焦糖色素中2、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-四羥基-丁基咪唑的液相色譜檢測方法
【專利摘要】一種焦糖色素中副產(chǎn)物2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-四羥基-丁基咪唑的固相萃取結(jié)合高效液相色譜的檢測方法，該方法包括以下步驟：1.待測樣品溶液制備；2.樣品檢測；3.結(jié)果分析。該方法具有快速檢測，高靈敏度、準確度高、成本低和通用性強等優(yōu)點。
【專利說明】焦糖色素中2、4-甲基咪唑和2-乙?；?4-四羥基-丁基 咪唑的液相色譜檢測方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種焦糖色素中副產(chǎn)物2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙?；?4-四 羥基-丁基咪唑的檢測方法，屬于食品安全檢測的檢驗方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 焦糖色素是一種食品添加劑，俗稱醬色，是一種濃紅褐色的膠體物質(zhì)，占整個食品 著色劑銷量的90 %以上?？蓱糜卺u油，醋，啤酒，醬菜，罐頭，糖果，湯料，焙烤食品，烤煙及 止咳糖漿等各個方面。在焦糖色素的形成過程中主要發(fā)生兩大類反應--美拉德反應和焦 糖化反應，其中普通焦糖色素的生產(chǎn)過程中主要發(fā)生焦糖化反應，生產(chǎn)過程中加入氨(銨） 催化劑的焦糖色素生產(chǎn)以美拉德反應為主。研究發(fā)現(xiàn)，美拉德反應過程中能夠產(chǎn)生許多對 人體有害的化學物質(zhì)，如2-甲基咪唑（2-MEI)、4-甲基咪唑（4-MEI)和2-乙?；鵢4_(1，2， 3,4_四羥基丁基）咪唑（THI)。2-MEI和4-MEI作為神經(jīng)毒素，具有強烈的致驚闕作用，并 且美國國家毒品管理計劃和其它研究者已經(jīng)有明確的毒理學數(shù)據(jù)證明其具有致癌的風險。 2011年，國際腫瘤研究機構(gòu)（IARC)將甲基咪唑類化合物認定為2B類致癌物，而THI可引 起免疫毒性。鑒于咪唑類化合物的毒性，歐盟委員會已經(jīng)對III類焦糖色素中THI和4-MEI 建立了限量規(guī)定，分別為10和200 mg/kg。因此，建立焦糖色素中2-MEI、4-MEI和THI的檢 測方法對保證焦糖色素的品質(zhì)乃至使用焦糖色素著色的包括食品在內(nèi)的眾多產(chǎn)品的品質(zhì) 尤其重要。
[0003] 焦糖色素是一種黑褐色粘稠液體或固體，基質(zhì)極其復雜。如何去除大量基質(zhì)的干 擾，成為準確分析微量甚至痕量的目標物的關鍵。目前，針對焦糖色素中4-MEI含量的測 定，我國唯有食品添加劑焦糖色衛(wèi)生標準GB8817-2001，采用薄層法測定，而對于2-MEI和 THI的測定尚無國家標準，也沒有限量規(guī)定。近年來，國內(nèi)的分析工作者僅在2-MEI和4-MEI 的檢測方法有報道，對于THI檢測方法研究尚無報道；而國內(nèi)外一些分析工作者建立的焦 糖色素中2-MEI、4-MEI或THI的檢測方法，前處理方法主要有：柱層析、液液萃取、離子對萃 取、固相萃取等。柱層析、液液萃取、離子對萃取操作繁瑣，對于大量的樣品分析十分不利， 且這些前處理方法用于THI提取凈化的報道較少。三種目標物的的檢測方法主要有薄層色 譜法、氣相色譜法、液相色譜法、離子色譜法、毛細管電泳法、氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和液-質(zhì)聯(lián)用 技術(shù)。其中的方法大多數(shù)都只能檢測2-MEI、4-MeI或THI中的一種或兩種物質(zhì)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種焦糖色素中副產(chǎn)物2-MEI、4_MEI和THI同時檢測的方 法，該方法包括如下步驟：（1)待測樣品溶液的制備；（2)樣品檢測；和（3)結(jié)果分析。
[0005] ( 1)待測樣品溶液的制備包括如下具體步驟： (a)制備固相萃取上樣溶液：稱取焦糖色素樣品I g (準確至0.001 g),置于10 mL容 量瓶中，加水定容至刻度。取0.2 mL上述樣品溶液，加入0. I mL鹽酸溶液（0. I m〇L/L)，力口 水定各至2mL，混勾后待固相卒取凈化。
[0006] (b)固相萃取柱活化：選擇混合型陽離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為聚苯乙烯-二乙 烯基苯高聚物，60 mg、3 mL，使用前依次用2 mL甲醇、2 mL水活化。
[0007] (c)固相萃取：將（a)制備好的樣品溶液加入（b)中剛活化好的小柱中，控制流速 小于0. 5 mL/min，抽干，加入I mL水和I mL甲醇淋洗，控制流速小于I. 0 mL/min，抽干，用 洗脫液(氨水+甲醇=5+95 (v/v))2 mL洗脫收集，控制流速小于0. 5 mL/min，抽干。將收 集液在低于50 °C條件下，氮氣吹干，殘渣用1.0 mL乙腈-0.05 %氨水（10:90, V/V)定容， 渦旋混合I min，過0.22 Mm水系微孔濾膜，即制得待測樣品溶液。
[0008] 本發(fā)明的實施方案中，步驟（a)中稱量Ig樣品定容到IOmL水中，取0. 1~0. 3mL樣 品溶液準備固相萃取，優(yōu)選〇. 2mL，上樣溶液加水定容至2~3mL，優(yōu)選2mL。
[0009] 本發(fā)明的實施方案中，步驟（c)中1?2mL水和1?2 mL甲醇淋洗，優(yōu)選ImL水和1 mL甲醇淋洗，優(yōu)選2mL洗脫液洗脫。收集液可以在低于50 °C條件下吹干或者旋轉(zhuǎn)濃縮揮 干，殘渣加入定容溶液后需要渦旋Imin或者超聲波30秒溶解并過0. 22 Mm水系微孔濾膜。
[0010] (2)樣品檢測包括如下具體步驟： 標準品溶液的制備：分別準確稱取2-MEI、4-MEI和THI標準品，用水溶解，分別配成0. 5 mg/mL的儲備溶液，使用時，用水稀釋成標準使用溶液。
[0011] 用液相色譜-光電二極管陣列檢測器（LC-DAD)測定待測樣品溶液和標準品溶液。 儀器參考條件如下： 色譜柱：Agilent Polaris C18-A 柱（250 mmX4.6 mm, 5 Mm);流動相：A 為乙腈，B 為0. 05 %氨水溶液，A:B=10:90 ;流速：0. 6 mL/min ;柱溫：30 °C ;進樣量：10 ML ;DAD檢測 器檢測波長：2-MEI、4- MEI 為 215 nm ;THI 為 287 nm。
[0012] 測定各化合物峰面積，然后分別作2-MEI(4-MEI或THI)-2-MEI (4-MEI或THI) 濃度（ng/mL)標準曲線，曲線方程見式（1): y=ax +b .........(1) 式中：X-2-MEI或4-MEI或THI峰面積； y--2-MEI或4-MEI或THI的濃度，單位為鈉克每毫升（ng/mL)。
[0013] (3)結(jié)果分析包括如下具體步驟： 試樣溶液的測定：待測試樣溶液中2-MEI或4-MEI或THI的響應值應在標準曲線線性 范圍內(nèi)，超過線性范圍則應稀釋后再進樣分析。
[0014] 定性判定：按照上述條件測定試樣和標準工作溶液，如果試樣中的目標物色譜峰 保留時間與標準工作溶液一致(變化范圍在±2. 5 %之內(nèi)）；并且樣品色譜峰的光譜圖與標 準溶液的一致，則可判斷樣品中存在目標化合物2-MEI或4-MEI或THI。
[0015] 分析結(jié)果的表述： 試樣中2-MEI (4-MEI或THI)含量按公式（2)計算： X= (C-C0) *V*103/m/IO6.......................................... (2) 式中： X--試樣中2-MEI或4-MEI或THI的含量，單位為克每千克（mg/kg ); C--由標準曲線得試樣進樣液中2-MEI或4-MEI或THI的濃度，單位為鈉克每毫升（ ng/mL )； CO--由標準曲線查得空白試樣進樣液中2-MEI或4-MEI或THI的濃度，單位為鈉克 每毫升（ng/mL ); V--試樣制備液總體積，單位為毫升（mL ); m--試樣質(zhì)量,單位為克（g ); 結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
[0016] 本發(fā)明檢測方法的可行性證實： 配制濃度分別為 10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL 和 1000 ng/mL的2-MEI、4-MEI和THI標準工作液，在優(yōu)化的前處理方法和分離檢測條件下進 行線性范圍試驗，2-MEI、4-MEI和THI線性相關系數(shù)分別可達到0. 9992、0. 9994和0. 9990 以上。
[0017] 方法的檢出限和定量限是衡量方法靈敏度的指標。本研究根據(jù)3倍信噪比（S/ N=3)得到 2-MEI、4-MEI 和 THI 的最低檢出濃度為 0? 05 Pg/rnUO. 06 Pg/mL 和 0? 03 Pg/mL。 當稱樣為I g時，經(jīng)本研究確定的前處理方法處理后最終定容到I mL檢測分析，得到2MEI、 4-MEI和THI的檢出限分別為2. 6 mg/kg、3. 0 mg/kg和L 5 mg/kg，根據(jù)10倍信噪比（S/ N=IO)得到定量限分別為 8. 5 mg/kg、10. 0 mg/kg 和 5. 0 mg/kg。
[0018] 樣品加標回收率和相對標準偏差測定： 采用本發(fā)明的焦糖色素中副產(chǎn)物2-MEI、4-MEI和THI的檢測方法，在焦糖色素中添 加三個濃度水平(見表4,10mg/kg、20mg/kg、200mg/kg) 2-MEI、4-MEI和THI的混合標準溶 液進行加標回收率實驗，實驗步驟同樣品檢測步驟，每個濃度重復6次，結(jié)果見表4, 2-MEI、 4-MEI和THI的加標回收率分別在80. 4?93. 4 %、80. 2?93. 0 %和75. 0?84. 6 %之間。相對 標準偏差小于10%。
[0019] 表4方法的回收率及相對標準偏差（n=6)

【權(quán)利要求】
1. 焦糖色中副產(chǎn)物2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙?；?4-四羥基-丁基咪唑的固 相萃取結(jié)合高效液相色譜的檢測方法，其特征在于，lg樣品溶于10mL水，取0. 2mL樣品溶 液，加入0. lm〇L/L鹽酸溶液0. lmL，加水定容至2mL，混勻后待固相萃取凈化。
2. 選擇混合型陽離子交換固相萃取柱進行凈化，使用前依次用2mL甲醇、2mL水活化。
3. 固相萃取過程中樣品溶液加入剛活化好的小柱中，特征性在于控制上樣流速小于 0. 5mL/min，抽干，加入lmL水和lmL甲醇淋洗，控制流速小于1. OmL/min，抽干，用洗脫液比 例為氨水+甲醇=5+95(v/v)2mL洗脫收集，控制流速小于0. 5mL/min，抽干。
4. 樣品檢測過程特征性在于使用Polaris C18-A柱檢測，流動相：A為0. 05%氨水溶 液；B為乙腈，并且A:B = 10:90。
【文檔編號】G01N30/02GK104359989SQ201410626380
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月7日
【發(fā)明者】榮維廣, 馬永建, 吉文亮 申請人:江蘇省疾病預防控制中心