基于質(zhì)譜和同位素標(biāo)記建立的定量檢測(cè)豬皮明膠的方法
【專利摘要】基于質(zhì)譜和同位素標(biāo)記建立的定量檢測(cè)豬皮明膠的方法，是采用HPLC-FTICR-MS，尋找豬皮明膠酶解混合物的特征性質(zhì)譜峰；通過同位素標(biāo)記技術(shù)對(duì)特征峰進(jìn)行標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜峰的質(zhì)荷比偏移，以同位素標(biāo)記后的特征性質(zhì)譜峰為內(nèi)標(biāo)，借助特征峰偏移前后的峰強(qiáng)度的不同，準(zhǔn)確計(jì)算豬皮明膠添加量。本發(fā)明FTICR-MS具有的高分辨率特性，能準(zhǔn)確地判斷可作為豬皮明膠定量檢測(cè)的特征峰，提供了豬皮明膠定量檢測(cè)的前提；利用同位素標(biāo)記技術(shù)和HPLC-FTICR-MS能有效定量檢測(cè)豬皮明膠添加量，誤差范圍在10%以內(nèi)，可為相關(guān)部門監(jiān)控食品提供依據(jù)；用胰蛋白酶酶解溶于H218O中的豬皮明膠，可一步完成蛋白質(zhì)酶解過程和多肽的18O標(biāo)記過程，縮短了豬皮明膠定量檢測(cè)所需的時(shí)間。
【專利說明】基于質(zhì)譜和同位素標(biāo)記建立的定量檢測(cè)豬皮明膠的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種豬皮明膠的定量檢測(cè)方法，具體涉及一種基于質(zhì)譜和同位素標(biāo)記 建立的定量檢測(cè)豬皮明膠的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 明膠具有凝膠性、乳化性、起泡性、成膜性等多種功能特性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī) 藥、照相等領(lǐng)域。目前，商業(yè)上大約95%的明膠來(lái)源于哺乳動(dòng)物，如豬皮、牛皮。然而，猶太 教和伊斯蘭教人不吃與豬相關(guān)的食物，因此，為了鑒別食品中豬皮明膠的添加與否，數(shù)量多 少，需要尋找一種能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)食品中豬皮明膠添加量的方法。
[0003] 本發(fā)明采用高效液相色譜-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（HPLC-FTICR-MS)，尋 找豬皮明膠酶解混合物的特征性質(zhì)譜峰；通過同位素標(biāo)記技術(shù)對(duì)特征峰進(jìn)行標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)質(zhì) 譜峰的質(zhì)荷比偏移，以同位素標(biāo)記后的特征性質(zhì)譜峰為內(nèi)標(biāo)，借助特征峰偏移前后的峰強(qiáng) 度的不同，準(zhǔn)確計(jì)算食品中的豬皮明膠添加量。本發(fā)明采用胰蛋白酶酶解、HPLC-FTICR-MS 和同位素標(biāo)記技術(shù)確定豬皮明膠添加量，國(guó)內(nèi)外未有文獻(xiàn)進(jìn)行相關(guān)報(bào)道。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明旨在提供一種豬皮明膠的定量檢測(cè)方法，以豬皮明膠為對(duì)象，采用胰蛋白酶酶 解、同位素標(biāo)記、HPLC-FTICR-MS檢測(cè)，有效確定豬皮明膠的添加量。
[0005] 其具體工藝方案如下： 1、溶液的配制 (1) 碳酸氫氨溶液的配制：分別用H2160和H2180配制10-100mM的碳酸氫氨溶液； (2) 酶的配制：分別用H216(^PH2180配制0.01-1mg/ml的胰蛋白酶溶液； (3) 豬皮明膠溶液的配制：用112160和112180配制的10-100mM的碳酸氫氨溶液溶解豬皮 明膠，分別得到溶于H2160和H2180的0. 1-10mg/ml的豬皮明膠溶液。
[0006] 2、同位素標(biāo)記 (1) 加酶：將H2160配制的胰蛋白酶加入H2160配制的豬皮明膠中，胰蛋白酶和豬皮明膠 質(zhì)量比mg/mg為1:200-1:10，將H2180配制的胰蛋白酶加入H2180配制的豬皮明膠中，胰蛋白 酶和豬皮明膠質(zhì)量比mg/mg為1:200-1:10; (2) 酶解和標(biāo)記：酶解和標(biāo)記過程同時(shí)進(jìn)行，反應(yīng)溫度為15-50 °C，反應(yīng)時(shí)間為4-30h； (3) 終止反應(yīng)：將酶解液置于70-100 °C中5-30min。
[0007] 3、HPLC-FTICR-MS檢測(cè) (1) 標(biāo)記物和未標(biāo)記物的混合：以H2180中的豬皮明膠水解物為內(nèi)標(biāo)，與H2160中的豬皮 明膠水解物按照質(zhì)量比mg/mg為1:50-50:1混合； (2) 上樣檢測(cè)：混合樣品注射進(jìn)入于FTICR-MS設(shè)備連接的HPLC中，對(duì)經(jīng)過HPLC分離 的豬皮明膠水解物進(jìn)行檢測(cè)，上樣量為〇. 5-20yg。
[0008]4、數(shù)據(jù)分析 (1) 根據(jù)氨基酸序列，尋找豬皮明膠的特征峰； (2) 分析并記錄特征峰在標(biāo)記前后的峰強(qiáng)度； (3) 定量方法的準(zhǔn)確性分析：通過比較標(biāo)記物/未標(biāo)記物即180/160的計(jì)算值與實(shí)際混 合比例檢驗(yàn)定量方法的準(zhǔn)確性， 18〇/16〇按照如下公式計(jì)算：

【權(quán)利要求】
1. 一種基于質(zhì)譜和同位素標(biāo)記建立的定量檢測(cè)豬皮明膠的方法，其特征是： A、 溶液的配制 (1) 碳酸氫氨溶液的配制：分別用H216O和H218O配制碳酸氫氨溶液； (2) 酶的配制：分別用H216O和H218O配制胰蛋白酶溶液； (3) 豬皮明膠溶液的配制：用H216O和H218O配制碳酸氫氨溶液溶解豬皮明膠，分別得到 溶于H216O和H218O的豬皮明膠溶液； B、 同位素標(biāo)記 (1) 加酶：將4160配制的胰蛋白酶加入H216O配制的豬皮明膠中，將H218O配制的胰蛋白 酶加入H218O配制的豬皮明膠中； (2) 酶解和標(biāo)記：酶解和標(biāo)記過程同時(shí)進(jìn)行； (3) 終止反應(yīng)； C、HPLC-FTICR-MS檢測(cè) (1) 標(biāo)記物和未標(biāo)記物的混合：以H218O中的豬皮明膠水解物為內(nèi)標(biāo)與H216O中的豬皮明 膠水解物進(jìn)行混合； (2) 上樣檢測(cè)：混合樣品注射進(jìn)入于FTICR-MS設(shè)備連接的HPLC中，對(duì)經(jīng)過HPLC分離 的豬皮明膠水解物進(jìn)行檢測(cè)，上樣量為〇. 5-20μg; D、 數(shù)據(jù)分析： (1) 根據(jù)氨基酸序列，尋找豬皮明膠的特征峰； (2) 分析并記錄特征峰在標(biāo)記前后的峰強(qiáng)度； (3) 定量方法的準(zhǔn)確性分析：通過比較標(biāo)記物/未標(biāo)記物即180/160的計(jì)算值與實(shí)際混 合比例檢驗(yàn)定量方法的準(zhǔn)確性， 18CV16O按照如下公式計(jì)算：
其中，Itl,I2和I4分別代表未標(biāo)記即16O的特征肽在實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的單一同位素峰強(qiáng)度， 質(zhì)量高2Da的峰強(qiáng)度和質(zhì)量高4Da的峰強(qiáng)度；Mtl,M2和M4分別代表未標(biāo)記即16O的特征肽 在理論上的單一同位素峰強(qiáng)度，質(zhì)量高2Da的峰強(qiáng)度和質(zhì)量高4Da的峰強(qiáng)度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于質(zhì)譜和同位素標(biāo)記建立的定量檢測(cè)豬皮明膠的方 法，其特征是： 所述配制的碳酸氫氨溶液為10-100mM; 所述配制的胰蛋白酶溶液為0. 01-1mg/ml; 所述豬皮明膠溶液的配制是用10-100mM的碳酸氫氨溶液溶解豬皮明膠，分別得到 0· 1-10mg/ml的豬皮明膠溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于質(zhì)譜和同位素標(biāo)記建立的定量檢測(cè)豬皮明膠 的方法，其特征是：所述同位素標(biāo)記當(dāng)中，H216O配制的胰蛋白酶和豬皮明膠的質(zhì)量比為 1:200-1:10,H218O配制的胰蛋白酶和豬皮明膠的質(zhì)量比為1:200-1:10 ; 所述酶解和標(biāo)記反應(yīng)溫度為15-50 °C，反應(yīng)時(shí)間為4-30h; 所述終止反應(yīng)條件為將酶解液置于70-100°C中5-30min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于質(zhì)譜和同位素標(biāo)記建立的定量檢測(cè)豬皮明膠的方 法，其特征是：所述以H218O中的豬皮明膠水解物為內(nèi)標(biāo)與H216O中的豬皮明膠水解物按照質(zhì) 量比mg/mg為1:50-50:1混合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的一種基于質(zhì)譜和同位素標(biāo)記建立的定量檢測(cè)豬皮明 膠的方法，其特征在于：所述實(shí)現(xiàn)特征性質(zhì)譜峰的質(zhì)荷比偏移，具體為： 未標(biāo)記時(shí)，胰蛋白酶處理后的豬皮明膠酶解物中特征峰為925. 42212+_925. 46212+，相應(yīng) 的氨基酸序列為GEPG*PTGVQGP*PGPAGEEGK，其中*表示P被羥基化，經(jīng)18O標(biāo)記后，特征峰 的質(zhì)荷比變成927. 42212-927. 46212++'氨基酸序列GEPG*PTGVQGP*PGPAGEEGK中K的羧基末 端兩個(gè)16O原子被18O代替。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的一種基于質(zhì)譜和同位素標(biāo)記建立的定量檢測(cè)豬皮明 膠的方法，其特征在于：所述實(shí)現(xiàn)特征性質(zhì)譜峰的質(zhì)荷比偏移，具體為： 未標(biāo)記時(shí)，胰蛋白酶處理后的豬皮明膠酶解物中特征峰為9 29 . 46 2 32+_929. 50232+，相應(yīng) 的氨基酸序列為IG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK，其中*表示P被羥基化，經(jīng)18O標(biāo)記后，特征 峰的質(zhì)荷比變成 931. 46232-931. 50232+，氨基酸序列IG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK中K的羧 基末端兩個(gè)16O原子被18O代替。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104458989SQ201410718314
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】涂宗財(cái), 沙小梅, 肖輝, 王輝, 段鄧樂, 陳媛, 劉光憲 申請(qǐng)人:江西師范大學(xué)