一種基于多孔硅的陣列生物芯片及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于多孔硅的陣列生物芯片的制備方法及其用途，步驟1：單晶硅片單面拋光，采用電化學(xué)方法制備出多孔硅Bragg多層結(jié)構(gòu),硅片未拋光面稱為待光刻層；步驟2：在前述待光刻層上，進(jìn)行高能激光刻蝕、聚焦電子或離子束刻蝕，得到表面為陣列光子晶體的器件；步驟3：對得到的硅片進(jìn)行后處理：硅烷化；步驟4：步驟3得到的硅片進(jìn)行戊二醛化學(xué)修飾；即得一面為層狀Bragg反射器，另一面為光子晶體的基于多孔硅的陣列生物芯片。
【專利說明】一種基于多孔硅的陣列生物芯片及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于多孔硅的陣列生物芯片及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]多孔硅作為基底材料用于生物檢測已經(jīng)被廣泛的作為實驗研究和應(yīng)用。多孔硅通過電化學(xué)腐蝕的時候交替使用不同電流，可以制備出各種多孔硅多層結(jié)構(gòu)，電化學(xué)腐蝕技術(shù)配合光刻等技術(shù)還可以制備出多孔硅波導(dǎo)、多孔硅光柵等各種結(jié)構(gòu)。無論哪種類型的多孔硅生物傳感器歸根到底原理都是生物分子進(jìn)入了多孔硅層的多孔結(jié)構(gòu)后增大了多孔硅層的折射率，折射率增大的多少和進(jìn)入生物分子的多少有關(guān)，因此利用多孔硅層的折射率的改變，就可以通過計算機(jī)模擬加入生物的實驗。
[0003]目前報道的基于多孔硅微腔的生物傳感器很多，檢測方法包括:反射光譜的檢測和拉曼、熒光光譜的檢測。
[0004]CN101710118A公開了一種基于多孔娃三兀結(jié)構(gòu)微腔的光學(xué)免疫檢測方法，該方法采用基于計算機(jī)精確控制的電化學(xué)腐蝕方法制備多孔硅微腔，其中多孔硅微腔內(nèi)上、下的Bragg結(jié)構(gòu)由三種電流密度交替進(jìn)行電化學(xué)腐蝕而形成，其特征在于對于不同條件制備的多孔硅微腔進(jìn)行編碼可以實現(xiàn)多元檢測，如果是一元檢測則不需要編碼，使抗體或抗原在多孔硅三元結(jié)構(gòu)微腔的孔洞里結(jié)合，多元檢測中抗原或抗體的種類利用多孔硅微腔的編碼進(jìn)行標(biāo)識，而通過生物反應(yīng)前后的光譜峰位變化進(jìn)行檢測樣品中相應(yīng)的抗原或抗體濃度，所述檢測方法包括以下步驟:
1)抗原或抗體固定在多孔硅微腔的孔洞里，如果是需要編碼的多元檢測，那么一種編碼的多孔硅微腔對應(yīng)固定一種待測生物分子的特異性抗原或抗體，沖洗未結(jié)合的分子并封閉多孔硅微腔里的未結(jié)合生物分子的空白鍵位，記錄測定固定有抗原或抗體的多孔硅微腔光譜；
2)不同多孔硅微腔與不同濃度待測溶液發(fā)生反應(yīng)，使抗原-抗體在多孔硅微腔的孔洞里特異性結(jié)合，反應(yīng)后進(jìn)行沖洗，記錄多孔硅微腔光譜及編碼確定種類和濃度。
[0005]這種光學(xué)免疫檢測方法不僅兼具多孔硅和光子帶隙結(jié)構(gòu)傳感器的諸多優(yōu)異性能，而且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性很好，通過編碼檢測技術(shù)更是可以實現(xiàn)多元檢測。此外，由于采用的制備方法較為簡單，價格相對低廉，有一定的商業(yè)應(yīng)用前景。
[0006]CN1922486A公開了一種用于分析生物樣品中內(nèi)含物的方法，包括:a)在合適的結(jié)合條件下，使所述生物樣品與納米多孔半導(dǎo)體傳感器接觸，所述納米多孔半導(dǎo)體傳感器包括納米多孔半導(dǎo)體結(jié)構(gòu)和連接到所述多孔半導(dǎo)體結(jié)構(gòu)上的一個或多個第一探針，所述納米多孔半導(dǎo)體結(jié)構(gòu)包括置于上層和下層之間的中心層，所述上層和下層都包括5至20層交替多孔性層；所述一個或多個第一探針特異性結(jié)合所述樣品中的至少一個分析物，形成一個或多個結(jié)合復(fù)合物；b)在適合促進(jìn)它們的特異性結(jié)合的條件下，使所述一個或多個結(jié)合復(fù)合物與拉曼活性探針接觸；c)照射所述傳感器，以便從所述傳感器引發(fā)熒光發(fā)射，所述發(fā)射產(chǎn)生來自所述結(jié)合復(fù)合物的拉曼光譜；和d)檢測由所述結(jié)合復(fù)合物產(chǎn)生的拉曼信號；其中，與所述結(jié)合分析物有關(guān)的拉曼信號表明所述樣品中所述分析物的存在以及類型。
[0007]該方法提供用級聯(lián)拉曼傳感用于分析生物樣品例如血清中內(nèi)含物的方法。使具有特異性結(jié)合已知分析物的探針的、產(chǎn)生熒光的納米多孔生物傳感器與生物樣品接觸，形成連接于多孔半導(dǎo)體結(jié)構(gòu)的一個或多個結(jié)合復(fù)合物。將結(jié)合復(fù)合物與拉曼活性探針接觸，該拉曼活性探針特異性結(jié)合該結(jié)合復(fù)合物，照射生物傳感器，從生物傳感器產(chǎn)生熒光發(fā)射。檢測結(jié)合復(fù)合物產(chǎn)生的拉曼信號，與結(jié)合的含蛋白質(zhì)分析物有關(guān)的拉曼信號表明樣品中含蛋白質(zhì)化合物的存在。
[0008]CN103979543A公開了一種多孔硅的修飾方法及其用作生物傳感器的用途，通過電化學(xué)刻蝕方法制備多孔硅，刻蝕液為氫氟酸:無水乙醇體積比為3:1 ;優(yōu)選地電流密度為600mA/cm2,蝕刻時間為20秒；⑵將步驟⑴得到的多孔硅進(jìn)行烷氧基硅烷修飾；⑶將步驟⑵得到的烷氧基硅烷修飾的多孔硅與4- (二乙氨基)水楊醛反應(yīng)，得到帶有芳叔胺基團(tuán)的多孔硅K4)將步驟⑶得到的帶有芳叔胺基團(tuán)的多孔硅浸泡在離子交換水中，去除殘存的有機(jī)物。通過對多孔硅進(jìn)行修飾，得到了制備工藝簡單，價格低廉的修飾多孔硅，檢測靈敏度達(dá)到8400± 10nm/折射率單位以上，能夠進(jìn)行實時在線非標(biāo)記光學(xué)檢測生物分子。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種基于多孔硅的陣列生物芯片及其制備方法，及其用于生物檢測的方法。
[0010]首先，單晶硅片單面拋光，采用電化學(xué)方法制備出多孔硅多層結(jié)構(gòu)；硅片未拋光的一面稱為待光刻層；其次，在待光刻層上進(jìn)行高能激光刻蝕、聚焦電子或離子束刻蝕，得到表面為陣列光子晶體的硅片；最后，對得到的陣列硅片進(jìn)行后處理:硅烷化和戊二醛化學(xué)修飾；即得一面為層狀Bragg反射器，另一面為光子晶體的基于多孔硅的陣列生物芯片。
[0011]將該陣列生物芯片用于折射率檢測，功能化器件后添加生物分子，造成折射率增力口，通過FDTD法計算可知，這種結(jié)構(gòu)的反射譜中出現(xiàn)非常尖銳且反射率極強的峰值，并對光子晶體折射率變化極為敏感，具有極高的探測靈敏度。
[0012]步驟1.多孔硅的制備:
P型單晶硅的電化學(xué)陽極腐蝕制備多孔硅。
[0013]采用P型〈100〉單面拋光單晶硅片，厚度為500±10 μ m。實驗前分別用丙酮、無水乙醇、去離子水對硅片進(jìn)行超聲洗15分鐘。對經(jīng)過清洗后的單晶硅片進(jìn)行電化學(xué)腐蝕。腐蝕液是由40%的氫氟酸和99%的乙醇按照體積比HF = CH3CH2OH=1:1比例混合而成。腐蝕過程分別由電流密度為100-150mA/cm2和300-400mA/cm2的恒流源引導(dǎo)。首先用電流密度為100-150mA/cm2，腐蝕時間為10_20s，暫停5_10s，再用電流密度為300-400 mA/cm2,腐蝕時間為10-20 S，再暫停5-10 S，以此交替腐蝕8-10個周期。硅片未拋光的一面稱為待光刻層。
[0014]步驟2.表面光子晶體的制備
使用高能激光刻蝕、聚焦電子或離子束刻蝕等手段，在待光刻層上按預(yù)定設(shè)計制出陣列凹槽，凹槽寬度可通過選擇合適的激光束斑尺寸、電子或離子束能量來控制。
[0015]步驟3.將得到的硅片進(jìn)行烷氧基硅烷修飾
將步驟2得到的硅片以質(zhì)量比1:20-30分散于有機(jī)溶劑中，超聲處理l_2h，滴加烷氧基硅烷，90-100°C反應(yīng)2-4h，反應(yīng)結(jié)束后過濾除去溶劑，用無水乙醇洗滌數(shù)次，真空干燥，即得烷氧基硅烷修飾的硅片。
[0016]步驟4.將得到的烷氧基硅烷修飾的硅片與戊二醛反應(yīng):
將步驟3得到的烷氧基硅烷修飾的硅片分散到無水乙醇中，超聲處理10-20min，加入戊二醛，攪拌回流6-8h后傾出上層懸浮液，過濾除去溶劑后用無水乙醇洗滌數(shù)次，真空干燥；烷氧基硅烷修飾的硅片與戊二醛的質(zhì)量比為1:5-10 ;將得到的硅片浸泡在離子交換水中，去除殘存的有機(jī)物。
[0017]優(yōu)選地，步驟3中有機(jī)溶劑為甲苯或二甲苯或THF或DMF，溶劑的選擇對于最終得到的硅片的靈敏度影響不大；烷氧基硅烷優(yōu)選為Y-氨丙基三甲氧基硅烷或Y-氨丙基三乙氧基硅烷，其中，烷氧基硅烷與硅片的質(zhì)量比為1:0.1-1:0.5。
[0018]優(yōu)選地，通過刻蝕技術(shù)得到的表面光子晶體層的厚度與層狀Bragg反射器的厚度比值為1:2-3: 4，更加優(yōu)選地為2:3.本發(fā)明中通過電化學(xué)和刻蝕技術(shù)相結(jié)合的方法，得到一面為層狀Bragg反射器，另一面為光子晶體的基于多孔硅的陣列生物芯片，產(chǎn)品的檢測靈敏度可以高達(dá)10000±100nm/折射率單位以上。

【具體實施方式】
[0019]
實施例1:
⑴通過電化學(xué)刻蝕方法制備多孔硅:采用P型〈100〉單面拋光單晶硅片，厚度為500±10μπι。實驗前分別用丙酮、無水乙醇、去離子水對硅片進(jìn)行超聲洗15分鐘。對經(jīng)過清洗后的單晶硅片進(jìn)行電化學(xué)腐蝕。腐蝕液是由40%的氫氟酸和99%的乙醇按照體積比HF: CH3CH2OH=1:1比例混合而成。腐蝕過程分別由電流密度為120mA/cm2和350mA/cm2的恒流源引導(dǎo)。首先用電流密度為120mA/cm2，腐蝕時間為15s，暫停6s，再用電流密度為350mA/cm2,腐蝕時間為15 S，再暫停6 S，以此交替腐蝕10個周期。硅片未拋光的一面稱為待光刻層。
[0020]⑵使用聚焦電子束刻蝕手段，在待光刻層上按預(yù)定設(shè)計制出陣列凹槽，凹槽寬度可通過選擇合適的電子束能量來控制。
[0021]⑶將步驟2得到的硅片以質(zhì)量比1:20分散于有機(jī)溶劑甲苯中，超聲處理lh，滴加烷氧基硅烷，90°C反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后過濾除去溶劑，用無水乙醇洗滌數(shù)次，真空干燥，即得烷氧基硅烷修飾的硅片。
[0022]⑷將步驟3得到的烷氧基硅烷修飾的硅片分散到無水乙醇中，超聲處理lOmin，加入戊二醛，攪拌回流6h后傾出上層懸浮液，過濾除去溶劑后用無水乙醇洗滌數(shù)次，真空干燥；烷氧基硅烷修飾的硅片與戊二醛的質(zhì)量比為1:5 ;將得到的硅片浸泡在離子交換水中，去除殘存的有機(jī)物。
[0023]經(jīng)測試，通過電子束刻蝕技術(shù)得到的表面光子晶體層的厚度與層狀Bragg反射器的厚度比值為1:2。
[0024]制備的經(jīng)修飾的多孔硅陣列生物芯片的穩(wěn)定性檢測:修飾的多孔硅陣列生物芯片試樣放入聚甲基丙烯酸甲酯制成的流式槽中，不同的pH值的磷酸鹽緩沖液依次通過微流泵送入流式槽中，每次送入緩沖液前用PH7.4，0.0lM磷酸鹽緩沖液洗滌流式槽5分鐘。光學(xué)反射干涉光譜通過Y型光纖拾取光學(xué)信號，實時監(jiān)控薄膜光學(xué)厚度變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)修飾的多孔硅陣列生物芯片的光學(xué)厚度在PH2-12范圍變化的磷酸鹽緩沖液中，變化很穩(wěn)定。
[0025]靈敏度檢測:將1uL不同折射率的有機(jī)化合物滴在硅片的表面，檢測光學(xué)厚度的變化，以折射率為橫軸，光學(xué)厚度為縱軸繪制線性關(guān)系圖，以折射率改變I個單位的光學(xué)厚度變化量為試樣的靈敏度。本發(fā)明實施例1中多孔硅陣列生物芯片的靈敏度為10850 ±90nm/折射率單位。
[0026]實施例2:
步驟3中的有機(jī)溶劑選用THF，其它同實施例1.所得的靈敏度達(dá)到11800±80nm/折射率單位。
[0027]實施例3:
步驟3中的有機(jī)溶劑選用DMF，其它同實施例1.所得的靈敏度達(dá)到11500±50nm/折射率單位。
[0028]實施例4:
步驟3中的有機(jī)溶劑選用二甲苯，其它同實施例1.所得的靈敏度達(dá)到10810±50nm/折射率單位。
[0029]實施例5:
調(diào)整工藝參數(shù)，使得通過電子束刻蝕技術(shù)得到的表面光子晶體層的厚度與層狀Bragg反射器的厚度比值為2:3.所得的靈敏度達(dá)到13000±50nm/折射率單位。
[0030]實施例6:
調(diào)整工藝參數(shù)，使得通過電子束刻蝕技術(shù)得到的表面光子晶體層的厚度與層狀Bragg反射器的厚度比值為3:4.所得的靈敏度達(dá)到10750±50nm/折射率單位。
[0031]對比例1:
按照CN103979543A的方法制備多孔硅片，測試所得到的靈敏度為8600 ± I 1nm/折射率單位。
[0032]對比例2:
基本同實施例1，區(qū)別在于:過電子束刻蝕技術(shù)得到的表面光子晶體層的厚度與層狀Bragg反射器的厚度比值為1:3.測試所得到的靈敏度為8700±75nm/折射率單位。
[0033]對比例3:
基本同實施例1，區(qū)別在于:通過電子束刻蝕技術(shù)得到的表面光子晶體層的厚度與層狀Bragg反射器的厚度比值為4:5.測試所得到的靈敏度為8800±90nm/折射率單位。
[0034]通過實施例1與比較例I對比可見，本發(fā)明的步驟2處理均對最終多孔硅陣列生物芯片的靈敏度有重要影響。本發(fā)明的靈敏度均在1000nm/折射率單位以上，而現(xiàn)有技術(shù)均在9000 nm/折射率單位以下，這是因為表面光子晶體增強了對生物分子的激發(fā)強度，而層狀光子晶體阻止向下輻射的自由空間模，增強表面的出射光強度。
[0035]實施例1與2-4的比較可見，步驟3中溶劑的選擇對最終產(chǎn)品的靈敏度沒有太大影響，THF和DMF作為溶劑的靈敏度稍高，原理尚不清楚。
[0036]實施例1與實施例5-6，比較例2-3的對比可見，通過步驟2刻蝕技術(shù)得到的表面光子晶體層的厚度與通過步驟I得到的層狀Bragg反射器的厚度比值為1:2-3:4為佳，其中2:3為最佳，若厚度比值不在此數(shù)值范圍內(nèi)，則起不到靈敏度增高的效果，原理尚不明確。
【權(quán)利要求】
1.一種基于多孔硅的陣列生物芯片的制備方法，其特征在于:步驟1:單晶硅片單面拋光，米用電化學(xué)方法制備出多孔娃Bragg多層結(jié)構(gòu),娃片未拋光的一面稱為待光刻層；步驟2:在前述待光刻層上，進(jìn)行高能激光刻蝕、聚焦電子或離子束刻蝕，得到表面為陣列光子晶體的硅片；步驟3:對得到的硅片進(jìn)行后處理:硅烷化；步驟4:步驟3得到的硅烷化的硅片進(jìn)行戊二醛化學(xué)修飾；即得一面為層狀Bragg反射器，另一面為光子晶體的基于多孔硅的陣列生物芯片；通過步驟2的刻蝕技術(shù)得到的表面光子晶體層的厚度與通過步驟I得到的層狀Bragg反射器的厚度比值為1:2-3:4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:通過步驟2的刻蝕技術(shù)得到的表面光子晶體層的厚度與通過步驟I得到的層狀Bragg反射器的厚度比值為2:3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟I中多孔硅的制備方法為P型單晶硅的電化學(xué)陽極腐蝕制備方法，包括步驟:采用P型〈100〉單面拋光單晶硅片，厚度為500±10μπι，實驗前分別用丙酮、無水乙醇、去離子水對硅片進(jìn)行超聲洗15分鐘，對清洗后的單晶硅片進(jìn)行電化學(xué)腐蝕，腐蝕液是由40%的氫氟酸和99%的乙醇按照體積比HF = CH3CH2OH=1:1比例混合而成，腐蝕過程分別由電流密度為100-150mA/cm2和300-400mA/cm2的恒流源引導(dǎo)，首先用電流密度為100-150mA/cm2的電流腐蝕10_20s，暫停5-lOs，再用電流密度為300-400 mA/cm2的電流腐蝕10-20 S，再暫停5-10 S，以此交替腐蝕8-10個周期。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟2中使用高能激光刻蝕、聚焦電子或離子束刻蝕，在待光刻層上按預(yù)定設(shè)計制出陣列凹槽，凹槽寬度可通過選擇合適的激光束斑尺寸、電子或離子束能量來控制。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:將步驟2得到的表面為陣列光子晶體的陣列硅片以質(zhì)量比1:20-30分散于有機(jī)溶劑中，超聲處理l_2h，滴加烷氧基硅烷，90-100°C反應(yīng)2-4h，反應(yīng)結(jié)束后過濾除去溶劑，用無水乙醇洗滌數(shù)次，真空干燥，即得烷氧基硅烷修飾的硅片；烷氧基硅烷與硅片的質(zhì)量比為1:0.1-1:0.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述有機(jī)溶劑為THF或DMF;烷氧基硅烷優(yōu)選為Y-氨丙基二甲氧基娃燒或Y-氨丙基二乙氧基娃燒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:將步驟3得到的烷氧基硅烷修飾的硅片分散到無水乙醇中，超聲處理10-20min，加入戊二醛，攪拌回流6_8h后傾出上層懸浮液，過濾除去溶劑后用無水乙醇洗滌數(shù)次，真空干燥；烷氧基硅烷修飾的硅片與戊二醛的質(zhì)量比為1:5-10 ;將得到的硅片浸泡在離子交換水中，去除殘存的有機(jī)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備得到的基于多孔硅的陣列生物芯片。
9.權(quán)利要求8所述的芯片作為生物傳感器用于光學(xué)非標(biāo)記生物檢測的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于:待測樣品是各種可溶性受體分子，優(yōu)選是血清、組織液、毒品或興奮劑。
【文檔編號】G01N21/45GK104406936SQ201410655797
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】呂小毅, 莫家慶, 賈振紅, 王佳佳 申請人:新疆大學(xué)