一種利用植物彗星實(shí)驗(yàn)評價(jià)多環(huán)芳烴基因毒性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用植物彗星實(shí)驗(yàn)評價(jià)PAHs基因毒性的方法，屬于污染物毒性評價(jià)【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法是利用染毒的大白皮蠶豆(Vicia Faba)的根尖進(jìn)行植物彗星實(shí)驗(yàn)，用Komet Version6.0軟件分析彗星圖像，彗星圖像的尾動(dòng)量(TM)值與PAHs污染濃度間有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，可用TM值作為衡量PAHs致DNA損傷的評價(jià)參數(shù)，并直接用于評價(jià)PAHs的基因毒性。本發(fā)明所建立的利用植物彗星實(shí)驗(yàn)來評價(jià)PAHs基因毒性的方法，具有科學(xué)、高效、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于PAHs等有毒有機(jī)物基因毒性的定量評價(jià)。
【專利說明】一種利用植物彗星實(shí)驗(yàn)評價(jià)多環(huán)芳烴基因毒性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及污染物毒性評價(jià)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種利用植物彗星實(shí)驗(yàn)評價(jià)PAHs基因毒性的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]PAHs是有機(jī)物不完全燃燒或熱解產(chǎn)生的具有致畸、致癌、致突變作用的一類持久性有機(jī)污染物，也是環(huán)境中優(yōu)先控制污染物，廣泛存在于土壤、水、大氣中。PAHs具有較強(qiáng)的生理和遺傳毒性，自然降解率低，一旦進(jìn)入環(huán)境則對生態(tài)系統(tǒng)和人群健康構(gòu)成持久威脅。己證實(shí)PAHs對人類及各種生物體具有細(xì)胞毒性、發(fā)育毒性和遺傳毒性，單純用PAHs的濃度很難準(zhǔn)確地反映其實(shí)際毒性，亟待研發(fā)環(huán)境中PAHs毒性的定量評價(jià)技術(shù)。針對PAHs具有的潛在或已被確認(rèn)的“三致”毒性效應(yīng)，評價(jià)PAHs基因毒性顯得極為重要。彗星實(shí)驗(yàn)(cometassay)又叫單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(single cell gel electrophoresis，SCGE)，是一種靈敏性高的遺傳毒性研宄方法，已被用作檢測諸如DNA單鏈和雙鏈斷裂、堿性位點(diǎn)、不完全修復(fù)位點(diǎn)、DNA交聯(lián)等多種類型的DNA損傷；但遺憾的是，國內(nèi)外仍然缺乏利用植物彗星實(shí)驗(yàn)來評價(jià)PAHs基因毒性的相關(guān)技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題提供一種利用植物彗星實(shí)驗(yàn)評價(jià)PAHs基因毒性的方法，該方法利用大白皮蠶豆(Vicia Faba)，取其根尖進(jìn)行植物彗星實(shí)驗(yàn)，用KometVers1n 6.0軟件分析彗星圖像，以尾動(dòng)量(TM)作為衡量PAHs致DNA損傷的參數(shù)，TM值與PAHs污染濃度間有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，可直接用于評價(jià)PAHs的基因毒性。
[0004]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0005]一種利用植物彗星實(shí)驗(yàn)評價(jià)PAHs基因毒性的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟:
[0006](I)選取潔凈的過30目篩的石英砂，將濃度lmg/L的PAHs丙酮溶液加入到石英砂中混勻，待丙酮揮發(fā)完全后，制得含一定濃度(丙酮揮發(fā)完全后剩余多少濃度就是多少濃度)PAHs的石英砂。
[0007](2)挑選大小一致、飽滿無蟲的植物種子，表面消毒后，用去離子水洗凈表面，室溫下用去離子水浸泡種子24h (期間換水2?3次)，然后將種子種于PAHs污染處理的石英砂中，20°C條件下培養(yǎng)4天(每天光照14h，光照強(qiáng)度4000Lx，80%濕度)后，種子生根至一定長度。
[0008](3)選取經(jīng)培養(yǎng)后根長一致的蠶豆幼苗，種于盛有PAHs污染石英砂的玻璃燒杯中，燒杯外壁用黑色塑料袋包裹后，置于人工氣候箱中(20°C，80%濕度，14h光照，光照強(qiáng)度4000Lx)染毒48h，染毒后取出蠶顯幼苗，用去尚子水清洗根部。
[0009](4)取蠶豆幼苗根尖進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，用軟件分析彗星圖像，用尾動(dòng)量(TM)作為評價(jià)DNA損傷的參數(shù)。
[0010]步驟⑴中所述的PAHs為萘、苊、苊烯、芴、菲、蒽、焚蒽、花、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)焚蒽、苯并(k)焚蒽、苯并(a)花、茚并(I, 2, 3-cd)花、苯并(g, h, i)花或二苯并(a, h)蒽。
[0011]步驟⑵中的植物種子為大白皮蠶豆(Vicia Faba)，種子表面消毒是用5%的次氯酸鈉浸泡10分鐘。
[0012]步驟(4)中分析彗星圖像的軟件為Komet Vers1n6.0軟件(Andor TechnologyLtd) ο
[0013]步驟(4)中彗星實(shí)驗(yàn)過程如下:用刀片切下Icm長的蠶豆根尖并用去離子水清洗，將根尖放入在冰上預(yù)冷過的直徑7cm的培養(yǎng)皿中，加入500 μ L冷PBS緩沖液，使根尖伸展開，用新刀片將根尖切成薄片，培養(yǎng)皿在冰上保持傾斜，使分離的細(xì)胞核進(jìn)入緩沖液。彗星實(shí)驗(yàn)采用三層凝膠結(jié)構(gòu)，三層凝膠制備好后，將載玻片放置在4°C冰箱中(不少于5min)，移去蓋玻片，將載玻片放在盛有新配制的4°C的電泳緩沖液(lmmol/LNa2EDTA和300mmol/LNaOH, pH>13)的水平電泳槽中，細(xì)胞核先在緩沖液中裂解5min，使DNA解旋，之后在IV/cm,300mA條件下電泳15min(溶液保持在4°C )，電泳結(jié)束后，載玻片用冷的400mmol/LTris (pH7.5)浸泡5min，用80 μ L (20 μ g/mL)溴化乙錠(EB)染色5min，然后浸入冰水中，去除過量的EB，蓋上蓋玻片。染色后用熒光顯微鏡觀察彗星圖像。對每個(gè)載玻片，在200倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取50個(gè)清晰細(xì)胞核圖像進(jìn)行觀察并用CCD拍攝彗星圖像，用KometVerS1n6.0軟件分析圖像，用尾動(dòng)量(TM)評價(jià)DNA損傷的程度。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行觀察一個(gè)載玻片，每個(gè)載玻片取50個(gè)細(xì)胞核數(shù)據(jù)的中位數(shù)作為其數(shù)值；對于每個(gè)處理，取三個(gè)平行的平均數(shù)作為最終結(jié)果。
[0014]本發(fā)明的有益效果
[0015]采用本發(fā)明方法，利用染毒的大白皮蠶豆(Vicia Faba)的根尖進(jìn)行植物彗星實(shí)驗(yàn)，用Komet Vers1n6.0軟件分析彗星圖像，因?yàn)殄缧菆D像的尾動(dòng)量(TM)值與PAHs污染濃度間有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，所以可用TM值作為衡量PAHs致DNA損傷的評價(jià)參數(shù)，并直接用于評價(jià)PAHs的基因毒性。本發(fā)明建立了利用植物彗星實(shí)驗(yàn)來評價(jià)PAHs基因毒性的方法，該方法科學(xué)、高效、快速、準(zhǔn)確，適用于PAHs等有毒有機(jī)物基因毒性的定量評價(jià)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1蠶豆根細(xì)胞DNA損傷的彗星圖像圖。
[0017]圖2為菲對蠶豆DNA損傷的TM值與菲污染強(qiáng)度的關(guān)系圖。
[0018]圖3為芘對蠶豆DNA損傷的TM值與芘污染強(qiáng)度的關(guān)系圖。
[0019]圖1 中，A:0mg/kg 菲；B:5mg/kg 菲；C: 10mg/kg 菲；D:20mg/kg 菲；E:30mg/kg 菲；F: 50mg/kg 菲。

【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此:
[0021]實(shí)施例1
[0022]本實(shí)施例包括以下幾個(gè)步驟:
[0023]I)污染石英砂制備:選取商品化的石英砂、過30目篩，石英砂清洗干凈后于105°C烘干。配置一定濃度的菲、芘的丙酮溶液，分別加入到石英砂中混勻，然后將處理后的石英砂放入通風(fēng)櫥中，待丙酮揮發(fā)完全后，制得含O?50mg/kg菲、花的石英砂。
[0024]2)種子培養(yǎng)及染毒處理:挑選大小一致、飽滿無蟲的大白皮蠶豆(Vicia faba)種子，用5%的次氯酸鈉浸泡1min進(jìn)行表面消毒，用去離子水沖洗干凈。室溫下用去離子水浸泡24h使種子充分吸脹，期間換水2?3次。浸泡后將種子種于無PAHs的石英砂中，20°C下培養(yǎng)4天(每天14h光照，光照強(qiáng)度4000Lx，80%濕度)，此時(shí)蠶豆幼苗根長約為3?5cm。選取經(jīng)培養(yǎng)后根長一致的蠶豆幼苗，種于盛有菲、芘污染石英砂的玻璃燒杯中，燒杯外壁用黑色塑料袋包裹后，置于人工氣候箱中(20°C，80%濕度，14h光照，光照強(qiáng)度4000LX)染毒48h，染毒后小心取出蠶豆幼苗，用去離子水清洗根部。
[0025]3)彗星實(shí)驗(yàn):參照Gichner于2003年在《Mutat1n Research》雜志上發(fā)表的文章((DNA damage induced by indirect and direct acting mutagens incatalase-deficient transgenic tobacco cellular and acellular comet assay))(535(2):187-193)中關(guān)于彗星實(shí)驗(yàn)的方法，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:用刀片切下Icm長的經(jīng)染毒處理的蠶豆根尖，用去離子水清洗，將根尖放入在冰上預(yù)冷過的直徑7cm的培養(yǎng)皿中，加Λ 500 μ L冷PBS緩沖液，使根尖伸展開，用新刀片將根尖切成薄片，培養(yǎng)皿在冰上保持傾斜，使分離的細(xì)胞核進(jìn)入緩沖液。彗星實(shí)驗(yàn)采用三層凝膠結(jié)構(gòu)，三層凝膠制備好后，將載玻片放置在4°C冰箱中(不少于5min)，移去蓋玻片，將載玻片放在盛有新配制的4°C的電泳緩沖液(lmmol/LNa2EDTA和300mmol/LNa0H，pH>13)的水平電泳槽中，細(xì)胞核先在緩沖液中裂解5min，使DNA解旋，之后在IV.CnT1JOOmA條件下電泳15min (溶液保持在4°C )，電泳結(jié)束后，載玻片用冷的400mmol/L Tris (ρΗ7.5)浸泡5min，用80 μ L (20 μ g/mL)溴化乙錠(EB)染色5min，然后浸入冰水中，去除過量的EB，蓋上蓋玻片。染色后用熒光顯微鏡(ZEISS Ax1n Imager Al)觀察彗星圖像。對每個(gè)載玻片，在200倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取50個(gè)清晰細(xì)胞核圖像進(jìn)行觀察并用CCD (Charge-coupled Device)拍攝彗星圖像，用KometVers1n 6.0軟件(Andor Technology Ltd.)分析圖像，用尾動(dòng)量(TM)評價(jià)DNA損傷的程度。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行觀察一個(gè)載玻片，每個(gè)載玻片取50個(gè)細(xì)胞核數(shù)據(jù)的中位數(shù)作為其數(shù)值；對于每個(gè)處理，取三個(gè)平行的平均數(shù)作為最終結(jié)果。彗星圖像見圖1，測得的TM值見圖2和圖3。
[0026]由圖1中可以看出，隨著菲污染強(qiáng)度升高，彗星圖像拖尾長度逐漸增長，表明DNA損傷程度不斷增大。從圖2和圖3可以看出，衡量蠶豆根尖細(xì)胞DNA損傷程度的TM值隨菲、芘污染強(qiáng)度的提高而增大，存在極顯著的PAHs劑量一基因毒性效應(yīng)關(guān)系，因此可用尾動(dòng)量(TM)作為衡量PAHs致DNA損傷的彗星圖像分析參數(shù)，并直接用于評價(jià)PAHs的基因毒性。
【權(quán)利要求】
1.一種利用植物彗星實(shí)驗(yàn)評價(jià)多環(huán)芳烴(PAHs)基因毒性的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)選取潔凈的過30目篩的石英砂，將濃度lmg/L的PAHs丙酮溶液加入到石英砂中混勻，待PAHs丙酮揮發(fā)完全后，制得含一定濃度PAHs的石英砂； (2)挑選大小一致、飽滿無蟲的蠶豆種子，表面消毒后，用去離子水洗凈表面，室溫下用去離子水浸泡種子24h，浸泡期間換水2?3次，然后將種子種于PAHs污染處理的石英砂中，20°C條件下培養(yǎng)4天，所述培養(yǎng)4天期間每天光照14h，光照強(qiáng)度4000Lx，80%濕度，培養(yǎng)夠4天后種子生根至一定長度； (3)選取經(jīng)培養(yǎng)后根長一致的蠶豆幼苗，種于盛有PAHs污染石英砂的玻璃燒杯中，燒杯外壁用黑色塑料袋包裹后，置于人工氣候箱中(人工氣候箱的條件設(shè)置為:20°C，80%濕度，14h光照，光照強(qiáng)度4000Lx)染毒48h，染毒后取出蠶顯幼苗，用去尚子水清洗根部； (4)取蠶豆幼苗根尖進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，用軟件分析彗星圖像，用尾動(dòng)量(TailMoment, TM)作為評價(jià)DNA損傷的參數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用植物彗星實(shí)驗(yàn)評價(jià)PAHs基因毒性的方法，其特征在于:步驟(I)中所述的PAHs為萘、苊、苊烯、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)熒蒽、苯并(k)焚蒽、苯并(a)花、茚并(I, 2, 3-cd)花、苯并(g, h, i)花或二苯并(a, h)蒽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用植物彗星實(shí)驗(yàn)評價(jià)PAHs基因毒性的方法，其特征在于:步驟(2)中的植物種子為大白皮蠶豆(ViciaFaba)，種子表面消毒是用5%的次氯酸鈉浸泡10分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用植物彗星實(shí)驗(yàn)評價(jià)PAHs基因毒性的方法，其特征在于:步驟(4)中分析彗星圖像的軟件為Komet Vers1n 6.0軟件(Andor Technology Ltd)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用植物彗星實(shí)驗(yàn)評價(jià)PAHs基因毒性的方法，其特征在于，步驟(4)中彗星實(shí)驗(yàn)過程如下:用刀片切下Icm長的蠶豆根尖并用去離子水清洗，將根尖放入在冰上預(yù)冷過的直徑7cm的培養(yǎng)皿中，加入500 μ L冷PBS緩沖液，使根尖伸展開，用新刀片將根尖切成薄片，培養(yǎng)皿在冰上保持傾斜，使分離的細(xì)胞核進(jìn)入緩沖液。彗星實(shí)驗(yàn)采用三層凝膠結(jié)構(gòu)，三層凝膠制備好后，將載玻片放置在4°C冰箱中，不少于5min，移去蓋玻片，將載玻片放在盛有新配制的4°C的電泳緩沖液(lmmol/L Na2EDTA和300mmol/L Na0H，pH>13)的水平電泳槽中，細(xì)胞核先在緩沖液中裂解5min，使DNA解旋，隨后在lV/cm、300mA條件下電泳15min (溶液保持在4°C )，電泳結(jié)束后，載玻片用冷的400mmol/L Tris (pH7.5)浸泡5min，用80yL(20yg/mL)溴化乙錠(EB)染色5min，然后浸入冰水中，去除過量的EB，蓋上蓋玻片。染色后用熒光顯微鏡觀察彗星圖像；對每個(gè)載玻片，在200倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取50個(gè)清晰細(xì)胞核圖像進(jìn)行觀察并用(XD拍攝彗星圖像，用Komet Vers1n 6.0軟件分析圖像，用尾動(dòng)量(TM)評價(jià)DNA損傷的程度；每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行觀察一個(gè)載玻片，每個(gè)載玻片取50個(gè)細(xì)胞核數(shù)據(jù)的中位數(shù)作為其數(shù)值；對于每個(gè)處理，取三個(gè)平行的平均數(shù)作為最終結(jié)果。
【文檔編號】G01N27/447GK104458873SQ201410633561
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】高彥征, 高曦, 胡小婕, 康福星 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)