一種多模式非線性光學(xué)顯微成像方法及裝置制造方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種多模式非線性光學(xué)顯微成像方法及裝置，該裝置主要由激光器系統(tǒng)、光學(xué)掃描顯微鏡、非線性光學(xué)信號(hào)探測(cè)與獲取系統(tǒng)等構(gòu)成，能夠分別在單激光束和雙激光束兩種模式下工作，可以在離體的生物組織和活細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)熒光（TPEF）成像、多光子高次諧波（如二次諧波SHG，三次諧波THG等）散射成像以及相干拉曼散射（如反斯托克斯CARS）顯微成像等多種模式的非線性光學(xué)顯微成像，從而可以原位獲得生物組織樣本的各種非線性特異性光學(xué)信號(hào)，為對(duì)樣本的光學(xué)診斷與深入分析提供了重要的基礎(chǔ)。此外，本發(fā)明的反射測(cè)量方式還可以直接應(yīng)用于活體小動(dòng)物的以上各種非線性光學(xué)信號(hào)的獲取與顯微成像。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種多模式非線性光學(xué)顯微成像方法及裝置

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多模式非線性光學(xué)顯微成像方法及裝置。

【背景技術(shù)】
[0002]顯微鏡的出現(xiàn)改變了人們認(rèn)識(shí)世界的方法和觀點(diǎn)，是人類(lèi)科學(xué)發(fā)展史的重要發(fā)明之一。光學(xué)顯微鏡由于其具有無(wú)損傷、非侵入性等優(yōu)點(diǎn)，已發(fā)展成當(dāng)前自然科學(xué)特別是生命科學(xué)研究的一種重要工具。特別地，十九世紀(jì)未期新出現(xiàn)的激光共焦掃描顯微成像和各種非線性光學(xué)顯微成像技術(shù)如雙光子激發(fā)熒光成像、二次諧波散射成像和相干拉曼成像等，由于它們具有較高的空間分辨能力和厚組織的三維光學(xué)層析能力，使得光學(xué)顯微成像技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及其相關(guān)交叉學(xué)科等的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用研究中獲得了廣泛的應(yīng)用。然而，由于各種非線性光學(xué)成像技術(shù)自從其開(kāi)始在實(shí)驗(yàn)室被應(yīng)用于研究以來(lái)，都只有10來(lái)年發(fā)展歷史，尚處于自身發(fā)展過(guò)程。至今為止，尚未見(jiàn)過(guò)將具有共性技術(shù)的若干種非線性光學(xué)顯微成像技術(shù)耦合在一個(gè)平臺(tái)或系統(tǒng)中，即在同一個(gè)平臺(tái)或系統(tǒng)上，對(duì)靶目標(biāo)實(shí)現(xiàn)多模式的非線性光學(xué)顯微成像，從而實(shí)現(xiàn)靶目標(biāo)上多種特異性信息的原位表征與獲取。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種多模式非線性光學(xué)顯微成像方法及裝置。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案一是:一種多模式非線性光學(xué)顯微成像裝置，包括激光器系統(tǒng)，所述激光器系統(tǒng)的輸出方向沿第一光路依次設(shè)置有第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元和時(shí)間延遲單元，所述激光器系統(tǒng)的輸出方向沿第二光路設(shè)置有第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元，所述時(shí)間延遲單元和第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元的輸出方向共同依次設(shè)置有第一二向色鏡、激光束掃描單元、物鏡以及用于放置待測(cè)樣品的載物臺(tái)。
[0005]進(jìn)一步的，所述第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元包含沿第一光路依次設(shè)置的第一半波片和第一偏振分光片，所述第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元包含沿第二光路依次設(shè)置的第二半波片和第二偏振分光片。
[0006]進(jìn)一步的，所述第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元的輸出端與時(shí)間延遲單元的輸入端之間設(shè)置有第一反射鏡。
[0007]進(jìn)一步的，所述激光器系統(tǒng)的輸出端與第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元的輸入端之間設(shè)置有光開(kāi)關(guān)。
[0008]進(jìn)一步的，所述激光束掃描單元的輸出端與物鏡的輸入端之間沿出光方向依次設(shè)置有第二反射鏡和第二二向色鏡，所述第二二向色鏡的輸出端沿其反射方向依次設(shè)置有第一會(huì)聚透鏡、第一光學(xué)濾光片以及第一光電探測(cè)器。
[0009]進(jìn)一步的，所述載物臺(tái)下方從上往下依次設(shè)置有第二會(huì)聚透鏡、第二光學(xué)濾光片以及第二光電探測(cè)器。
[0010]進(jìn)一步的，所述第一光電探測(cè)器和第二光電探測(cè)器分別電性連接至數(shù)據(jù)處理中心。
[0011]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案二是:一種多模式非線性光學(xué)顯微成像方法，采用上述的多模式非線性光學(xué)顯微成像裝置，將待測(cè)樣品放置于載物臺(tái)上，包括以下工作模式:
(1)單光束激光工作模式:從激光器系統(tǒng)僅出射一束的超短脈沖激發(fā)光束，激發(fā)光束先經(jīng)過(guò)第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元，接著經(jīng)過(guò)時(shí)間延遲單元，再經(jīng)過(guò)第一二向色鏡耦合后進(jìn)入激光束掃描單元，最后經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚作用在待測(cè)樣品上，超短脈沖激發(fā)光與待測(cè)樣品相互作用時(shí)，產(chǎn)生相應(yīng)的非線性光學(xué)效應(yīng)；
(2)雙光束激光工作模式:從激光器系統(tǒng)出射兩束超短脈沖激光，分別為泵浦光和探測(cè)光；探測(cè)光先經(jīng)過(guò)第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元，接著經(jīng)過(guò)時(shí)間延遲單元后形成探測(cè)光束；泵浦光先經(jīng)過(guò)第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元，并與探測(cè)光束在第一二向色鏡處實(shí)現(xiàn)時(shí)間和空間上的耦合與共線，耦合后的光束入射進(jìn)入激光束掃描單元，最后經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚作用在待測(cè)樣品上，兩束超短脈沖激光在它們的波長(zhǎng)差滿足待測(cè)樣品中相關(guān)分子化學(xué)鍵振動(dòng)光譜的拉曼位移時(shí)，獲得相應(yīng)的相干拉曼散射非線性光學(xué)效應(yīng)。
[0012]進(jìn)一步的，在單光束激光工作模式下，所述非線性光學(xué)效應(yīng)是多光子的TPEF、高階諧波或和頻效應(yīng)。
[0013]進(jìn)一步的，在雙光束激光工作模式下，所述相干拉曼散射非線性光學(xué)效應(yīng)是反斯托克斯拉曼散射CARS非線性光學(xué)效應(yīng)。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):該裝置主要由激光器系統(tǒng)、光學(xué)掃描顯微鏡、非線性光學(xué)信號(hào)探測(cè)與獲取系統(tǒng)等構(gòu)成，能夠分別在單激光束和雙激光束兩種模式下工作，可以在離體的生物組織和活細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)熒光(TPEF)成像、多光子高次諧波(如二次諧波SHG，三次諧波THG等)散射成像以及相干拉曼散射(反斯托克斯CARS)顯微成像等多種模式的非線性光學(xué)顯微成像，從而可以原位獲得生物組織樣本的各種非線性特異性光學(xué)信號(hào)，為對(duì)樣本的光學(xué)診斷與深入分析提供了重要的基礎(chǔ)。此外，本發(fā)明的反射測(cè)量方式還可以直接應(yīng)用于活體小動(dòng)物的以上各種非線性光學(xué)信號(hào)的獲取與顯微成像。
[0015]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的闡述。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)構(gòu)原理圖。
[0017]圖中:1-激光器系統(tǒng)，2-第一半波片，3-第一偏振分光片，4-第一反射鏡，5-時(shí)間延遲單元，6-光開(kāi)關(guān)，7-第二半波片，8-第二偏振分光片，9-第一二向色鏡，10-激光束掃描單兀，11-第二反射鏡，12-第一光電探測(cè)器，13-第一光學(xué)濾光片，14-第一會(huì)聚透鏡，15-第二二向色鏡，16-物鏡，17-待測(cè)樣品，18-數(shù)據(jù)處理中心，19-載物臺(tái)，20-第二會(huì)聚透鏡,21-第二光學(xué)濾光片，22-第二光電探測(cè)器。

【具體實(shí)施方式】
[0018]如圖1所示，一種多模式非線性光學(xué)顯微成像裝置，包括激光器系統(tǒng)1，所述激光器系統(tǒng)I的輸出方向沿第一光路依次設(shè)置有第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元和時(shí)間延遲單元5，所述激光器系統(tǒng)I的輸出方向沿第二光路設(shè)置有第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元，所述時(shí)間延遲單元5和第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元的輸出方向共同依次設(shè)置有第一二向色鏡9、激光束掃描單元10、物鏡16以及用于放置待測(cè)樣品17的載物臺(tái)19。
[0019]在本實(shí)施例中，所述第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元包含沿第一光路依次設(shè)置的第一半波片2和第一偏振分光片3，所述第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元包含沿第二光路依次設(shè)置的第二半波片7和第二偏振分光片8。所述第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元的輸出端與時(shí)間延遲單兀5的輸入端之間設(shè)置有第一反射鏡4。所述激光器系統(tǒng)I的輸出端與第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元的輸入端之間設(shè)置有光開(kāi)關(guān)6。
[0020]在本實(shí)施例中，所述激光束掃描單元10的輸出端與物鏡16的輸入端之間沿出光方向依次設(shè)置有第二反射鏡11和第二二向色鏡15，所述第二二向色鏡15的輸出端沿其反射方向依次設(shè)置有第一會(huì)聚透鏡14、第一光學(xué)濾光片13以及第一光電探測(cè)器12。所述載物臺(tái)19下方從上往下依次設(shè)置有第二會(huì)聚透鏡20、第二光學(xué)濾光片21以及第二光電探測(cè)器22。所述第一光電探測(cè)器12和第二光電探測(cè)器22分別電性連接至數(shù)據(jù)處理中心18，即計(jì)算機(jī)。
[0021]如圖1所示，一種多模式非線性光學(xué)顯微成像方法，采用上述的多模式非線性光學(xué)顯微成像裝置，將待測(cè)樣品17放置于載物臺(tái)19上，包括以下工作模式:
(O單光束激光工作模式:從激光器系統(tǒng)I僅出射一束的超短脈沖(fs)激發(fā)光束，激發(fā)光束先經(jīng)過(guò)第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元，接著經(jīng)過(guò)時(shí)間延遲單元5，再經(jīng)過(guò)第一二向色鏡9耦合后進(jìn)入激光束掃描單元10，最后經(jīng)過(guò)物鏡16會(huì)聚作用在待測(cè)樣品17上，超短脈沖激發(fā)光與待測(cè)樣品17相互作用時(shí)，產(chǎn)生相應(yīng)的非線性光學(xué)效應(yīng)；
(2)雙光束激光工作模式:從激光器系統(tǒng)I出射兩束超短脈沖激光，分別為泵浦光和探測(cè)光；探測(cè)光先經(jīng)過(guò)第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元，接著經(jīng)過(guò)時(shí)間延遲單元5后形成探測(cè)光束；泵浦光先經(jīng)過(guò)第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元，并與探測(cè)光束在第一二向色鏡9處實(shí)現(xiàn)時(shí)間和空間上的耦合與共線，耦合后的光束入射進(jìn)入激光束掃描單元10，最后經(jīng)過(guò)物鏡16會(huì)聚作用在待測(cè)樣品17上，兩束超短脈沖激光在它們的波長(zhǎng)差滿足待測(cè)樣品17中相關(guān)分子化學(xué)鍵振動(dòng)光譜的拉曼位移時(shí)，獲得相應(yīng)的相干拉曼散射非線性光學(xué)效應(yīng)。
[0022]在單光束激光工作模式下，該裝置可以實(shí)現(xiàn)常用的雙光子吸收激發(fā)熒光顯微成像TPEF和/或多光子散射顯微成像(包括二次諧波SHG、三次諧波THG等)的同步顯微成像。由于是fs激光，因此當(dāng)它與生物樣品相互作用時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的非線性光學(xué)效應(yīng)。在當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)條件情況下，主要的非線性光學(xué)效應(yīng)是多光子的TPEF、高階諧波或和頻效應(yīng)?？紤]到多光子高次諧波呈現(xiàn)較明顯的前向性散射特征，因此探測(cè)信號(hào)(即第一光電探測(cè)器12)放置在樣品的正前方(即上方)，即前向性探測(cè)方式，配合合適的窄帶濾光片(即第一光學(xué)濾光片13)便能夠獲得比較強(qiáng)的SHG或THG信號(hào)；而雙光子吸收激發(fā)產(chǎn)生的熒光信號(hào)TPEF，在空間各方向的信號(hào)是隨機(jī)的，即沒(méi)有明顯的方向性，且?guī)捿^大，需要配合寬帶濾波片進(jìn)行信號(hào)獲取。因此，為了測(cè)量方便與裝置簡(jiǎn)單，在同步獲取不同非線性光學(xué)信號(hào)時(shí)，可以同時(shí)采用前向方式獲取SHG或THG散射光信號(hào)，而采用后向方式測(cè)量TPEF熒光信號(hào)。此外，此測(cè)量方法與裝置不僅適用于生物組織的切片或活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)測(cè)量；對(duì)于活體小動(dòng)物，由于只能在小動(dòng)物的后向采集信號(hào)，即只能采用后向測(cè)量方式，但在增加第二二向色鏡15后，仍然可以同步獲取。
[0023]在雙光束激光工作模式下，該裝置可以實(shí)現(xiàn)反斯托克斯CARS相干拉曼散射顯微成像。由于是雙光束fs激光，因此當(dāng)它們的波長(zhǎng)差滿足生物樣品中相關(guān)分子化學(xué)鍵振動(dòng)光譜的拉曼位移時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的相干拉曼散射非線性光學(xué)效應(yīng)。在當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)條件情況下，兩束fs激光光束在它們的波長(zhǎng)差滿足生物樣品中相關(guān)分子化鍵振動(dòng)光譜的拉曼位移時(shí)，可以獲得相應(yīng)的相干反斯托克斯拉曼散射CARS非線性光學(xué)效應(yīng)。當(dāng)待測(cè)樣品17為組織切片或活細(xì)胞時(shí)，可以選擇在樣品的正前方探測(cè)信號(hào)，即前向性探測(cè)方式，配合合適的帶通濾光片便能夠獲得比較強(qiáng)CARS信號(hào)；當(dāng)待測(cè)樣品17為活體小動(dòng)物或厚的組織樣品時(shí)，可以采用后向測(cè)量方式，即在樣品的后方，測(cè)量經(jīng)樣品散射CARS信號(hào)。
[0024]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種多模式非線性光學(xué)顯微成像裝置，包括激光器系統(tǒng)，其特征在于:所述激光器系統(tǒng)的輸出方向沿第一光路依次設(shè)置有第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元和時(shí)間延遲單元，所述激光器系統(tǒng)的輸出方向沿第二光路設(shè)置有第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元，所述時(shí)間延遲單元和第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元的輸出方向共同依次設(shè)置有第一二向色鏡、激光束掃描單元、物鏡以及用于放置待測(cè)樣品的載物臺(tái)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多模式非線性光學(xué)顯微成像裝置，其特征在于:所述第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元包含沿第一光路依次設(shè)置的第一半波片和第一偏振分光片，所述第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元包含沿第二光路依次設(shè)置的第二半波片和第二偏振分光片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多模式非線性光學(xué)顯微成像裝置，其特征在于:所述第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元的輸出端與時(shí)間延遲單元的輸入端之間設(shè)置有第一反射鏡。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多模式非線性光學(xué)顯微成像裝置，其特征在于:所述激光器系統(tǒng)的輸出端與第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元的輸入端之間設(shè)置有光開(kāi)關(guān)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多模式非線性光學(xué)顯微成像裝置，其特征在于:所述激光束掃描單元的輸出端與物鏡的輸入端之間沿出光方向依次設(shè)置有第二反射鏡和第二二向色鏡，所述第二二向色鏡的輸出端沿其反射方向依次設(shè)置有第一會(huì)聚透鏡、第一光學(xué)濾光片以及第一光電探測(cè)器。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多模式非線性光學(xué)顯微成像裝置，其特征在于:所述載物臺(tái)下方從上往下依次設(shè)置有第二會(huì)聚透鏡、第二光學(xué)濾光片以及第二光電探測(cè)器。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多模式非線性光學(xué)顯微成像裝置，其特征在于:所述第一光電探測(cè)器和第二光電探測(cè)器分別電性連接至數(shù)據(jù)處理中心。
8.—種多模式非線性光學(xué)顯微成像方法,其特征在于:米用權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的多模式非線性光學(xué)顯微成像裝置，將待測(cè)樣品放置于載物臺(tái)上，包括以下工作模式: (1)單光束激光工作模式:從激光器系統(tǒng)僅出射一束的超短脈沖激發(fā)光束，激發(fā)光束先經(jīng)過(guò)第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元，接著經(jīng)過(guò)時(shí)間延遲單元，再經(jīng)過(guò)第一二向色鏡耦合后進(jìn)入激光束掃描單元，最后經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚作用在待測(cè)樣品上，超短脈沖激發(fā)光與待測(cè)樣品相互作用時(shí)，產(chǎn)生相應(yīng)的非線性光學(xué)效應(yīng)； (2)雙光束激光工作模式:從激光器系統(tǒng)出射兩束超短脈沖激光，分別為泵浦光和探測(cè)光；探測(cè)光先經(jīng)過(guò)第一脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元，接著經(jīng)過(guò)時(shí)間延遲單元后形成探測(cè)光束；泵浦光先經(jīng)過(guò)第二脈沖激光功率調(diào)節(jié)單元，并與探測(cè)光束在第一二向色鏡處實(shí)現(xiàn)時(shí)間和空間上的耦合與共線，耦合后的光束入射進(jìn)入激光束掃描單元，最后經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚作用在待測(cè)樣品上，兩束超短脈沖激光在它們的波長(zhǎng)差滿足待測(cè)樣品中相關(guān)分子化學(xué)鍵振動(dòng)光譜的拉曼位移時(shí)，獲得相應(yīng)的相干拉曼散射非線性光學(xué)效應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多模式非線性光學(xué)顯微成像方法，其特征在于:在單光束激光工作模式下，所述非線性光學(xué)效應(yīng)是多光子的TPEF、高階諧波或和頻效應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多模式非線性光學(xué)顯微成像方法，其特征在于:在雙光束激光工作模式下，所述相干拉曼散射非線性光學(xué)效應(yīng)是反斯托克斯拉曼散射CARS非線性光學(xué)效應(yīng)。
【文檔編號(hào)】G01N21/65GK104330398SQ201410666246
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】楊洪欽, 邱彩敏, 陳建玲, 謝樹(shù)森, 王瑜華, 李暉 申請(qǐng)人:福建師范大學(xué)