一種人體尿液中8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和8-異構(gòu)前列腺素F2α的分析方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于一種人體尿液中8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和8-異構(gòu)前列腺素F2α的分析方法，其特征在于：采用該方法可較為方便和快速地定量檢測出活性氧引起的體內(nèi)代表性氧化應(yīng)激生物標志物的變化情況，可用于評估體內(nèi)氧化損傷和修復程度，研究疾病病理過程。本發(fā)明采用AgilentBondEluC18固相萃取柱，可同時凈化尿液中兩類不同質(zhì)譜檢測模式的三種化合物：8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷（正離子模式檢測）和8-異構(gòu)前列腺素F2α（負離子模式檢測），并采用相同的液相色譜柱和流動相對三種化合物進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測。該方法前處理簡單便捷，靈敏度高、重復性和回收率好。
【專利說明】一種人體尿液中8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和8-異構(gòu) 前列腺素 F2a的分析方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人體尿液中8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和8-異構(gòu)前列腺素 F2 a的前處理和分析新方法，并將其用于人體尿液中氧化應(yīng)激指標的評估。具體是采用 Agilent Bond EluC18固相萃取柱同時凈化尿液中8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和8-異 構(gòu)前列腺素F2 a，然后采用HPLC-MS/MS技術(shù)測定尿液中8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和 8_異構(gòu)前列腺素F2 a含量的分析方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 活性氧（ROS)是細胞有氧代謝過程中產(chǎn)生的化學性質(zhì)活潑的氧自由基和能轉(zhuǎn)化 為自由基的物質(zhì)。生物體內(nèi)的ROS是機體不可或缺的物質(zhì)，它的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡 狀態(tài)。在低濃度和中等濃度時，ROS起重要的生理作用，它參與機體的免疫過程，并能調(diào)節(jié)信 號傳導途徑、控制基因表達和蛋白質(zhì)翻譯后的修飾等，進而參與細胞生長、分化、死亡等。但 當ROS的產(chǎn)生和機體的抗氧化能力之間的平衡被打破而導致ROS超過生理限度時，就會損 害生物大分子，如DNA、RNA氧化損傷和脂質(zhì)體過氧化等，從而引起多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。 8_羥基-脫氧鳥苷，8-羥基鳥苷和-異構(gòu)前列腺素F2 a分別對應(yīng)于DNA、RNA氧化損傷產(chǎn) 物和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。這三種化合物為代表性的氧化應(yīng)激生物標志物，分析這三種化合物 的含量對于評估體內(nèi)氧化損傷程度以及研究疾病病理過程都有重要作用。
[0003] 目前，8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷可采用用酶聯(lián)免疫法、氣相色譜質(zhì)譜 (GC-MS)、液相色譜-電化學以及HPLC-MS/MS法進行檢測，其中HPLC-MS/MS法選擇性好，靈 敏度高。在HPLC-MS/MS進行分析時，樣品可采取直接稀釋或固相萃取進行前處理凈化，但 由于這些化合物極性很高，在常用的反相色譜柱上基本不保留，結(jié)果導致這些化合物與其 它干擾物不宜分離，造成定量干擾，并且電噴霧離子源（ESI源)對反相柱分離的極性化合物 的檢測并不是很靈敏，實際樣品化合物靈敏度可能會低于檢測限；8-異構(gòu)前列腺素F2 a可 采用酶聯(lián)免疫法，GC-MS和HPLC/MS/MS進行分析。HPLC-MS/MS法具有較好的靈敏度和選擇 性，適宜于8-異構(gòu)前列腺素F2 a的分析。但尿樣中這種化合物含量較低，又存在有其他結(jié) 構(gòu)類似的化合物，樣品通常是需要固相萃取或是液液萃取-固相萃取相結(jié)合的方式進行凈 化，濃縮后進行定量。
[0004] 文獻盡管針對3種化合物都建立了相應(yīng)的HPLC-MS/MS分析方法，但對于8-羥 基-脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷，有必要通過合適的樣品前處理方法降低樣品檢測時的基質(zhì)效 應(yīng)，提高檢測的靈敏度和選擇性；對于8-異構(gòu)前列腺素F2a的分析，則要注重于發(fā)展高效、 穩(wěn)定、靈敏的前處理方法。并且三種化合物分屬于兩種質(zhì)譜檢測模式，文獻通常采用不同的 前處理方法(不同的SPE方法）和儀器方法(不同的色譜柱和流動相）進行分析，處理通量不 大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的正是針對上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足而提供的一種人體尿液中 8_羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和8-異構(gòu)前列腺素F2 α的固相萃取前處理和HPLC-MS/MS 分析新方法。采用該方法可便捷地同時凈化人體尿液中的8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和 8_異構(gòu)前列腺素F2 α，并采用HPLC-MS/MS對三種化合物的含量進行定量分析。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種人體尿液中8-羥基脫氧鳥苷、 8_羥基鳥苷和8-異構(gòu)前列腺素F2 α的分析方法，包括以下步驟： (1) 8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和8-異構(gòu)前列腺素F2 α的凈化：將解凍好的尿液 lmL，在37° C下加熱5min溶解可能混在沉淀中的目標化合物，加入40 μ L [ffl -8-羥基 鳥苷和D4-8-異構(gòu)前列腺素F2a混合內(nèi)標溶液。采用Agilent Bond EluC18固相萃取柱 對尿液樣品中的三種化合物進行凈化。具體過程為：將尿液上樣至已活化的Agilent Bond EluC18固相萃取柱上（5ml甲醇和5ml H20活化)，2ml H2O洗滌，2ml體積比為I : 4的甲 醇/H2O洗脫8-羥基-脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷(第一集分)，2ml體積比為5 : 5的甲醇/ H2O洗雜質(zhì)，最后再用2ml體積比為3 : 1的甲醇/H2O洗脫8-異構(gòu)前列腺素F2 a (第二集 分)。由于8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷極性較大，含較少的有機相的洗脫液就可以將這兩 種化合物洗脫，而8-異構(gòu)前列腺素極性較弱，需要較高有機相的洗脫液才能將其洗脫。為 減少每一洗脫集分的雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)，提高檢測的靈敏度，因此采用不同配比的甲醇水 溶液對三種化合物進行逐步洗脫，盡可能去除樣品中可能的其它雜質(zhì)。
[0007] (2) 8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和8-異構(gòu)前列腺素F2 a的HPLC-MS/MS分析： 分析條件如下： 米用 Agilent Poroshell 120 SB-C18 (150 mm X 3· 0 mm i. d.，2· 7 μ m)色譜柱； 柱溫：30 °C ;進樣量：10 μ? ;流速：300 μ L/min ;流動相：Α· 0. 1%乙酸溶液，B.乙腈；洗 脫梯度：〇 -2min，5%B，6-9 min 100%B，10-15 min，5 %B，；離子源：電噴霧離子源（ESI);掃 描模式：8-輕基脫氧鳥苷、8-輕基鳥苷-----正離子掃描，8-異構(gòu)前列腺素F2 a-----負離 子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM);干燥氣（N2)溫度和流速：290 °C，11 L/min ;霧化器 壓力：40 psi ;鞘氣（％)溫度和流速：400 °C，12 L/min;毛細管電壓（Capillary voltage): 3500 V ;碎裂電壓（Fragmentor voltage) :380 V ;碰撞氣：N2。霧化電壓：1500V 分析物及其內(nèi)標的MRM參數(shù)參見表1。
[0008] 表1分析物及其內(nèi)標的MRM參數(shù)

【權(quán)利要求】
1. 一種人體尿液中8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和8-異構(gòu)前列腺素F2 a的分析方 法，其特征在于：包括以下步驟：將解凍好的尿液lmL，在37° C下加熱5min溶解可能混在沉 淀中的目標化合物，加入[ffl-8-羥基鳥苷和D4-8_異構(gòu)前列腺素F2a的混合內(nèi)標溶液； 采用Agilent Bond EluC18固相萃取柱對尿液樣品中的8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和 8_異構(gòu)前列腺素F2 a進行凈化，具體過程是：尿液上樣至已活化的Agilent Bond EluC18 固相萃取柱上，2ml H20洗滌，2ml體積比為1 : 4的甲醇/H20洗脫屬于第一集分的8-羥 基-脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷，2ml體積比為5 : 5的甲醇/H20洗雜質(zhì)，最后再用2ml體積 比為3 : 1的甲醇/H20洗脫屬于第二集分的8-異構(gòu)前列腺素F2a，將凈化后的2個洗脫 集分采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS /MS)方法檢測8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和 8_異構(gòu)前列腺素F2 a的濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體尿液中8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和8-異構(gòu)前列腺 素F2a的分析方法，其特征在于：Agilent Bond EluC18固相萃取柱使用前先通過5ml甲 醇和5ml H20進行活化。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體尿液中8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和8-異構(gòu)前列腺 素F2 a的分析方法，其特征在于：HPLC-MS/MS分析條件如下： 采用規(guī)格為 150 mm X 3.0 mm i.d.，2.7 iim 的 Agilent Poroshell 120 SB-C18 色譜柱；柱溫：30 °C;進樣量：10 ML;流速：300 iiL/min;流動相：A. 0. 1%乙酸溶液，B. 乙腈；洗脫梯度：〇 _2min，5%B，6_9 min 100%B，10_15 min，5 %B，；離子源：電噴霧離子 源（ESI);掃描模式：8-輕基脫氧鳥苷、8-輕基鳥苷-----正離子掃描，8-異構(gòu)前列腺素 F2 a-----負離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM);干燥氣（N2)溫度和流速：290 °C， 11 L/min;霧化器壓力：40 psi;鞘氣（N2)溫度和流速：400 °C，12 L/min;毛細管電壓 (Capillary voltage) :3500 V ;碎裂電壓（Fragmentor voltage) :380 V ;碰撞氣：N2 ;霧化 電壓：1500V。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體尿液中8-羥基脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和8-異構(gòu)前列腺 素F2a的分析方法，其特征在于：所述混合內(nèi)標溶液中的[ffl-8-羥基鳥苷和D4-8_異 構(gòu)前列腺素F2a在待測樣品溶液中的最終濃度均為lOng/ml。
【文檔編號】G01N30/88GK104391071SQ201410761123
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月13日
【發(fā)明者】趙閣, 余晶晶, 王昇, 王冰, 謝復煒 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院