(dòng)作用，同 時(shí)也為疾病診斷提供一條新的思路。
[0011] 【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】： 圖1 :整個(gè)實(shí)驗(yàn)的總體流程圖； 圖2 :腎毒性各藥物組多元統(tǒng)計(jì)分析的PLS-DA得分圖； 圖3 :用維恩圖顯示整合化分析篩選得到28個(gè)腎毒性共同代謝物； 圖4 :鑒定得到的7個(gè)腎毒性共同生物標(biāo)記物； 圖5 :支持向量機(jī)模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率，其中：

【權(quán)利要求】
1. 內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速檢測(cè)腎毒性方面的應(yīng)用；其中所述的內(nèi)源性小分子物質(zhì) 指7個(gè)腎毒性生物標(biāo)記物，它們是基于代謝組學(xué)技術(shù)篩選出來(lái)的，包括肌酸酐、花生四烯酸 以及溶血磷脂酰膽堿類(lèi)[溶血磷脂酰膽堿（16:1) [LPC(16:1)]、溶血磷脂酰膽堿（20:5) [LPC (20:5)]、溶血磷脂酰膽堿（20:3) [LPC (20:3)]、溶血磷脂酰膽堿（20:2) [LPC (20:2)]、 溶血磷脂酰膽堿（22:5) [LPC (22:5)]]。
2. 內(nèi)源性小分子物質(zhì)在快速判斷腎臟是否受到損傷方面的應(yīng)用；其中所述的內(nèi)源性 小分子物質(zhì)指的是3個(gè)腎毒性專(zhuān)屬生物標(biāo)記物，它們是在腎毒性生物標(biāo)記物的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò) 專(zhuān)屬性考察和SVM驗(yàn)證與與優(yōu)化篩選出來(lái)的，包括溶血磷脂酰膽堿（20:3) [LPC(20:3)]、溶 血磷脂酰膽堿（20:2) [LPC (20:2)]、溶血磷脂酰膽堿（22:5) [LPC (22:5)]。
3. 權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中基于代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合SVM的腎毒性生物標(biāo) 志物的篩選方法，包括樣品前處理、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理(多元統(tǒng)計(jì)分析)、生物標(biāo)記物的專(zhuān) 屬性考察、專(zhuān)屬生物標(biāo)記物的驗(yàn)證與優(yōu)化步驟；其特征在于：在數(shù)據(jù)采集中使用梯度洗脫 的條件：0-0.5 min，A: 99%-99%;0· 5-2 min，A: 99%-50%;2-9 min，A: 50%-1%;9-10 min， 八：1%-1%;10-10.5 11^11，六：1%-99%;10.5-12 11^11，六：99%-99%，其中流動(dòng)相六指0.1% 甲酸的水，流動(dòng)相B指0. 1%甲酸的乙腈；在專(zhuān)屬生物標(biāo)記物的驗(yàn)證與優(yōu)化中使用MATLAB R2010a軟件（USA)基于腎毒性生物標(biāo)記物建立SVM預(yù)測(cè)模型，該過(guò)程如下：將生物標(biāo)記物在 生理鹽水組和各個(gè)藥物組中的峰面積作為輸入變量，隨機(jī)選擇數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集和測(cè)試集建 立預(yù)測(cè)模型，通過(guò)優(yōu)化找到最優(yōu)的懲罰參數(shù)（c)和核函數(shù)（g)，然后以逐一排除一個(gè)生物標(biāo) 志物為基礎(chǔ)，利用SVM進(jìn)行分類(lèi)預(yù)測(cè)，得到相應(yīng)的模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，分析準(zhǔn)確度，對(duì)其是否 與腎毒性密切相關(guān)進(jìn)行區(qū)分。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104280478SQ201410607906
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】李遇伯, 張艷軍, 鄧皓月 申請(qǐng)人:天津中醫(yī)藥大學(xué)