一種高效的丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效的丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。它主要包括酶標板、抗HCV-cAg酶結合物、HCV-cAg標準品梯度溶液、陽性血清對照指示樣本、陰性血清對照指示樣本、HCV-cAg樣品稀釋液、底物液A、底物液B、終止液、20×濃縮洗滌液。本發(fā)明制得的試劑盒靈敏度高、精密度好、特異性強。
【專利說明】一種高效的丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒抗原檢測試劑盒，尤其涉及一種高效的丙型肝炎病毒核心抗原 (HCV-core Ag)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。

【背景技術】
[0002] 丙型病毒性肝炎，簡稱為丙型肝炎、丙肝，是一種由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV)感染引起的病毒性肝炎，丙型肝炎呈全球性流行，可導致肝臟慢性炎癥壞死和 纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌（HCC)。一些數據顯示，未來20年內與HCV 感染相關的死亡率(肝衰竭及肝細胞癌導致的死亡）將繼續(xù)增加，對患者的健康和生命危害 極大目前，慢性丙肝除了干擾素有確切的療效外，尚沒有其它有效的治療方法，而且疫苗的 研制在短期內難有突破性的進展，因此，早發(fā)現、早診斷、早治療對于丙肝患者有十分重要 的意義。
[0003] 丙型病毒性肝炎的診斷根據病程可分為急性和慢性丙型肝炎。根據臨床癥狀可分 為輕、中、重度丙型肝炎。肝硬化和肝癌是HCV感染的最嚴重后果。與其它病毒（HBV、HIV) 的重疊、合并感染統(tǒng)稱為混合感染。肝臟移植后HCV感染可以復發(fā)。丙型病毒性肝炎毒血癥 6個月以上為慢性感染，自然轉陰率低慢性率高75 %?80%。感染10?20年，至少20% 患者發(fā)展為肝硬化。10年生存率僅為25%?80%。肝癌發(fā)生率3年后為1 %?3%。 在生化學檢測中，丙氨酸氨基轉移酶(ALT )和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST )可反映 肝細胞損害程度，但ALT和AST與炎性分布和病情的嚴重程度不一定成正比。ALT下降表 示抗病毒治療有效，凝血酶原時間為作為慢性丙型肝炎患者病情進展的監(jiān)測指標。但是這 種方法只能作為判定丙肝的一項輔助性的依據，特異性不強，無法準確的檢測出肝炎。
[0004] HCV核心抗原的檢測是一種新型的檢測方法，研究始于上世紀九十年代中期，應用 最廣泛的是酶免疫方法。美國Ortho公司首先推出了雙抗體夾心法定性和定量檢測血清樣 品中總的或游離的HCV核心抗原ELISA試劑盒，于2004年已經在歐洲上市。近年來在我國 陸續(xù)出現，但是HCV核心抗原的酶聯(lián)免疫法靈敏度不高，因此其推廣使用也受到局限。所 以發(fā)明一種既操作簡便又靈敏度高的試劑盒具有非常重要的臨床意義。


【發(fā)明內容】

[0005] 針對現有的丙型肝炎抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒靈敏度不高，特異性不夠強等問題 的，本發(fā)明提供了一種高效的丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0006] 本發(fā)明采用以下技術方案： 一種高效的丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，它主要包括酶標板、抗 HCV-cAg酶結合物、HCV-cAg標準品梯度溶液、陽性血清對照指示樣本、陰性血清對照指示 樣本、HCV-cAg樣品稀釋液、底物液A、底物液B、終止液、20X濃縮洗滌液，其特征在于：所述 HCV-cAg樣品稀釋液的配方及制法是： 將羊血清100ml、氯化鈉10g、硫柳萊10g、亞鐵氰化鉀42. 24g、聚氧乙烯月桂醚10g、 慶大霉素 IOg加入到0. IM pH=7. 4的TriS-HCl緩沖液中至1L，物質充分溶解后過濾除菌， 2-8 °C保存。
[0007] 0? IM pH 7. 4的TriS-HCL的緩沖液的配置方法為：使將12. IlgTris溶于IL去離 子水中，使用鹽酸將溶液的PH值調整到7. 4即得。
[0008] 所述20X濃縮洗滌液的配方及制法是：將2. 96g NaH2PO4 ? 2H20、29g Na2HPO4? 12H20、IOg氯化鈉、IOg十二烷基硫酸三乙醇胺加入到去離子水中至1L，充分溶解后，過濾 除菌，2-8 °C保存。
[0009] 所述陰、陽性血清對照指示樣本均來源于人員基質血清，對所捐獻者的血清進行 滅活處理。
[0010] 所述底物液A是通過下述方法制備的：將12. IlgTrisUg鐵氰化鉀、5g焦磷酸鈉 和lmL30%雙氧水依次溶于IL蒸餾水中，混合均勻； 所述底物液B是通過下述方法制備的：將5 g TMB溶解到10 mL二甲基亞砜中，再將其 混合液加入蒸餾水中至1L，最后依次加入2. 96g NaH2PO4 *2H20和29g Na2HPO4 *12H20溶解 完成制備。
[0011] 所述酶標板為各孔包被有4 ii g/ml的包被抗體Mabl和Mab2的聚苯乙烯96圓孔 酶標板； 抗體在96孔酶標板上的包被方式：將提純好的Mabl和Mab2用pH5. 0酒石酸緩沖液分 別稀釋至4 ii g/mL和4 ii g/mL濃度，每孔加100 ii L于檢測板孔內，在2-8°C環(huán)境下放置12 小時，棄去包被液，用洗漆液清洗5-8次,然后輕輕用手拍干上面的液體。然后加入牛血清 白蛋白封閉液IOOu L/孔，2-8°C封閉10-12小時，隨后將封閉液棄去，室溫干燥3-5小時， 等到酶標板干燥后，使用真空封口包裝，并將封裝好的板存于2-8°C冰箱中，保存?zhèn)溆谩?br> [0012] 所述抗HCV-cAg酶結合物為辣根過氧化酶標記的羊抗人的Mab3和Mab4抗體； 所述的包被抗體Mabl、Mab2、Mab3、Mab4都是采用單克隆技術提取的高純度抗體。
[0013] 所述HCV-cAg標準品梯度溶液分為5個濃度，分別為40ng/m L、20ng/m L、10ng/m L、5ng/m L、80pg/mL〇
[0014] 所述終止液為2ml濃鹽酸和2ml濃硫酸。
[0015] 本發(fā)明的試劑盒的使用方法如下： (1) 平衡：樣品及檢測試劑盒內的試劑，于18_25°C平衡30分鐘； (2) 配液：將試劑盒中配套的20X濃縮洗滌液用去離子水稀釋20倍，量取300mL，制 成工作所需濃度洗滌液，為下面洗板做好準備； (3) 樣品預處理：預處理板上每孔按1: 2的比例加入樣本稀釋液和樣品，45-60°C振 蕩孵育60分鐘，待用； (4) 加樣：取96孔酶標板，預設置空白、陰性、陽性對照各3孔，空白對照每孔加入 100 樣品稀釋液，其余孔每孔中先加入50 iU樣品稀釋液，然后陰、陽性對照孔每孔加入 50 iU相應對照血清，剩余孔樣品檢測孔，將經上述預處理的各待測樣品按設定每孔中加入 50 ii 1，這樣每個孔中都有100 ii 1的液體，加樣完畢后用不干膠封片封蓋反應板，37°C振蕩 孵育60分鐘； (5) 洗板：倒去板孔中的液體，并用吸水紙吸干上面的液體；用工作濃度洗滌液洗板 5-6次，最后拍干； (6) 加抗HCV-cAg酶結合物：每孔中加入75IU抗HCV-cAg酶結合物，用不干膠封片封 蓋反應板，37 °C孵育30分鐘； (7) 洗板：同步驟（5); (8) 顯色：每孔中先后加入底物液A、底物液B各50 iil，避光顯色至少2分鐘； (9) 測定：顯色反應后，將酶標板置酶免疫上測出各孔的吸光度變化； (10) 以陰性對照吸光度變化（RLU)的平均值+2270為臨界值（CUTOFF);待檢樣品的 RLU值> 臨界值（CUTOFF)為陽性，待測樣品RLU值< 臨界值（CUTOFF)為陰性為判定標準進 行判定。
[0016] 與現有技術相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點： 1、 本發(fā)明在樣本稀釋液中選取了亞鐵氰化鉀替換原有的鐵氰化鉀，能夠保護體系中其 他成分，延緩被氧化的速度，提高了試劑的穩(wěn)定性； 2、 在整個反應體系中，本發(fā)明在樣本稀釋液體中加入了聚氧乙烯月桂醚，它能夠使體 系具有更好的溶解分散性、穩(wěn)定性，有利于提高檢測試劑盒的分析靈敏度； 3、 本發(fā)明在20X濃縮洗滌液中選取表面活性劑十二烷基硫酸三乙醇胺代替常用的曲 拉通-100和吐溫系列，使洗滌液具有更優(yōu)異的洗滌和發(fā)泡性，更好的除去酶標板上的干擾 性雜質，有利于增強試劑盒的特異性及分析靈敏度。

【具體實施方式】
[0017] 實施例1 試劑盒的組成及制備方法 一種丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒包括： 96孔抗HCV-cAg單克隆抗體包被板1塊、抗HCV-cAg酶結合物、標準品5瓶、陰、陽性對 照各一份、HCV-cAg樣品稀釋液、底物液A、底物液B、終止液、洗滌液（20X濃縮液）各1瓶， 說明書一份，不干膠紙片4張。
[0018] 1.包被抗HCV-cAg單克隆抗體Mabl和Mab2成為反應板，酶標板選乳白色不透明 聚苯乙烯96孔酶標板。
[0019] 抗體在96孔酶標板上的包被方式：將提純好的Mabl和Mab2用pH5. 0酒石酸緩沖 液分別稀釋至4 ii g/mL和4 ii g/mL濃度，每孔加100 ii L于檢測板孔內，在2-8°C環(huán)境下放 置12小時,棄去包被液,用洗漆液清洗5-8次,然后輕輕用手拍干上面的液體。然后加入牛 血清白蛋白封閉液100 U L/孔，2-8°C封閉10-12小時，隨后將封閉液棄去，室溫干燥3-5小 時，等到酶標板干燥后，使用真空封口包裝，并將封裝好的板存于2-8°C冰箱中，保存?zhèn)溆谩?br> [0020] 2.標準品的制備：將重組全長HCV核心抗原用蛋白穩(wěn)定劑稀釋成5個梯度濃度， 分別是：40ng/m L、20ng/m L、10ng/m L、5ng/m L、80pg/m L0
[0021] 3.抗HCV-cAg酶結合物是辣根過氧化酶標記的羊抗人的Mab3和Mab4抗體； 4、 HCV-cAg樣品稀釋液的配方及制法是： 將羊血清100ml、氯化鈉10g、硫柳萊10g、亞鐵氰化鉀42. 24g、聚氧乙烯月桂醚10g、 慶大霉素 l〇g加入到〇. IM pH=7. 4的Tris-HCl緩沖液中至1L，物質充分溶解后過濾除菌， 2-8 °C保存。
[0022] 0? IM pH 7. 4的Tris-HCL的緩沖液的配置方法為：使將12. IlgTris溶于IL去離 子水中，使用鹽酸將溶液的pH值調整到7. 4即得。
[0023] 5. 20 X 濃縮洗滌液的配方及制法是：將 2. 96g NaH2PO4 ? 2H20、29g Na2HPO4? 12H20、IOg氯化鈉、IOg十二烷基硫酸三乙醇胺加入到去離子水中至1L，充分溶解后，過濾 除菌，2-8 °C保存。
[0024] 6.反應底物液的制備方法如下： 底物液A :12. IlgTri、Ig鐵氰化鉀、5g焦磷酸鈉、lmL30%雙氧水，將上述各組分依次溶 于IL蒸饋水中制備完成。
[0025] 底物液 B :2. 96g NaH2PO4 *2H20、29g Na2HPO4 *12H20、5 g TMB、10 mL 二甲基亞砜， 先將TMB溶解到二甲基亞砜后，再將其混合液加入蒸餾水中至1L，最后其他組分依次加入 溶解完成制備。
[0026] 7.終止液為2ml濃鹽酸和2ml濃硫酸。
[0027] 實施例2 試劑盒的應用及檢測操作程序 (1) 平衡：樣品及檢測試劑盒內的試劑，于18_25°C平衡30分鐘； (2) 配液：將試劑盒中配套的濃縮洗滌液用去離子水稀釋20倍，量取300mL，制成工作 所需濃度洗滌液，為下面洗板做好準備； (3) 樣本稀釋液：預處理板上每孔按1: 2的比例加入樣本稀釋液和樣品，45-60°C振 蕩孵育60分鐘，待用； (4) 加樣：取96孔酶標板，預設置空白、陰性、陽性對照各3孔，空白對照每孔加入 100 樣品稀釋液，其余孔每孔中先加入50 iU樣品稀釋液，然后陰、陽性對照孔每孔加 入50 iU相應對照血清，剩余孔樣品檢測孔，將經上述預處理的各待測樣品按設定每孔中 加入50 ii 1，這樣每個孔中都有100 ii 1的液體，加樣完畢后用不干膠封片封蓋反應板， 37 °C振蕩孵育60分鐘； (5) 洗板：倒去板孔中的液體，并用吸水紙吸干上面的液體；用工作濃度洗滌液洗板 5-6次，最后拍干； (6) 加抗HCV-cAg酶結合物：每孔中加入75IU抗HCV-cAg酶結合物，用不干膠封片封 蓋反應板，37 °C孵育30分鐘； (7) 洗板：同步驟（5); (8) 顯色：每孔中先后加入顯色底物液A、顯色底物液B各50 yl，避光顯色至少2分 鐘； (9) 測定：顯色反應后，將酶標板置酶免疫上測出各孔的吸光度變化； (10) 以陰性對照吸光度變化（RLU)的平均值+2270為臨界值（CUTOFF);待檢樣品的 1?1^值>臨界值（CUTOFF)為陽性，待測樣品1?1^值<臨界值（CUTOFF)為陰性為判定標準進 行判定。
[0028] 實施例3 本試劑盒的精密度、特異性、靈敏度的檢測 1)精密度試驗：使用PCR和EIA確定的陰陽性血清各20分，用20份陰性血清檢定，無 一例陽性；用20份陽性血清檢定，無一例陰性，符合產品標準。
[0029] 2)特異性試驗：交叉反應驗證試驗結果表明，抗HAV、HBsAg、抗TP、抗TOX、HSV、 CMV、EBV、陽性樣本及原發(fā)性肝癌患者樣本不影響檢測結果。
[0030] 對27例RF陽性樣本，25例HAMA陽性樣本，18例ANA陽性樣本(上述樣本抗HCV 和HCV均為陰性)分別采用本發(fā)明進行HCV-cAg檢測，三類樣本假陽性數為RF假陽性為0、 HAMA假陽性為UANA假陽性為1，特異性分別為100%、96%、94. 44%。
[0031] 3)靈敏度試驗：不同組對以HCV抗原濃度梯度檢測不同量抗原時試劑反應靈敏 度。1組為ORTHO HCV抗原測定試劑產品測試結果；2組為本發(fā)明試劑盒測定結果；3組為 實驗對照組HCV-cAg檢測試劑盒，其組成中除HCV-cAg樣品稀釋液中以0. IM鐵氰化鉀替代 本發(fā)明中的〇. IM亞鐵氰化鉀并不含聚氧乙烯月桂醚，以及20X濃縮洗滌液的配方中以曲 拉通-100或吐溫系列代替十二烷基硫酸三乙醇胺外，其他同本發(fā)明中的組成。結果見下表 1〇

【權利要求】
1. 一種高效的丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，它主要包括酶標板、抗 HCV-cAg酶結合物、HCV-cAg標準品梯度溶液、陽性血清對照指示樣本、陰性血清對照指示 樣本、HCV-cAg樣品稀釋液、底物液A、底物液B、終止液、20X濃縮洗滌液，其特征在于：所述 HCV-cAg樣品稀釋液的配方及制法是： 將羊血清100ml、氯化鈉10g、硫柳萊10g、亞鐵氰化鉀42. 24g、聚氧乙烯月桂醚10g、 慶大霉素l〇g加入到〇. 1M pH=7. 4的Tris-HCl緩沖液中至1L，物質充分溶解后過濾除菌， 2-8 °C保存； 所述20X濃縮洗滌液的配方及制法是：將2. 96g NaH2P04，21120、298 Na2HP04 *121120、 l〇g氯化鈉、l〇g十二烷基硫酸三乙醇胺加入到去離子水中至1L，充分溶解后，過濾除菌， 2-8 °C保存。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于： 所述底物液A是通過下述方法制備的：將12. llgTris、lg鐵氰化鉀、5g焦磷酸鈉和 lmL30%雙氧水依次溶于1L蒸餾水中，使用HCL調整PH到7. 4,混合均勻； 所述底物液B是通過下述方法制備的：將5 g TMB溶解到10 mL二甲基亞砜中，再將其 混合液加入蒸餾水中至1L，最后依次加入2.96g NaH2P04 *2H20和29g Na2HP04*12H20溶解 完成制備。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述酶標板為各孔包被有4 y g/ml的 包被抗體Mabl和Mab2的聚苯乙烯96圓孔酶標板；所述抗HCV-cAg酶結合物為辣根過氧化 酶標記的羊抗人的Mab3和Mab4抗體。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述HCV-cAg標準品梯度溶液分為5個 濃度，分別為 40ng/m L、20ng/m L、10ng/m L、5ng/m L、80pg/mL。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述終止液為2ml濃鹽酸和2ml濃硫 酸。
【文檔編號】G01N33/576GK104407142SQ201410698135
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月28日 優(yōu)先權日:2014年11月28日
【發(fā)明者】譚柏清, 羅維曉, 甘宜梧, 李靜, 趙新, 朱玉娥, 肖慧 申請人:山東博科生物產業(yè)有限公司