一種基于光外差干涉術(shù)的共聚焦掃描顯微成像方法及系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于激光外差干涉術(shù)的共聚焦顯微成像系統(tǒng)，在現(xiàn)有激光共聚焦顯微鏡的顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)、掃描部分的基礎(chǔ)上，加入頻移部分，結(jié)合光外差干涉技術(shù)實(shí)現(xiàn)精確測(cè)量。在充分利用了共聚焦掃描顯微鏡的超高橫向分辨率的同時(shí)，又通過(guò)獲取精確的相位信息取代強(qiáng)度信息，不僅提高了軸向分辨率，還避免了使用熒光染料帶來(lái)的一系列問(wèn)題；可以在無(wú)標(biāo)記的情況下測(cè)量透明的相位物體。
【專利說(shuō)明】-種基于光外差干涉術(shù)的共聚焦掃描顯微成像方法及系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種共聚焦掃描顯微成像方法，屬于光學(xué)精密測(cè)量領(lǐng)域，特別涉及一 種基于光外差干涉術(shù)的共聚焦掃描顯微成像方法，本發(fā)明還涉及利用上述方法的系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002] 激光掃描共聚焦顯微鏡（Laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)是對(duì)普 通光學(xué)顯微鏡的重大改進(jìn)，主要由W下四個(gè)部分組成；顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)；掃描裝置，LSCM使 用的掃描裝置在生物領(lǐng)域一般為鏡掃描；激光光源；檢測(cè)系統(tǒng)。其基本思想由M.Minsky于 1957年提出，與一般的顯微成像不同，它在光路中加入了與物點(diǎn)共輛的探測(cè)針孔，起到了空 間濾波作用，在使用英光染料的情況下，能夠去除離焦英光的干擾，產(chǎn)生軸向?qū)游瞿芰?，?過(guò)逐點(diǎn)逐層的掃描方式，實(shí)現(xiàn)對(duì)觀測(cè)樣品區(qū)域的光學(xué)層切，實(shí)現(xiàn)H維成像。它是一種無(wú)損傷 的光學(xué)遠(yuǎn)場(chǎng)成像技術(shù)，能夠同時(shí)提供較高的橫向和軸向分辨率，該使得它有著極高的應(yīng)用 價(jià)值。
[0003] 共聚焦掃描顯微鏡與傳統(tǒng)照明顯微鏡相比有許多優(yōu)點(diǎn)，包括：可W控制焦深、照明 強(qiáng)度、降低非焦平面光線噪聲干擾，從一定厚度標(biāo)本中獲取光學(xué)切片，既顯微CT。最近共聚 焦顯微鏡在科研領(lǐng)域尤其是生物醫(yī)學(xué)方面迅速發(fā)展，主要原因是其可W在不改變普通英光 顯微鏡的制片方法的前提下，可W觀察到非常清晰的高質(zhì)量圖像，并且通過(guò)共聚焦顯微鏡 可W十分方便的觀察活的細(xì)胞或組織。由于共聚焦顯微鏡的突出優(yōu)勢(shì)，它已經(jīng)成為生物醫(yī) 學(xué)研究中最重要的形態(tài)學(xué)研究工具之一。
[0004] 目前世界各大光學(xué)顯微鏡公司都在研發(fā)和生產(chǎn)共聚焦顯微鏡，主要體現(xiàn)在市面上 常見(jiàn)的德國(guó)悚卡、蔡司、和日本尼康、奧林己斯該幾個(gè)品牌的產(chǎn)品中。
[0005] 由于共聚焦顯微鏡在觀測(cè)時(shí)必要使用的英光染料分子所帶來(lái)的一系列問(wèn)題，在激 光的照射下，使用的許多英光染料會(huì)產(chǎn)生單態(tài)氧或自由基等細(xì)胞毒素，必須限制掃描時(shí)間、 激發(fā)光強(qiáng)度，W保持樣品的活性，使得強(qiáng)度的對(duì)比度不高。同時(shí)，為了獲得足夠的信噪比必 須提高激光的強(qiáng)度；而高強(qiáng)度的激光會(huì)使染料在連續(xù)掃描過(guò)程中迅速權(quán)色，即光漂白效應(yīng)。
[0006] 另外，激光共聚焦英光掃描顯微技術(shù)得到圖像的對(duì)比度來(lái)自于激光激發(fā)樣本產(chǎn)生 的英光強(qiáng)度，因此，如果不使用英光染料，不能單獨(dú)實(shí)現(xiàn)對(duì)透明樣品進(jìn)行非英光標(biāo)記的結(jié)構(gòu) 成像。對(duì)于該些透明樣品，也就是相位樣品，采用相位測(cè)量的方法可W得到高精度的結(jié)果， 同時(shí)，不需要英光染料標(biāo)記，避免了染料帶來(lái)的毒性及其他問(wèn)題，并且相位信息的對(duì)比度比 強(qiáng)度的對(duì)比度更高。現(xiàn)有技術(shù)中，可W與激光共聚焦英光掃描顯微技術(shù)結(jié)合的顯微相位成 像方法主要有W下幾種：
[0007] (1)激光斜射照明顯微成像方法。在共聚焦顯微系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，利用入射激光光軸 和探測(cè)光軸所成的角度獲得斜入射的照明光，從而獲得浮雕效果。
[0008] (2)微分干涉相差顯微成像方法。利用兩塊沃拉斯頓棱鏡（Wollaston Prism)，起 偏器（Polarzer)和檢偏器（Analyzer)完成成像，成像結(jié)果可W呈現(xiàn)樣品的浮雕狀結(jié)構(gòu)。
[0009] 上述的兩種相位方法避免了使用英光染料，但是，激光斜射照明顯微成像方法由 于需要調(diào)節(jié)探測(cè)光路和入射光路的角度，難W實(shí)現(xiàn)在完全不破壞原有共聚焦光路的基礎(chǔ)上 實(shí)現(xiàn)位相測(cè)量，會(huì)導(dǎo)致需要大幅度修改原有顯微鏡結(jié)構(gòu)才可W使用該種技術(shù)。微分干涉相 差顯微成像方法需要在光路中額外添加偏振元件產(chǎn)生偏振光，并利用兩束偏振光形成的剪 切角進(jìn)行位相差分探測(cè)，其所采用沃拉斯頓棱鏡價(jià)格昂貴且不能對(duì)具有雙折射特性的樣品 進(jìn)行探測(cè)，限制了使用范圍。同時(shí)，該兩種方法均不能獲得精確到千分之一弧度的定量相位 信息。
[0010] 另外，上述各處理方法中共聚焦顯微鏡的聚焦點(diǎn)均存在微米量級(jí)的光腰，在該個(gè) 范圍內(nèi)，共聚焦顯微鏡是無(wú)法分辨的。
[0011] 激光外差干涉法是一種成熟的被廣泛用于高精度測(cè)量領(lǐng)域的方法。在光外差探測(cè) 中，帶有被探測(cè)目標(biāo)信息的信號(hào)光波與一個(gè)本振光波進(jìn)行混頻，經(jīng)過(guò)混頻后的光信號(hào)被光 電探測(cè)所響應(yīng)，并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)輸出?；祛l信號(hào)一般包括本振光的頻率分量、原始信號(hào)光的 頻率分量W及信號(hào)光和本振光的和頻分量及差頻分量，前H個(gè)信號(hào)由于頻率太高不能被探 測(cè)得到，所W經(jīng)過(guò)光電探測(cè)器轉(zhuǎn)換輸出的只是信號(hào)光和本振光頻率的差頻分量。光外差法 的精度可W達(dá)到千分之一個(gè)探測(cè)波長(zhǎng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于光外差干涉術(shù)的共聚焦掃描顯微成像方法，在共 聚焦掃描顯微鏡的基礎(chǔ)上，結(jié)合光外差干涉術(shù)，能夠獲得無(wú)英光標(biāo)記樣品的高對(duì)比度的相 位信息圖像。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種利用上述方法的共聚焦掃描顯微成像系統(tǒng)，能 夠獲得無(wú)英光標(biāo)記樣品的高對(duì)比度的相位信息圖像。
[0014] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案；一種基于光外差干涉術(shù)的共聚焦 掃描顯微成像方法，包括：
[0015] (1)將激光光源發(fā)出的單波長(zhǎng)激光分成兩束光，其中一束進(jìn)入一個(gè)具有固定頻率 的聲光頻移器調(diào)制，其輸出的一級(jí)光作為信號(hào)光；另一束進(jìn)入一個(gè)具有可調(diào)頻率的聲光頻 移器調(diào)制，其輸出的一級(jí)光作為本振光；所述可調(diào)頻率為所述固定頻率前后0. 1-2MHZ范 圍；
[0016] (2)將所述信號(hào)光再次分成第一、第二信號(hào)光束，所述本振光再次分成第一、第二 本振光束，其中將第二信號(hào)光束和第二本振光束進(jìn)行合束并輸入到第二光電探測(cè)器上，經(jīng) 光電探測(cè)器對(duì)合束光采集后輸出參考中頻信號(hào)；
[0017] (3)將第一信號(hào)光束進(jìn)入共聚焦掃描系統(tǒng)，第一信號(hào)光束照射到樣品部分后，按原 路返回并與第一本振光束進(jìn)行合束并輸入到第一光電探測(cè)器上，經(jīng)光電探測(cè)器對(duì)合束光采 集后輸出待測(cè)中頻信號(hào)；
[0018] (4)將采集到的參考中頻信號(hào)和待測(cè)中頻信號(hào)進(jìn)行處理，得出聚焦點(diǎn)的相位信息； 共聚焦掃描系統(tǒng)中的掃描部分進(jìn)行逐點(diǎn)逐層掃描，得到一個(gè)個(gè)不同位置點(diǎn)的相位信息，并 合成樣品的H維信息圖像。
[0019] 對(duì)本發(fā)明方法的進(jìn)一步改進(jìn)，當(dāng)在步驟（4)得到的某一聚焦點(diǎn)的相位信息時(shí)，聚 焦點(diǎn)在物體平面內(nèi)不動(dòng)，掃描部分做軸向的微位移，得到聚焦點(diǎn)的相位發(fā)生連續(xù)變化，即相 位隨著時(shí)間變化，由于相位是包裹在（-K,n]中的，利用當(dāng)前所得到的相位信息與前一時(shí) 刻得到的相位信息比較，若時(shí)間前后的相位信息之差的符號(hào)發(fā)生變化時(shí)，就計(jì)數(shù)器加一； 如此一來(lái)，當(dāng)相位遞增到波長(zhǎng)/2的整數(shù)倍時(shí)，就實(shí)現(xiàn)整數(shù)計(jì)數(shù)，實(shí)現(xiàn)了聚焦點(diǎn)光腰內(nèi)的相 對(duì)測(cè)量。
[0020] 本發(fā)明方法采用偏振分束器來(lái)進(jìn)行分束、合束，各路光在分束、合束前，均采用半 波片調(diào)制偏振方向。
[0021] 本發(fā)明方法步驟3中第一信號(hào)光束與共聚焦掃描系統(tǒng)之間經(jīng)半波片、偏振分束器 和四分之一波片調(diào)制禪合，半波片、偏振分束器使第一信號(hào)光束全部進(jìn)入共聚焦掃描系統(tǒng) 中，同時(shí)四分之一波片和偏振分束器使照射到樣品部分后，按原路返回的第一信號(hào)光束由 偏振分束器全反射輸出。
[0022] 本發(fā)明方法步驟2、3中的合束光輸入到光電探測(cè)器前，先進(jìn)入檢偏器，使得信號(hào) 光和本振光的偏振方向保持一致，從而提高了拍頻效率。
[0023] 為了可W避免空氣的干擾，本發(fā)明采用光纖進(jìn)行光束傳輸，該樣參考光路中的信 號(hào)光和本振光收到的干擾就變成一樣，那么采集到參考中頻信號(hào)基本是理想的參考中頻信 號(hào)，該樣最終和待測(cè)中頻信號(hào)進(jìn)行對(duì)比時(shí)才能夠得到最精確的相位信息。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)目的，可通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種基于激光外差干涉術(shù)的共 聚焦顯微成像系統(tǒng)，包括激光光源部分，頻移部分，共聚焦掃描部分，光信號(hào)采集部分及信 號(hào)分析部分；
[0025] 激光光源包含輸出一個(gè)單波長(zhǎng)激光的激光器和將該激光分成兩束激光的光源分 束器；
[0026] 頻移部分包含本振光傳輸光路和信號(hào)光傳輸光路；所述本振光傳輸光路設(shè)有可調(diào) 頻率的第一聲光頻移器、本振光分束器；
[0027] 信號(hào)光傳輸光路設(shè)有固定頻率的第二聲光頻移器、信號(hào)光分束器、信號(hào)光合束 器；
[0028] 光信號(hào)采集部分包含用于采集待測(cè)光的第一光電探測(cè)器、用于采集參考光的第二 光電探測(cè)器；
[0029] 信號(hào)分析部分包含用于處理兩個(gè)通道信號(hào)的計(jì)算機(jī)；
[0030] 光源分束器分出的其中一束進(jìn)入信號(hào)光傳輸通道的第一聲光頻移器調(diào)制，其輸出 的一級(jí)光作為信號(hào)光；另一束進(jìn)入本振光傳輸通道的第二聲光頻移器調(diào)制，其輸出的一級(jí) 光作為本振光；
[0031] 所述信號(hào)光經(jīng)信號(hào)光分束器分成第一、第二信號(hào)光束，所述本振光經(jīng)本振光分束 器分成第一、第二本振光束，其中第二信號(hào)光束傳輸?shù)奖菊窆夥质髋c第二本振光束進(jìn)行 合束為參考光，并輸入到第二光電探測(cè)器上，經(jīng)第二光電探測(cè)器對(duì)參考光采集后輸出參考 中頻信號(hào)；
[0032] 第一信號(hào)光束進(jìn)入共聚焦掃描部分，第一信號(hào)光束照射到樣品部分后，按原路返 回并輸入到信號(hào)光合束器，第一本振光束也輸入到信號(hào)光合束器進(jìn)行合束為待測(cè)光，并輸 入到第一光電探測(cè)器上，經(jīng)第一光電探測(cè)器對(duì)待測(cè)光采集后輸出待測(cè)中頻信號(hào)；
[0033] 采集到的參考中頻信號(hào)和待測(cè)中頻信號(hào)輸入到信號(hào)分析部分進(jìn)行處理，得出聚焦 點(diǎn)的相位信息；共聚焦掃描部分進(jìn)行逐點(diǎn)逐層掃描，得到一個(gè)個(gè)不同位置點(diǎn)的相位信息，并 合成待測(cè)樣品的H維信息圖像。
[0034] 本發(fā)明系統(tǒng)在獲得聚焦點(diǎn)相位信息時(shí)，掃描部分做軸向的微位移，得到聚焦點(diǎn)的 相位發(fā)生連續(xù)變化的信息。
[0035] 本發(fā)明系統(tǒng)所述分束器、合束器均采用偏振分束器，在各偏振分束器的輸入端的 光路中均設(shè)有用于調(diào)制偏振方向的半波片。
[0036] 本發(fā)明系統(tǒng)第一信號(hào)光束進(jìn)入共聚焦掃描部分輸入端的光路中依次設(shè)有半波片、 偏振分束器和四分之一波片，使第一信號(hào)光束能全部進(jìn)入共聚焦掃描部分；同時(shí)使共聚焦 掃描部分中返回輸出的第一信號(hào)光束經(jīng)偏振分束器全反射到光信號(hào)合束器上。
[0037] 本發(fā)明系統(tǒng)光電探測(cè)器的輸入端光路中設(shè)有檢偏器，使得信號(hào)光和本振光的偏振 方向保持一致，從而提高了拍頻效率。
[0038] 本發(fā)明在現(xiàn)有激光共聚焦顯微鏡的顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)、掃描部分的基礎(chǔ)上，加入頻 移部分，結(jié)合光外差干涉技術(shù)實(shí)現(xiàn)精確測(cè)量。在充分利用了共聚焦掃描顯微鏡的超高橫向 分辨率的同時(shí)，又通過(guò)獲取精確的相位信息取代強(qiáng)度信息，不僅提高了軸向分辨率，還避免 了使用英光染料帶來(lái)的一系列問(wèn)題。可W在無(wú)標(biāo)記的情況下測(cè)量透明的相位物體。
[0039] 本發(fā)明采用的光外差干涉技術(shù)，獲得的相位信息具有比英光光強(qiáng)信息更高的信噪 比和靈敏度。使得在不增大激光光強(qiáng)的同時(shí)，可W獲得極弱反饋背景下目標(biāo)的信息，增大了 激光共聚焦顯微鏡的可探測(cè)深度。
[0040] 本發(fā)明采用光外差干涉，隨著共聚焦顯微鏡中的掃描裝置做連續(xù)軸向微位移，得 到的相位發(fā)生連續(xù)變化，使用簡(jiǎn)單的相位計(jì)數(shù)方法，就可W獲得了焦點(diǎn)光腰的內(nèi)分辨，分辨 尺度可W達(dá)到納米量級(jí)?？朔四壳肮簿劢癸@微鏡在聚焦點(diǎn)存在微米量級(jí)的無(wú)法內(nèi)分辨光 腰的問(wèn)題。內(nèi)分辨精度可W達(dá)到納米量級(jí)，實(shí)現(xiàn)了光腰內(nèi)的高分辨測(cè)量。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1為本發(fā)明系統(tǒng)的原理框圖。

【具體實(shí)施方式】
[0042] 如圖1，本發(fā)明具體實(shí)施例包括激光光源部分，頻移部分，共聚焦掃描部分，光信號(hào) 采集部分及信號(hào)分析部分；
[0043] 激光光源包含輸出一個(gè)單波長(zhǎng)激光的激光器1、半波片2a、將該激光分成兩束激 光的偏振分束器3a;
[0044] 頻移部分包含本振光傳輸光路和信號(hào)光傳輸光路，本振光傳輸光路設(shè)置可調(diào)頻率 的第一聲光頻移器4b、用于調(diào)整本振光傳輸方向的發(fā)射鏡10、半波片2d、本振光偏振分束 器3d、半波片2g;信號(hào)光傳輸光路設(shè)置固定頻率的第二聲光頻移器4a、半波片化、用于信號(hào) 光分束的偏振分束器3b、半波片2e、半波片2c、偏振分束器3c、四分之一波片6、半波片2f、 用于信號(hào)光合束的偏振分束器3e;
[0045] 光信號(hào)采集部分包含用于采集待測(cè)光的第一光電探測(cè)器1la、用于采集參考光的 第二光電探測(cè)器12a;
[0046] 信號(hào)分析部分包含用于處理兩個(gè)通道信號(hào)的計(jì)算機(jī)13 ;
[0047] 如圖1所示，激光器1發(fā)出的激光經(jīng)過(guò)半波片2a調(diào)整偏振角度后被偏振分束器3a 分成兩束激光光源。
[0048] 較弱的一束激光光源進(jìn)入聲光頻移器4b后輸出一級(jí)光為本振光，其頻移值可調(diào)， 例如可調(diào)范圍為f±Af。經(jīng)過(guò)聲光頻移器4b出射的一級(jí)光經(jīng)過(guò)反射鏡10的反射改變傳輸 方向后，被半波片2d調(diào)制了偏振方向，經(jīng)過(guò)偏振分束器3d后分成第一、第二兩束本振光，被 偏振分束器3d反射部分為第二本振光，信號(hào)光傳輸光路中被偏振分束器3b反射的第二信 號(hào)光又經(jīng)過(guò)半波片2e調(diào)制傳輸?shù)狡穹质?d，與偏振分束器3d反射部分的第二本振光 合束為參考光，同時(shí)進(jìn)入檢偏器Ila后在光電探測(cè)器12a光敏面上拍頻作為參考中頻信號(hào)。
[0049] 其中較強(qiáng)的一束激光光源進(jìn)入聲光頻移器4a，聲光頻移器4a輸出一級(jí)光為信號(hào) 光，其頻移值為固定值，例如f。聲光頻移器4a輸出的一級(jí)光再次經(jīng)過(guò)半波片化調(diào)整偏振 角度后被偏振分束器3b分成第一、第二兩束信號(hào)光，較強(qiáng)一部分的第一信號(hào)光被偏振分束 器3b透射輸出用于去照射待測(cè)樣品；調(diào)節(jié)半波片2c，使得第一信號(hào)光束完全通過(guò)偏振分束 器3c進(jìn)入共聚焦顯微系統(tǒng)。進(jìn)入掃描系統(tǒng)的第一信號(hào)光首先經(jīng)過(guò)四分之一波片6的調(diào)制 后，入射到共聚焦顯微系統(tǒng)的小孔7,后經(jīng)過(guò)透鏡5a變成平行光入射至現(xiàn)有共聚焦顯微系 統(tǒng)的掃描振鏡8,后經(jīng)過(guò)透鏡化聚焦到樣品部分9,在焦點(diǎn)處被樣品反射后可W原路返回， 再次經(jīng)過(guò)小孔7,后被四分之一波片6調(diào)制；由于從偏振分束器3c出射的光經(jīng)過(guò)兩次四分 之一波片，使得光的偏振方向發(fā)生90度的偏轉(zhuǎn)，那么再次經(jīng)過(guò)偏振分束器3c的時(shí)候就可W 被完全反射。
[0050] 第一信號(hào)光照射樣品后原路返回被偏振分束器3c反射又經(jīng)過(guò)半波片2g調(diào)整偏振 方向傳輸?shù)狡穹质?e，而上述本振光傳輸光路中經(jīng)過(guò)偏振分束器3d透射部分的第一 本振光經(jīng)過(guò)半波片2g調(diào)整偏振方向后也傳輸?shù)狡穹质?e，上述兩個(gè)光束在偏振分束 器3e處匯合為待測(cè)光，同時(shí)進(jìn)入檢偏器1化后在光電探測(cè)器1化光敏面上拍頻作為參考中 頻信號(hào)。檢偏器的作用是使得兩個(gè)通道中的信號(hào)光和本振光的偏振方向保持一直，從而提 高了拍頻效率。兩個(gè)通道的信號(hào)進(jìn)入信號(hào)分析部分進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過(guò)計(jì)算機(jī)或其他計(jì)算 模塊獲得待測(cè)樣品的信息。
[0051] 為了可W避免空氣的干擾，最好使用光纖進(jìn)行光束傳播，該樣參考光路中的信號(hào) 光和本振光收到的干擾就變成一樣，那么經(jīng)過(guò)拍頻和光電轉(zhuǎn)換后形成的參考中頻信號(hào)基本 是理想的參考中頻信號(hào)，該樣最終和待測(cè)中頻信號(hào)進(jìn)行對(duì)比時(shí)才能夠得到最精確的相位信 息。
[0052] W上述數(shù)據(jù)為例，待測(cè)光中的信號(hào)光強(qiáng)為
[0053] /,=與sin口兄(v'-/)t+閑+輝] (0. 1)
[0054] 其中Ei為其幅值，V為激光輸出光束的固有頻率，它高達(dá)GHz量級(jí)，5XIO7為聲光 頻移器4a的頻移值50MHz，巧為激光輸出光束的初始相位，界2為信號(hào)光經(jīng)過(guò)掃描系統(tǒng)后所 附加的相位，即最終需要的相位值。
[00巧]待測(cè)光中的本振光光強(qiáng)為
[0056] /; =&sin[2兀(r-/ +A/'H+0] (0. 2)
[0057] 其中，Af為聲光頻移器4b和聲光頻移器4a的頻率差值，Af的取值范圍為 0.1-2MHZ。
[0058]若兩束光在光敏面上偏振方向一致，又由于光電探測(cè)器僅能響應(yīng)干涉光的中頻 項(xiàng)，因此，光電探測(cè)器12a可探測(cè)的光強(qiáng)為
[0059] Si(t) =EiEgCos(Aft) (0.3)
[0060]相應(yīng)的，光電探測(cè)器1化可探測(cè)的光強(qiáng)為
[0061] .S',(0 = ￡,￡,cos(A// + ) (0. 4)
[0062]待測(cè)中頻電信號(hào)S2(t)與參考中頻電信號(hào)Si(t)同時(shí)被采集并經(jīng)雙通道A/D數(shù)據(jù) 采集卡進(jìn)行數(shù)字采樣，然后轉(zhuǎn)換為離散的數(shù)字信號(hào)。
[0063]兩路數(shù)字信號(hào)輸入到計(jì)算機(jī)或計(jì)算模塊進(jìn)行處理，使用UbVIEW或者其他數(shù)據(jù)處 理軟件進(jìn)行求解兩路信號(hào)之間的相位差提取。相位差提取算法通常采用W下H種，即，傅立 葉變換法，正交解調(diào)法或最小二乘法。經(jīng)過(guò)該些算法就可W獲得待測(cè)樣品當(dāng)前探測(cè)點(diǎn)（即 聚焦點(diǎn)）的相位信息。共聚焦掃描部分不斷工作，得到一個(gè)個(gè)不同位置點(diǎn)的相位信息，當(dāng)掃 描部分將光束掃描過(guò)一個(gè)平面時(shí)，由計(jì)算機(jī)得到的是待測(cè)樣品的掃描面的信息圖像，隨后， 掃描部分通過(guò)升降物品臺(tái)或者物鏡，使得光束掃描的面與之前的面在空間高度上有區(qū)別， 那么再得到另外一個(gè)物體斷面的相位信息，當(dāng)?shù)玫搅嗽S多斷面之后，再通過(guò)計(jì)算機(jī)通過(guò)常 用的圖像合成軟件將該些斷面拼接成一個(gè)H維圖像，即可反應(yīng)出物體的H維相位信息。
[0064] 在獲得當(dāng)前探測(cè)點(diǎn)（即聚焦點(diǎn)）的相位信息后，若保持該聚焦點(diǎn)在物體平面內(nèi)不 動(dòng)，掃描部分中的微位移裝置（如壓電陶瓷等）進(jìn)行縱向連續(xù)移動(dòng)，計(jì)算機(jī)就可W得到的當(dāng) 前聚焦點(diǎn)的相位變化。由于相位是包裹在（-K,n]中的，利用當(dāng)前所得到的相位信息與前 一時(shí)刻得到的相位信息比較，若時(shí)間前后的相位信息之差的符號(hào)發(fā)生變化時(shí)，就計(jì)數(shù)器加 一；如此一來(lái)，當(dāng)相位遞增到波長(zhǎng)入/2的整數(shù)倍時(shí)，就實(shí)現(xiàn)整數(shù)計(jì)數(shù)，實(shí)現(xiàn)了光腰內(nèi)的相對(duì) 測(cè)量。該個(gè)隨時(shí)間變化的相位應(yīng)該是一個(gè)正弦曲線抑0，具體令KO= 口片+ 1)-的0，那么當(dāng) Y(t)的符號(hào)發(fā)生變化是，使得設(shè)置在計(jì)算機(jī)中的計(jì)數(shù)器就加一；令口(0-例0)，結(jié)合 計(jì)數(shù)器中的數(shù)值n，O(t)+n-n反映的是當(dāng)前聚焦點(diǎn)的內(nèi)部相對(duì)相位分布。
[0065]本發(fā)明不局限與上述【具體實(shí)施方式】，根據(jù)上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí) 和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，本發(fā)明還可W做出其它多種形式 的等效修改、替換或變更，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
【權(quán)利要求】
1. 一種基于光外差干涉術(shù)的共聚焦掃描顯微成像方法，包括： (1) 將激光光源發(fā)出的單波長(zhǎng)激光分成兩束光，其中一束進(jìn)入一個(gè)具有固定頻率的聲 光頻移器調(diào)制，其輸出的一級(jí)光作為信號(hào)光；另一束進(jìn)入一個(gè)具有可調(diào)頻率的聲光頻移器 調(diào)制，其輸出的一級(jí)光作為本振光；所述可調(diào)頻率為所述固定頻率前后0. 1-2MHZ范圍； (2) 將所述信號(hào)光再次分成第一、第二信號(hào)光束，所述本振光再次分成第一、第二本振 光束，其中將第二信號(hào)光束和第二本振光束進(jìn)行合束并輸入到第二光電探測(cè)器上，經(jīng)光電 探測(cè)器對(duì)合束光采集后輸出參考中頻信號(hào)； (3) 將第一信號(hào)光束進(jìn)入共聚焦掃描系統(tǒng)，第一信號(hào)光束照射到樣品部分后，按原路返 回并與第一本振光束進(jìn)行合束并輸入到第一光電探測(cè)器上，經(jīng)光電探測(cè)器對(duì)合束光采集后 輸出待測(cè)中頻信號(hào)； (4) 將采集到的參考中頻信號(hào)和待測(cè)中頻信號(hào)進(jìn)行處理，最后得出聚焦點(diǎn)的相位信息； 共聚焦掃描系統(tǒng)中的掃描部分進(jìn)行逐點(diǎn)逐層掃描，得到一個(gè)個(gè)不同位置點(diǎn)的相位信息，并 合成樣品的三維信息圖像。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的共聚焦掃描顯微成像方法，其特征在于當(dāng)在步驟（4)得到 的某一聚焦點(diǎn)的相位信息時(shí)，聚焦點(diǎn)在物體平面內(nèi)不動(dòng)，掃描部分做軸向的微位移，得到聚 焦點(diǎn)的相位發(fā)生連續(xù)變化信息，利用當(dāng)前所得到的相位信息與前一時(shí)刻得到的相位信息比 較，若時(shí)間前后的相位信息之差的符號(hào)發(fā)生變化時(shí)，就計(jì)數(shù)器加一；當(dāng)相位遞增到波長(zhǎng)/2 的整數(shù)倍時(shí)，就實(shí)現(xiàn)整數(shù)計(jì)數(shù)，既實(shí)現(xiàn)對(duì)聚焦點(diǎn)光腰內(nèi)的相對(duì)測(cè)量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的共聚焦掃描顯微成像方法，其特征在于采用偏振分束器來(lái)進(jìn) 行分束、合束，各路光在分束、合束前，均采用半波片調(diào)制偏振方向。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的共聚焦掃描顯微成像方法，其特征在于步驟3中第一信號(hào)光 束與共聚焦掃描系統(tǒng)之間經(jīng)半波片、偏振分束器和四分之一波片調(diào)制耦合，半波片、偏振分 束器使第一信號(hào)光束全部進(jìn)入共聚焦掃描系統(tǒng)中，同時(shí)四分之一波片和偏振分束器使照射 到樣品部分后，按原路返回的第一信號(hào)光束由偏振分束器全反射輸出。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的共聚焦掃描顯微成像方法，其特征在于步驟2、3中的合束光 輸入到光電探測(cè)器前，先進(jìn)入檢偏器，使得信號(hào)光和本振光的偏振方向保持一致。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的共聚焦掃描顯微成像方法，其特征在于采用光纖 進(jìn)行光束傳輸。
7. -種基于激光外差干涉術(shù)的共聚焦顯微成像系統(tǒng)，包括激光光源部分，頻移部分，共 聚焦掃描部分，光信號(hào)采集部分及信號(hào)分析部分； 激光光源包含輸出一個(gè)單波長(zhǎng)激光的激光器和將該激光分成兩束激光的光源分束 器； 其特征在于：頻移部分包含本振光傳輸光路和信號(hào)光傳輸光路；所述本振光傳輸光路 設(shè)有可調(diào)頻率的第一聲光頻移器、本振光分束器； 信號(hào)光傳輸光路設(shè)有固定頻率的第二聲光頻移器、信號(hào)光分束器、信號(hào)光合束器； 光信號(hào)采集部分包含用于采集待測(cè)光的第一平衡式光電探測(cè)器、用于采集參考光的第 二平衡式光電探測(cè)器； 光源分束器分出的其中一束進(jìn)入信號(hào)光傳輸通道的第一聲光頻移器調(diào)制，其輸出的一 級(jí)光作為信號(hào)光；另一束進(jìn)入本振光傳輸通道的第二聲光頻移器調(diào)制，其輸出的一級(jí)光作 為本振光； 所述信號(hào)光經(jīng)信號(hào)光分束器分成第一、第二信號(hào)光束，所述本振光經(jīng)本振光分束器分 成第一、第二本振光束，其中第二信號(hào)光束傳輸?shù)奖菊窆夥质髋c第二本振光束進(jìn)行合束 為參考光，并輸入到第二光電探測(cè)器上，經(jīng)第二光電探測(cè)器對(duì)參考光采集后輸出參考中頻 信號(hào)； 第一信號(hào)光束進(jìn)入共聚焦掃描部分，第一信號(hào)光束照射到樣品部分后，按原路返回并 輸入到信號(hào)光合束器，第一本振光束也輸入到信號(hào)光合束器進(jìn)行合束為待測(cè)光，并輸入到 第一光電探測(cè)器上，經(jīng)第一光電探測(cè)器對(duì)待測(cè)光采集后輸出待測(cè)中頻信號(hào)； 采集到的參考中頻信號(hào)和待測(cè)中頻信號(hào)輸入到信號(hào)分析部分進(jìn)行處理，得出當(dāng)前聚焦 點(diǎn)的相位信息；共聚焦掃描部分不斷工作，得到一個(gè)個(gè)不同位置點(diǎn)的相位信息，并合成待測(cè) 樣品的三維信息圖像。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的共聚焦掃描顯微成像方法，其特征在于所述分束器、合束器 均采用偏振分束器，在各偏振分束器的輸入端的光路中均設(shè)有用于調(diào)制偏振方向的半波 片。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的共聚焦掃描顯微成像方法，其特征在于：在第一信號(hào)光束進(jìn) 入共聚焦掃描部分輸入端的光路中依次設(shè)有半波片、偏振分束器和四分之一波片。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的共聚焦掃描顯微成像方法，其特征在于：在光電探測(cè)器的輸 入端光路中設(shè)有檢偏器。
【文檔編號(hào)】G01N21/45GK104359862SQ201410624833
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】王翰林, 劉滿林, 劉俊, 安昕, 張浠 申請(qǐng)人:佛山市南海區(qū)歐譜曼迪科技有限責(zé)任公司