一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條及其制備方法，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC底板，特點(diǎn)是在PVC底板上按順序依次粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，該結(jié)合墊上包被有所述的抗惡臭假單胞菌卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物，該硝酸纖維素膜上分別包被有惡臭假單胞菌超聲波破碎液構(gòu)成的檢測(cè)線(xiàn)和兔抗雞卵黃抗體構(gòu)成的質(zhì)控線(xiàn)，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、準(zhǔn)確性高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫化學(xué)檢測(cè)技術(shù)，尤其是涉及一種基于卵黃抗體的膠體金免疫層析 技術(shù)用以快速檢測(cè)環(huán)境、食品、人和動(dòng)物各種組織，血液及糞便樣品中惡臭假單胞菌的檢測(cè) 試紙條及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 假單胞菌屬是微生物的重要類(lèi)群，也是自然界分布最廣泛的微生物之一。 惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)屬假單胞菌屬（Pseudomonas)，假單胞菌科 (Pseudomonadaceae)，為革蘭氏陰性菌，廣泛存在于土壤、海水、淡水動(dòng)植物體表及各種含 蛋白食品中，為人或動(dòng)物源性或機(jī)會(huì)致病菌。目前，國(guó)內(nèi)也陸續(xù)報(bào)道了一些由惡臭假單胞 菌引起的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)和甲殼動(dòng)物的疾病，如歐洲鰻（Anguilla anguilla)的爛鰓病、大黃魚(yú) (Pseudosciaena crocea)的肝腎白點(diǎn)病，羅氏沼奸（Macrobrachium rosenbergii)的黑觸 病及三撫梭子蟹（Portunus trituberculatus)的牛奶病等，這些疾病一旦爆發(fā)，傳播迅速， 死亡率高，給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的損失。環(huán)境中的惡臭假單胞菌也可能隨食物進(jìn)入腸道， 在一定條件下該菌異常增殖，破壞了腸道內(nèi)正常菌群的平衡而造成魚(yú)體發(fā)病，已經(jīng)成為養(yǎng) 殖魚(yú)類(lèi)的重要病原。同時(shí)惡臭假單胞菌也是人的條件致病菌，在一定條件下攻擊機(jī)體免疫 力低下人群，該菌感染人體自溶后釋放出內(nèi)毒素可致中毒癥狀，多系統(tǒng)感染，敗血癥，甚至 感染性休克。惡臭假單胞菌為一種人畜共患病菌，近年來(lái)，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用， 惡臭假單胞菌的感染有上升趨勢(shì)，且該菌對(duì)多種抗菌藥物具有較高的耐藥性，因此，若能確 定病因，及時(shí)對(duì)癥下藥，勢(shì)必能給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)減少損失，同時(shí)，在醫(yī)學(xué)方面也具有重要意義。
[0003] 目前，病原體的檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)、電鏡觀察、PCR、ELISA、色譜分析等，這 些方法多耗時(shí)耗力，需要專(zhuān)用場(chǎng)地和儀器設(shè)備，需要專(zhuān)業(yè)人員操作。對(duì)于惡臭假單胞菌感 染，根據(jù)微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)需先對(duì)其進(jìn)行增菌實(shí)驗(yàn)，挑選特定菌株用全自動(dòng)微生物分析儀分 析鑒定，整個(gè)過(guò)程操作繁瑣，而且需要專(zhuān)業(yè)人員在無(wú)菌條件下進(jìn)行，結(jié)果也需數(shù)天才能獲 得，不利于對(duì)病源的確定及病情的及時(shí)控制。
[0004] 膠體金免疫層析試驗(yàn)（gold-immunochromatography assay GICA)是 20 世紀(jì) 80 年代開(kāi)始發(fā)展起來(lái)的新的免疫分析方式，是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，基 于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，它具有簡(jiǎn)便，快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，費(fèi)用低 等優(yōu)點(diǎn)。依據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)，在國(guó)內(nèi)外無(wú)論人醫(yī)應(yīng)用方面，還是獸醫(yī)應(yīng)用方面，都已 經(jīng)研制出了多種膠體金免疫層析快速檢測(cè)各種病原和有毒有害物質(zhì)的試紙條。但是，目前 國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有公開(kāi)任何關(guān)于惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條及其制備方法的相關(guān)研究報(bào)道。
[0005] 雞卵黃抗體即卵黃中的免疫球蛋白（immunoglobulin of yolk, IgY)，是針對(duì)特定 抗原的，具有持續(xù)效價(jià)的高親和力抗體。用雞做宿主來(lái)產(chǎn)生抗特定抗原的IgY，飼養(yǎng)簡(jiǎn)單，無(wú) 需采血，只需使用少量抗原即可產(chǎn)生大量抗體，從卵黃中提取的IgY純度高、含量大。在疾 病的檢測(cè)、診斷方面，IgY因免疫學(xué)特性獨(dú)特，動(dòng)物種系發(fā)生學(xué)距離遠(yuǎn)，其特異性和針對(duì)性較 哺乳動(dòng)物抗體更強(qiáng)，應(yīng)用于免疫診斷中，可減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)，從而提高檢測(cè)的特異性，是 近年來(lái)新興的研究領(lǐng)域。但是，目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有公開(kāi)任何關(guān)于惡臭假單胞菌IgY的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的特異性強(qiáng)、靈 敏度高、檢測(cè)速度快、成本低并且操作簡(jiǎn)便的惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條及其制備方法，滿(mǎn)足 了現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條， 所述的試紙條由PVC底板和在PVC底板上依次搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸 水墊；所述的結(jié)合墊上包被有抗惡臭假單胞菌卵黃抗體_膠體金標(biāo)記物，所述的硝酸纖維 素膜上分別設(shè)置有由惡臭假單胞菌超聲波破碎液包被的檢測(cè)線(xiàn)和由兔抗雞卵黃抗體（IgY) 包被的質(zhì)控線(xiàn)。
[0008] 所述的抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物的制備方法如下：將將抗惡臭假 單胞菌卵黃抗體與膠體金溶液（顆粒直徑為25-50nm)按6-8 ii g : ImL混合，在pH 5. 4的條 件下通過(guò)攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加入加含IOwt%的牛血清白蛋白的PBST緩沖液作 為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚 物，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的抗惡臭假單胞菌卵黃抗體，取離心 管底部暗紅色沉淀即得到抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物。
[0009] 一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條的制備方法，包括以下步驟：
[0010] ⑴樣品墊的制備
[0011] 將玻璃纖維紙浸泡于含Iwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、Iwt%海藻糖、Iwt%吐 溫-20的0. OlM pH 7. 2的PBS緩沖液中30min后取出，于37°C干燥2-3h即得到樣品墊，真 空封裝，4 °C保存?zhèn)溆茫?br> [0012] (2)特定包被的結(jié)合墊的制備
[0013] 將玻璃纖維紙浸泡于含Iwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、Iwt%海藻糖，Iwt%吐 溫-20的0. OlM pH 7. 2的PBS緩沖液中30min后，于37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻 璃纖維紙上均勻噴涂10-20 y L的抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物，真空冷凍干燥 l-2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0014] (3)特定包被的硝酸纖維素膜的制備
[0015] 將惡臭假單胞菌超聲波破碎液用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成檢測(cè)線(xiàn)，將 兔抗雞卵黃抗體用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成質(zhì)控線(xiàn)，即得到特定包被的硝酸纖 維膜，真空冷凍干燥1-1. 5h，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫黄渲袡z測(cè)線(xiàn)與質(zhì)控線(xiàn)相互平行，所述 的檢測(cè)線(xiàn)靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控線(xiàn)靠近吸水墊端；
[0016] (4)試紙條的制備
[0017] 將步驟⑴得到的樣品墊、步驟⑵得到的特定包被的結(jié)合墊、步驟（3)得到的特 定包被的硝酸纖維素膜和吸水墊按序搭接并粘貼于底板上，裁成4-6_寬的細(xì)條，即得惡 臭假單胞菌檢測(cè)試紙條，真空封裝，4°C保存。
[0018] 所述的惡臭假單胞菌抗原的制備方法如下：取實(shí)驗(yàn)室_80°C保存的惡臭假單胞菌 種，在LB固體培養(yǎng)基中劃線(xiàn)活化，28°C倒置培養(yǎng)24h后挑取單菌落接種于含5mL LB液體 培養(yǎng)基的試管中，28°C，200rpm培養(yǎng)12-18h，將培養(yǎng)的菌液用LB液體培養(yǎng)基按1 : 100稀 釋到三角燒瓶中，28°C，200rpm擴(kuò)大培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間測(cè)其0D600值，當(dāng)其0D600值達(dá)到 0. 4-0. 6時(shí)停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌液在4°C進(jìn)行5000rpm離心lOmin，棄上清，下層沉淀用 pH 7. 2的0. OlM PBS重懸洗滌，再次5000rpm離心lOmin，沉淀用PBS重復(fù)上述洗滌2次， 最終得到的沉淀即為惡臭假單胞菌抗原。
[0019] 所述的抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物的制備方法如下：
[0020] (1)抗惡臭假單胞菌卵黃抗體的制備
[0021] 將上述惡臭假單胞菌抗原與無(wú)菌生理鹽水混合得到惡臭假單胞菌懸液，加入甲 醛使甲醛體積終濃度達(dá)0. 5%，然后37°C恒溫水浴滅活24h，即得到滅活的惡臭假單胞菌 抗原；取健康的初產(chǎn)蛋的母雞作為免疫對(duì)象，將滅活的惡臭假單胞菌抗原和弗氏完全佐 劑等體積混合，充分乳化后對(duì)母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉注射進(jìn)行基礎(chǔ)免疫， 每只母雞免疫劑量為4X IO9CFU, 15-20天后，將滅活的惡臭假單胞菌抗原和弗氏不完全 佐劑進(jìn)行等體積混合，充分乳化后對(duì)母雞肌肉注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只母雞免疫劑量為 2X IO9CFU,加強(qiáng)免疫重復(fù)進(jìn)行三次，每次間隔時(shí)間為7-10天，然后收集雞蛋測(cè)定效價(jià)，當(dāng)卵 黃抗體效價(jià)> 1 : 20000時(shí)收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體；
[0022] (2)膠體金標(biāo)記抗惡臭假單胞菌卵黃抗體
[0023] 將抗惡臭假單胞菌卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為25_50nm的膠體金溶液按 6-81^ :11111混合，在口115.4的條件下通過(guò)攪拌振蕩3〇-6〇1]1；[11使其結(jié)合，加含10￥1:%的牛 血清白蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分 穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的抗惡臭 假單胞菌卵黃抗體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo) 記物，用含Iwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、Iwt%海藻糖，0. 02wt%疊氮化鈉的pH 7. 2 的0. OlM PBS重懸至所述膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃度。
[0024] 用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體的具體方法如下：稱(chēng)取適量步驟（1)分離得到 的卵黃，按質(zhì)量比1 : 9加入？115.0的0.0511的乙酸-乙酸鈉緩沖液，攪拌均勻后41：靜置 過(guò)夜，8000g離心20min，取上清液加入飽和硫酸銨至飽和度為40%，4°C攪拌6h，IOOOOg離 心20min，沉淀用10-20倍卵黃質(zhì)量的雙蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40 %，4°C 攪拌過(guò)夜，IOOOOg離心20min，沉淀用少量pH 7. 2的0. OlM的PBS緩沖液重懸后，在PBS緩 沖液中透析即得到抗惡臭假單胞菌卵黃抗體。
[0025] 步驟（2)中膠體金制備方法如下：將IOOmL 0. Olwt%的氯金酸溶液，加熱煮沸后， 邊攪拌邊加入l_2mL lwt%檸檬酸三鈉迅速搖勻，繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色變黑變紅色，至 顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5-10min，冷卻后補(bǔ)足失水至IOOmL，無(wú)菌密封，4°C避光保存。
[0026] 所述的檢測(cè)線(xiàn)距離所述的結(jié)合墊6-8mm ;所述的質(zhì)控線(xiàn)距離所述的吸水墊6-8mm， 所述的檢測(cè)線(xiàn)和所述的質(zhì)控線(xiàn)的寬度分別為〇. 8-lmm，兩條線(xiàn)相距為5mm。
[0027] 所述的LB液體培養(yǎng)基的配方如下：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，補(bǔ) 足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌；
[0028] 所述的LB固體培養(yǎng)基的配方如下：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl IOgJlC 脂15g，補(bǔ)足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌；
[0029] 所述的 PBST 緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 ? 12H20 2. 9g、 KH2PO4O. 2g，500 ii L吐溫-20,補(bǔ)足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌；
[0030] 所述的 PBS 緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0? 2g、Na2HPO4 ? 12H20 2. 9g、 KH2PO4O. 2g，補(bǔ)足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 2,高壓滅菌；
[0031] 所述的乙酸-乙酸鈉緩沖液配方如下：乙酸鈉2. 604g、冰乙酸I. 095g，補(bǔ)足雙蒸水 至1L，調(diào)pH至5. 0,高壓滅菌。
[0032] 所述的惡臭假單胞菌超聲波破碎液的包被量為1-2 ii L/cm ;所述的兔抗雞卵黃抗 體的包被量為1-2 U L/cm，所述的惡臭假單胞菌超聲波破碎液是將所述的惡臭假單胞菌抗 原用PBS重懸，經(jīng)超聲波破碎后4000rpm離心5min所得的上清液。
[0033] 本發(fā)明選用惡臭假單胞菌超聲波破碎液作為檢測(cè)線(xiàn)，抗惡臭假單胞菌特異性卵黃 抗體作為膠體金標(biāo)記的抗體，利用競(jìng)爭(zhēng)法來(lái)檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有惡臭假單胞菌。通過(guò) 待檢樣品中的惡臭假單胞菌與包被于硝酸纖維膜上的惡臭假單胞菌抗原共同競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗 惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物。若待檢樣品中惡臭假單胞菌的量高于試紙條的檢 測(cè)限，抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物與樣品中惡臭假單胞菌全部結(jié)合，從而不 與固定在硝酸纖維膜上的菌液結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶而顯陽(yáng)性；若待檢樣品中不含惡臭假 單胞菌或其量低于試紙條的檢測(cè)限，抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物不能與樣品 中惡臭假單胞菌全部結(jié)合，這樣金標(biāo)抗體在層析過(guò)程中會(huì)被固定在硝酸纖維素膜上的菌液 結(jié)合而出現(xiàn)紅色條帶而顯陰性。因此，若待測(cè)樣品試紙條的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)同時(shí)出現(xiàn)紅色 條帶，則判斷為陰性樣品；若待測(cè)樣品試紙條檢測(cè)線(xiàn)不出現(xiàn)紅色條帶，同時(shí)質(zhì)控線(xiàn)上出現(xiàn)紅 色條帶則判斷為陽(yáng)性樣品；若質(zhì)控線(xiàn)上沒(méi)有紅色條帶出現(xiàn)，則該試紙條無(wú)效。
[0034] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
[0035] 1、檢測(cè)快速：整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需3-5分鐘，能夠滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。
[0036] 2、檢測(cè)準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)：本反應(yīng)與其他細(xì)菌沒(méi)有交叉反應(yīng)，檢測(cè)準(zhǔn)確性能達(dá)到 95%以上，與操作復(fù)雜的ELISA水平基本相同。
[0037] 3、攜帶方便，操作簡(jiǎn)便：本發(fā)明改變了對(duì)惡臭假單胞菌的檢測(cè)必須由專(zhuān)業(yè)人員才 能進(jìn)行檢測(cè)的局限性，使各個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)及醫(yī)院均可即時(shí)、即地進(jìn)行檢測(cè)。
[0038] 4、本發(fā)明的檢測(cè)試紙條制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，不需要任何特殊儀器、設(shè)備。
[0039] 5、本發(fā)明的檢測(cè)試紙條儲(chǔ)存方便，對(duì)溫度要求不高，在4°C可有效保存半年以上。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1為本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中1為樣品墊，2為結(jié)合墊，3為硝酸纖維素 膜，4為吸收墊，5為檢測(cè)線(xiàn)，6為質(zhì)控線(xiàn)，7為PVC底板；
[0041] 圖2為本發(fā)明試紙條的制備工藝流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0042] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0043] 具體實(shí)施例1
[0044] 一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條，如圖1所示，該試紙條由PVC底板7和在PVC底板 7上依次搭接的樣品墊1、結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3及吸水墊4 ;結(jié)合墊2上包被有抗惡臭 假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物，硝酸纖維素膜3上分別設(shè)置有由惡臭假單胞菌抗原超 聲波菌液包被的檢測(cè)線(xiàn)5和由兔抗雞卵黃抗體（IgY)包被的質(zhì)控線(xiàn)6。
[0045] 上述抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物的制備方法如下：將抗惡臭假單胞 菌卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為25-50nm的膠體金溶液按6-8 ii g : ImL混合，在pH 5. 4的 條件下通過(guò)攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含IOwt %的牛血清白蛋白的PBST緩沖液作 為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚 物，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的抗惡臭假單胞菌卵黃抗體，取離心 管底部暗紅色沉淀即得到抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物。
[0046] 具體實(shí)施例2
[0047] 快速檢測(cè)惡臭假單胞菌膠體金試紙條的制備方法，如圖2所示，其具體操作步驟 如下：
[0048] (1)惡臭假單胞菌的制備
[0049] 惡臭假單胞菌抗原的制備方法如下：取實(shí)驗(yàn)室_80°C保存的惡臭假單胞菌種，在 LB固體培養(yǎng)基中劃線(xiàn)活化，28°C倒置培養(yǎng)24h后挑取單菌落接種于含5mL LB液體培養(yǎng)基 的試管中，28°C，200rpm培養(yǎng)12-18h，將培養(yǎng)的菌液用LB液體培養(yǎng)基按1 : 100稀釋到三 角燒瓶中，28°C，200rpm擴(kuò)大培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間測(cè)其0D600值，當(dāng)其0D600值達(dá)到0. 4-0. 6 時(shí)停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌液在4°C進(jìn)行5000rpm離心lOmin，棄上清，下層沉淀用pH 7. 2的 0. OlM PBS重懸洗滌，5000rpm離心lOmin，沉淀再次用PBS重復(fù)上述洗滌2次，最終得到的 沉淀即為惡臭假單胞菌抗原。
[0050] (2)抗惡臭假單胞菌卵黃抗體的制備
[0051] 將上述惡臭假單胞菌抗原與無(wú)菌生理鹽水混合得到惡臭假單胞菌懸液，加入甲醛 使甲醛體積終濃度達(dá)0. 5%，然后37°C恒溫水浴滅活24h，即得到滅活的惡臭假單胞菌抗 原；取健康的初產(chǎn)蛋的母雞作為免疫對(duì)象，將滅活的惡臭假單胞菌抗原用生理鹽水稀釋后 和弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后對(duì)母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉注射進(jìn) 行基礎(chǔ)免疫，每只母雞免疫劑量為4X IO9CFU, 15-20天后，將滅活的惡臭假單胞菌抗原和弗 氏不完全佐劑進(jìn)行等體積混合，充分乳化后對(duì)母雞肌肉注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只母雞免疫 劑量為2X IO9CFU,加強(qiáng)免疫重復(fù)進(jìn)行三次，每次間隔時(shí)間為7-10天，進(jìn)行三次免疫后收集 雞蛋測(cè)定效價(jià)，當(dāng)卵黃抗體效價(jià)> 1 : 20000時(shí)收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸銨沉淀法 純化卵黃抗體。卵黃抗體的純化的具體方法如下：稱(chēng)取適量卵黃，按質(zhì)量比1 : 9加入pH 5. O的0. 05M乙酸-乙酸鈉緩沖液，攪拌均勻后4°C靜置過(guò)夜，8000g離心20min，取上清液 加入飽和硫酸銨至飽和度為40%，4°C攪拌6h，IOOOOg離心20min，沉淀用10-20倍卵黃質(zhì) 量的雙蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40%，4°C攪拌過(guò)夜，IOOOOg離心20min，取 沉淀用少量pH 7.2的0. OlM PBS溶液重懸，在PBS溶液中透析即得到抗惡臭假單胞菌卵黃 抗體。
[0052] (3)膠體金標(biāo)記抗惡臭假單胞菌卵黃抗體的方法
[0053] 用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金。用新制的去離子水配制IOOmL O.Olwt% 的氯金酸溶液，加熱煮沸后，邊攪拌邊加入l_2mL lwt%檸檬酸三鈉溶液后迅速搖勻，繼 續(xù)加熱，溶液由淡黃色變黑變紅色，至顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5-10min，冷卻后補(bǔ)足失水至 IOOmL,無(wú)菌密封，4°C避光保存；
[0054] 將抗惡臭假單胞菌卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為25-50nm的膠體金溶液按 6-8 iig: ImL混合，在pH 5. 4的條件下通過(guò)攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含IOwt %的牛 血清蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分 穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的卵黃抗 體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物，用含Iwt % 牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、Iwt%海藻糖、0.02wt%疊氮化鈉的pH 7.2的0? OIM PBS重懸 至所述膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃度。
[0055] (4)結(jié)合墊的包被
[0056] 將玻璃纖維紙浸泡于含Iwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、Iwt%海藻糖，Iwt%吐 溫-20的pH 7. 2的0. OlM PBS緩沖液中30min后，37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻 璃纖維紙上均勻噴涂10-20 y L抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物，真空冷凍干燥 l-2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0057] (5)樣品墊的處理
[0058] 將玻璃纖維紙浸泡于含Iwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、Iwt%海藻糖、Iwt%吐 溫-20的pH 7. 2的0. OlM PBS緩沖液中30min后取出，37°C干燥2-3h即得到樣品墊，真空 封裝，4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0059] (6)硝酸纖維膜的包被
[0060] 將惡臭假單胞菌超聲波破碎液用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成檢測(cè)線(xiàn)，包 被量為1-2U L/cm ;將兔抗雞卵黃抗體用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成質(zhì)控線(xiàn)，包 被量為1-2 U L/cm，即得到特定包被的硝酸纖維素膜，真空冷凍干燥1-1. 5h，真空封裝，4°C 保存?zhèn)溆茫黄渲袡z測(cè)線(xiàn)與質(zhì)控線(xiàn)相互平行，所述的檢測(cè)線(xiàn)靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控線(xiàn)靠近 吸水墊端；惡臭假單胞菌超聲波破碎液是將所述的惡臭假單胞菌抗原用PBS重懸，經(jīng)超聲 波破碎后4000rpm離心5min所得的上清液。
[0061] (7)試紙條組裝
[0062] 將樣品墊（1)、結(jié)合墊（2)、硝酸纖維膜（3)、吸水墊⑷按圖2所示的順序依次粘 附在PVC底板（7)上，PVC底板作為支撐載體，由下及上是由玻璃纖維紙組成的樣品吸收 區(qū)，然后是吸附了膠體金所標(biāo)記的卵黃抗體的玻璃纖維層，其次是硝酸纖維素膜，最上一層 是吸水層，由濾紙組成，外面用膠帶封住，成為手持部分。各層之間均有I. 5_左右的重疊 交叉。將試紙條切成4-6_寬的小條，真空封裝，4°C保存。
[0063] 其中步驟⑴中采用的LB液體培養(yǎng)基的配方如下：胰化蛋白胨10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g，補(bǔ)足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌；LB固體培養(yǎng)基的配方如下：胰化 蛋白胨1(^、酵母提取物5§、似(：11(^、瓊脂15 §，補(bǔ)足雙蒸水至11，調(diào)節(jié)？11至7.4，高壓滅 菌。
[0064] 步驟（2)中的采用的乙酸-乙酸鈉緩沖液配方如下：乙酸鈉2. 604g、冰乙酸 I. 095g，補(bǔ)足雙蒸水至1L，調(diào)pH至5. 0,高壓滅菌。
[0065] 步驟（3)中采用的PBST緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0. 2g、 Na2HPO4 ? 12H202. 9g、KH2P040. 2g，500 ii L 吐溫-20,補(bǔ)足雙蒸水至 1L，調(diào)節(jié) pH 至 7. 4,高壓滅 菌。
[0066] 步驟（1) (2) (3) (4)、（5)中采用 PBS 緩沖液配制方法是：NaCl 8g、KCl 0. 2g、 Na2HPO4 ? 12H20 2. 9g、KH2PO4O. 2g補(bǔ)足雙蒸水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 2,高壓滅菌。
[0067] 具體實(shí)施例3
[0068] 膠體金試紙條對(duì)臨床樣品的檢測(cè)，具體步驟如下：
[0069] 從當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買(mǎi)鰻魚(yú)、梭子蟹、鯽魚(yú)、蝦等各種魚(yú)類(lèi)樣品以及本地各池塘水 樣，解剖取其腸，鰓和肝等樣品共41份，將PBS緩沖液滴加于組織樣品上，破碎組織， 2000-3000rpm離心5min后取上清液，將檢測(cè)試紙條插入待檢樣品中，10分鐘后觀察結(jié)果： 若只在檢測(cè)試紙條的質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅線(xiàn)者為陽(yáng)性結(jié)果，即樣品中帶有惡臭假單胞菌；若 試紙條的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)同時(shí)出現(xiàn)紅線(xiàn)者為陰性結(jié)果，即樣品中不含有惡臭假單胞菌。每 個(gè)樣品做5次重復(fù)，所有臨床樣品檢測(cè)結(jié)果用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)進(jìn)行比較。
[0070] 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，我們可以看到在收集的41份樣品中，只有1份鰻魚(yú)樣品在試紙條 檢測(cè)結(jié)果中呈陽(yáng)性，對(duì)于其余各種魚(yú)類(lèi)樣品均為陰性結(jié)果。所有檢測(cè)樣品均與ELISA結(jié)果 相同，說(shuō)明兩者具有高度一致性，膠體金試紙條的準(zhǔn)確率高達(dá)100%。由此可見(jiàn)，這種研發(fā)的 惡臭假單胞菌膠體金試紙條是可行的，我們可以通過(guò)膠體金試紙條對(duì)各養(yǎng)殖場(chǎng)中的發(fā)病魚(yú) 類(lèi)進(jìn)行檢測(cè)確定病因，從而對(duì)癥下藥，及時(shí)防治，防止病情擴(kuò)大，減少養(yǎng)殖戶(hù)損失，也可以作 為在苗種引進(jìn)時(shí)的一種初步篩選工具，這種膠體金試紙條方便實(shí)用，非常適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。同 時(shí)，由于惡臭假單胞菌是一種"人-畜-漁"共患病，因此，這種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條也 可以廣泛應(yīng)用于各大醫(yī)院進(jìn)行急診。
[0071] 表1惡臭假單胞菌試紙條檢測(cè)臨床樣品結(jié)果
[0072]

【權(quán)利要求】
1. 一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條，其特征在于：所述的試紙條由PVC底板和在PVC底 板上依次搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水墊；所述的結(jié)合墊上包被有抗惡臭假 單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物，所述的硝酸纖維素膜上分別設(shè)置有由惡臭假單胞菌超聲 波破碎液包被的檢測(cè)線(xiàn)和由兔抗雞卵黃抗體（IgY)包被的質(zhì)控線(xiàn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條，其特征在于所述的抗惡臭 假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物的制備方法如下：將抗惡臭假單胞菌卵黃抗體與膠體 金顆粒直徑為25-50nm的膠體金溶液按6-8 y g :lmL混合后，在pH 5. 4的條件下通過(guò)攪 拌振蕩30-60min，加含10wt%的牛血清白蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心 2000-3500rpm，10-20min，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h，取離心管底部暗紅色沉淀 即得到抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物。
3. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于包括 以下步驟： (1) 樣品墊的制備 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖、lwt%吐 溫-20的pH 7. 2的0. 01M PBS緩沖液中30min后取出，于37°C干燥2-3h即得到樣品墊，真 空封裝，4 °C保存?zhèn)溆茫? (2) 特定包被的結(jié)合墊的制備 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖，lwt%吐 溫-20的pH7. 2的0. 01M PBS緩沖液中30min后，于37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻 璃纖維紙上均勻噴涂10-20 y L的抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物，真空冷凍干燥 l-2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫? (3) 特定包被的硝酸纖維素膜的制備 將惡臭假單胞菌超聲波破碎液用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)線(xiàn)，將兔 抗雞卵黃抗體用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線(xiàn)，即得到特定包被的硝酸纖 維素膜，真空冷凍干燥1-1. 5h，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫黄渲袡z測(cè)線(xiàn)與質(zhì)控線(xiàn)相互平行，所 述的檢測(cè)線(xiàn)靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控線(xiàn)靠近吸水墊端； (4) 試紙條的制備 將步驟（1)得到的樣品墊、步驟（2)得到的特定包被的結(jié)合墊、步驟（3)得到的特定包 被的硝酸纖維素膜和吸水墊按序搭接并粘貼于底板上，裁成4-6_寬的細(xì)條，即得惡臭假 單胞菌檢測(cè)試紙條，真空封裝，4 °C保存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于所述 的惡臭假單胞菌抗原的制備方法如下：取實(shí)驗(yàn)室_80°C保存的惡臭假單胞菌種，在LB固體 培養(yǎng)基中劃線(xiàn)活化，28°C倒置培養(yǎng)24h后挑取單菌落接種于含5mL LB液體培養(yǎng)基的試管 中，28°C，200rpm培養(yǎng)12-18h，將培養(yǎng)的菌液用LB液體培養(yǎng)基按1 : 100稀釋到三角燒瓶 中，28°C，200rpm擴(kuò)大培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間測(cè)其0D600值，當(dāng)其0D600值達(dá)到0. 4-0. 6時(shí)停止 培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌液在4°C進(jìn)行5000rpm離心lOmin，棄上清，下層沉淀用pH 7. 2的0. 01M PBS重懸洗滌，再次5000rpm離心lOmin，沉淀再次用PBS重復(fù)上述洗滌2次，最終得到的沉 淀即為惡臭假單胞菌抗原。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于所述 的抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物的制備方法如下： (1) 抗惡臭假單胞菌卵黃抗體的制備 將上述惡臭假單胞菌抗原與無(wú)菌生理鹽水混合得到惡臭假單胞菌懸液，加入甲醛使甲 醛體積終濃度達(dá)0. 5%，然后37°C恒溫水浴滅活24h，即得到滅活的惡臭假單胞菌抗原；取 健康的初產(chǎn)蛋的母雞作為免疫對(duì)象，將滅活?lèi)撼艏賳伟乖蒙睇}水稀釋后和弗氏完 全佐劑等體積混合，充分乳化后對(duì)母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉注射進(jìn)行基礎(chǔ)免 疫，每只母雞免疫劑量為4X 109CFU，15-20天后，將滅活的惡臭假單胞菌抗原和弗氏不完 全佐劑進(jìn)行等體積混合，充分乳化后對(duì)母雞肌肉注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只母雞免疫劑量為 2X 109CFU，加強(qiáng)免疫重復(fù)進(jìn)行三次，每次間隔時(shí)間為7-10天，然后收集雞蛋測(cè)定效價(jià)，當(dāng)卵 黃抗體效價(jià)> 1 : 20000時(shí)收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體； (2) 膠體金標(biāo)記抗惡臭假單胞菌卵黃抗體 將抗惡臭假單胞菌卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為25-50nm的膠體金溶液按6-8 y g :lmL混合，在pH 5. 4的條件下通過(guò)攪拌振蕩30-60min，加含10wt%的牛血清白蛋白的PBST 緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min，再高速離心12000-15000rpm， 1-1. 5h，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物，用含 lwt %牛血清白蛋白、2. 5wt %鹿糖、lwt %海藻糖，0? 02wt %疊氮化鈉的pH 7. 2的0? 01M PBS緩沖液重懸至所述膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃度。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于用飽 和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體的具體方法如下：稱(chēng)取適量步驟（1)分離得到的卵黃，按體 積比1 : 9加入pH 5. 0的0. 05M的乙酸-乙酸鈉緩沖液，攪拌均勻后4°C靜置過(guò)夜，8000g 離心20min，取上清液加入飽和硫酸銨至飽和度為40%，4°C攪拌6h，10000g離心20min，沉 淀用10-20倍卵黃質(zhì)量的雙蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40%，4°C攪拌過(guò)夜， 10000g離心20min，沉淀用少量pH7. 2的0. 01M的PBS緩沖液重懸后，在PBS緩沖液中透析 即得到抗惡臭假單胞菌卵黃抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于步驟 (2)中膠體金制備方法如下：將100mL 0. Olwt%的氯金酸溶液，加熱煮沸后，邊攪拌邊加入 l-2mL lwt%檸檬酸三鈉迅速搖勻，繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色變黑變紅色，至顏色穩(wěn)定后繼 續(xù)加熱5-10min，冷卻后補(bǔ)足失水至100mL，無(wú)菌密封，4°C避光保存。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于：所 述的檢測(cè)線(xiàn)距離所述的結(jié)合墊6-8mm ;所述的質(zhì)控線(xiàn)距離所述的吸水墊6-8mm，所述的檢測(cè) 線(xiàn)和所述的質(zhì)控線(xiàn)的寬度分別為〇. 8-1_，兩條線(xiàn)相距為5_。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種惡臭假單胞菌檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于：所 述的惡臭假單胞菌超聲波破碎液的包被量為1-2 U L/cm ;所述的兔抗雞卵黃抗體的包被量 為1-2 y L/cm，所述的惡臭假單胞菌超聲波破碎液是將所述的惡臭假單胞菌抗原用PBS重 懸，經(jīng)超聲波破碎后4000rpm離心5min所得的上清液。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104374914SQ201410657289
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】章禮平, 李登峰, 方靜, 劉聯(lián)國(guó), 劉飛, 陳梅娟 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)