一種磁微?；瘜W發(fā)光法丙肝核心抗原檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種磁微?；瘜W發(fā)光法丙肝核心抗原檢測試劑盒，通過雙抗體夾心法定性或定量檢測血清樣品中總的或游離的HCV核心抗原，屬于臨床體外檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。它主要包括試劑R1、試劑R2、陽性參考品1瓶，陰性參考品1瓶、發(fā)光底物A、發(fā)光底物B和固體洗液，該試劑盒靈敏度高，穩(wěn)定性好，且操作簡便快速，易實現(xiàn)自動化操作，能夠更好地滿足國內(nèi)臨床使用需求。
【專利說明】-種磁微?；瘜W發(fā)光法丙肝核心抗原檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種磁微粒化學發(fā)光法丙肝核心抗原檢測試劑盒，通過雙抗體夾心法 定性或定量檢測血清樣品中總的或游離的HCV核心抗原，屬于臨床體外檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 丙型病毒件肝炎，簡稱為丙型肝炎、丙肝，是一種由丙型肝炎病毒（HCV)感染引起 的病毒性肝炎，主要經(jīng)輸血、針刺、吸毒等傳播，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV的感染率約 為3%，估計約1. 8億人感染了 HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3. 5萬例。丙型肝炎呈全球性 流行，可導致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌(HCC)。 未來20年內(nèi)與HCV感染相關(guān)的死亡率(肝衰竭及肝細胞癌導致的死亡)將繼續(xù)增加，對患者 的健康和生命危害極大，已成為嚴重的社會和公共衛(wèi)生問題。
[0003] 丙型肝炎病毒（HCV)為嗜肝性慢性病毒。HCV感染后，患者的起病和臨床癥狀極不 典型，以亞臨床感染為多見，容易造成漏診。HCV感染的慢性化發(fā)生率明顯高于乙型肝炎，較 乙型肝炎易早期出現(xiàn)肝硬化、肝癌，死亡率較高。因此HCV的檢測對丙型肝炎病毒感染的早 期診斷和指導臨床治療有重大的意義。
[0004] 目前用于HCV檢測的方法主要有：丙型肝炎病毒抗-HCV和丙型肝炎病毒核酸RNA 的檢測兩種方法。目前我國多采用第三代抗-HCV ELISA試劑，雖然在靈敏度和特異性上 有很大改善，但仍不能排除由于重組融合蛋白帶來的少數(shù)假陽性和極少數(shù)的漏檢。相對 而言，RT-PCR檢測HCV RNA具有早期、敏感和特異等特點，但該方法在技術(shù)和設(shè)備上要求較 高，且費時，檢出率較低；另外，該方法也容易因污染而出現(xiàn)假陽性。因此RT-PCR方法難以 在常規(guī)工作或基層實驗室推廣，限制了普遍應用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中抗-HCV ELISA試劑有假陽性、窗口期長、靈敏度低而 RT-PCR檢測HCV RNA在技術(shù)和設(shè)備上要求較高，費時費力，難以在常規(guī)工作或基層實驗室 推廣等缺點。本發(fā)明提供了一種靈敏度高，操作方便的磁微?；瘜W發(fā)光法丙肝核心抗原檢 測試劑盒。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是： 一種磁微粒化學發(fā)光法丙肝核心抗原檢測試劑盒，其特征在于，它包括試劑RU試劑 R2、陽性參考品1瓶，陰性參考品1瓶、發(fā)光底物A、發(fā)光底物B和固體洗液； 所述試劑Rl為含lg/L包被有抗HCV-cAg抗體磁珠的0. IM pH=7. 6的PBS緩沖液； 所述試劑R2為含1:500的HRP標記抗HCV-cAg抗體的0. IM pH=7. 6的PBS緩沖液。
[0007] 所述發(fā)光底物A為I mol/L的魯米諾和0? 5 mol/L的對碘苯酚的混合液；所述發(fā) 光底物B為1%的H2O2溶液。
[0008] 所述固體洗液為含0. 5%吐溫20的0. IM pH=7. 6的PBS緩沖液。
[0009] 所述陽性參考品為含HCV-cAg的PBS緩沖液，濃度為200ng/ml ; 所述陰性參考品為含BSA的PBS緩沖液，濃度為200ng/ml。
[0010] 本發(fā)明的試劑盒的使用方法如下： 在管式化學發(fā)光檢測儀上按如下程序進行檢測： (1) 在儀器反應小試管中加入試劑Rl 300W，然后加入陰陽性參考品或血清樣品 100W，再加入試劑R2 50W，37°C溫育1小時； (2) 在磁場中用固體洗液洗滌磁珠5次，洗去未結(jié)合物質(zhì)； (3 )加入發(fā)光底物液A、B各50W，室溫下孵育5分鐘后檢測發(fā)光強度。
[0011] 臨界值（Cut off value)的確定：陰性參考品檢測平均RLU值X 2. 1。若陰性參考 品檢測平均RLU值< 60時，按60計算；RLU>60時，按實際測定陰性對照平均RLU值X 2. 1 計算)。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是： (1)用雙抗體夾心法定性或定量檢測血清樣品中總的或游離的HCV核心抗原，擴大了 檢測范圍，縮短了窗口期。
[0013] (2)米用磁微?；瘜W發(fā)光技術(shù)將免疫磁珠體系、化學發(fā)光體系與免疫反應體系相 結(jié)合，用于檢測微量HCV抗原。它既具有RT-PCR的高靈敏度，又具有酶聯(lián)免疫操作的簡便、 快速特點，易于自動化操作。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是實施例1試劑盒線性范圍圖； 圖2是實施例1試劑盒與實時熒光定量PCR相關(guān)性圖； 圖3是實施例1試劑熱穩(wěn)定性結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合具體實施例來進一步詳細描述本發(fā)明。
[0016] 實施例1 試劑盒的組成及制備方法 1.試劑Rl :取購自dynal公司的包被有抗HCV-cAg抗體的磁珠0. Ig加入到IOOml 0. IM pH=7. 6的PBS緩沖液中混合均勻。
[0017] 2.試劑R2中HRP標記抗HCV-cAg抗體的制備方法如下： (1)稱取HRP25mg溶于1. 25%戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。
[0018] (2)反應后的酶溶液經(jīng)S印hadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在 Iml / min，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中， 緩慢攪拌。
[0019] (3)將待標記的抗體12. 5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
[0020] (4)用IM PH9. 5碳酸緩沖液0? 25ml，繼續(xù)攪拌3小時。
[0021] (5)加0? 2M賴氨酸0? 25ml，混勻后，置室溫2小時。
[0022] (6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C 1小時。
[0023] (7) 3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶 于少量0. 15M PH7. 4的PBS中。
[0024] (8)將上述溶液裝入透析袋中，對0. 15M PH7. 4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離 子后（用萘氏試劑檢測），IOOOOrpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶標結(jié)合物，分裝 后，-20°C冰凍保存。
[0025] 將上述制得的酶標結(jié)合物與0. IM pH=7. 6的PBS緩沖液按照體積比1:500混合 配制得Rl試劑。
[0026] 3.陽性參考品：1瓶，0. 5ml/瓶，含HCV-cAg抗原的PBS緩沖液，濃度為200ng/ml。
[0027] 4.陰性參考品：1瓶，0. 5ml/瓶，含BSA的PBS緩沖液，濃度為200ng/ml。
[0028] 5.發(fā)光底物A :在IOOml雙蒸水中加入12. Ilg Tris溶解后加入適量HCl溶液調(diào) 節(jié)pH，最終配制成0. IM pH 7. 6的Tris-HCl緩沖液。在此緩沖液中加入17. 72g的魯米諾 和Ilg的對碘苯酚，混合均勻。
[0029] 6.發(fā)光底物B :取3. 3ml市售30%的H2O2加入到0. IM pH 7. 6的Tris-HCl緩沖液 中混合均勻，制成1%的H2O2。
[0030] 7.固體洗液：取0? 5g吐溫20加入到0? IM pH 7. 6的PBS緩沖液中混合均勻。
[0031] 實施例2 靈敏度和線性范圍實驗 通過實驗檢測分析，該試劑臨界值（Cut off value)的確定：陰性參考品檢測平均RLU 值X 2. 1 (若陰性參考品檢測平均RLU值< 60時，按60計算；RLU>60時，按實際測定陰性 對照平均RLU值X 2. 1計算)。對低值樣本進行檢測，同時對比陰性參考品和正常人血清的 發(fā)光值，如表1所示。通過比對，當?shù)椭禈颖緷舛葹椹? 5ng/mL時，依舊檢測為陽性，說明實 施例1試劑的靈敏度能夠達到0. 5ng/mL，具有較好的靈敏度。

【權(quán)利要求】
1. 一種磁微粒化學發(fā)光法丙肝核心抗原檢測試劑盒，其特征在于，它包括試劑R1、試 劑R2、陽性參考品1瓶，陰性參考品1瓶、發(fā)光底物A、發(fā)光底物B和固體洗液；所述試劑R1 為含lg/L包被有抗HCV-cAg抗體磁珠的0. 1M pH=7. 6的PBS緩沖液；所述試劑R2為含 1:500的HRP標記抗HCV-cAg抗體的0. 1M pH=7. 6的PBS緩沖液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁微粒化學發(fā)光法丙肝核心抗原檢測試劑盒，其特征在于， 所述發(fā)光底物A為1 mol/L的魯米諾和0. 5 mol/L的對碘苯酚的混合液；所述發(fā)光底物B 為1%的H202溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁微?；瘜W發(fā)光法丙肝核心抗原檢測試劑盒，其特征在于， 所述固體洗液為含〇. 5%吐溫20的0. 1M pH=7. 6的PBS緩沖液。
【文檔編號】G01N33/553GK104360063SQ201410740936
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】甘宜梧, 李志明, 譚柏清, 謝清華, 王綺, 肖慧, 朱玉娥 申請人:山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司