基于流式細(xì)胞技術(shù)的酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于啤酒【技術(shù)領(lǐng)域】用于啤酒酵母絮凝性的檢測(cè)方法，特別涉及一種基于流式細(xì)胞技術(shù)的酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白的檢測(cè)方法，包括如下步驟：首先酵母洗滌，其次酵母的重懸和稀釋，再次在酵母菌懸液中加入FITC-avidin溶液孵育進(jìn)行酵母菌懸液染色，最后利用流式細(xì)胞儀測(cè)定酵母絮凝性能。本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)誤差低，平行性好；可以進(jìn)一步對(duì)酵母菌群絮凝蛋白分布進(jìn)行研究；可以作為酵母菌種的性能評(píng)價(jià)手段對(duì)不同絮凝能力的酵母菌株進(jìn)行區(qū)分；可以作為酵母絮凝性能評(píng)價(jià)指標(biāo)，為酵母選育及菌株管理提供有力的技術(shù)支持。
【專利說明】基于流式細(xì)胞技術(shù)的酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于啤酒【技術(shù)領(lǐng)域】用于啤酒酵母絮凝性的檢測(cè)方法，特別涉及一種基于流 式細(xì)胞技術(shù)的酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 酵母的絮凝性對(duì)于啤酒釀造過程的管理具有非常重要的意義。在啤酒釀造過程 中，不僅要求酵母快速、充分的對(duì)麥汁中營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行發(fā)酵，而且要求酵母在發(fā)酵結(jié)束時(shí)形 成稠密的沉淀。絮凝能力太強(qiáng)的酵母由于過早絮凝，酒體雙乙酰、乙醛等成熟度指標(biāo)還未還 原，從而影響啤酒的成熟度及風(fēng)味；相反，絮凝性差的酵母會(huì)造成過濾困難，影響發(fā)酵液的 澄清度。因此，酵母的絮凝性能是釀酒師進(jìn)行酵母菌株選育及生產(chǎn)過程管理所必須要考慮 的因素。
[0003] 目前酵母絮凝性的主要評(píng)價(jià)方法多是建立在Helm法基礎(chǔ)上的改良方法，其檢測(cè) 原理是通過對(duì)比酵母絮凝前后的自由細(xì)胞數(shù)或光密度的變化，確定酵母絮凝水平。但是這 類通過酵母數(shù)量上的變化評(píng)價(jià)絮凝性能的方法由于很大程度上依賴檢測(cè)時(shí)所用酵母的狀 態(tài)表現(xiàn)，因此存在誤差大且不同批次檢測(cè)數(shù)據(jù)重復(fù)性差的共性問題。
[0004] 酵母的絮凝性的直觀表現(xiàn)是酵母數(shù)量上的變化，而酵母細(xì)胞間發(fā)生絮凝現(xiàn)象的實(shí) 質(zhì)則是由于酵母細(xì)胞表面所分泌絮凝蛋白與相鄰酵母細(xì)胞壁上的甘露糖殘基專一性結(jié)合 而引起的。R.AlexSpeers等人利用熒光分光光度計(jì)對(duì)酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白密度分布進(jìn) 行研究，但由于利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)得到熒光信號(hào)所表現(xiàn)的是待測(cè)酵母樣品均值，無 法獲得酵母的菌群的分類或分布等詳細(xì)信息，因此利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)酵母細(xì)胞表面 絮凝蛋白的方法無法實(shí)現(xiàn)對(duì)酵母生命周期內(nèi)酵母菌群絮凝蛋白分布的分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中酵母絮凝性能評(píng)價(jià)的誤差大、重現(xiàn)性差、無法對(duì)酵母菌群 分布進(jìn)行分析的不足，提供一種利用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白進(jìn)行檢測(cè)的方 法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007] -種基于流式細(xì)胞技術(shù)的酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白的檢測(cè)方法，包括如下步驟：首 先酵母洗滌，其次酵母的重懸和稀釋，再次在酵母菌懸液中加入FITC-avidin溶液孵育進(jìn) 行酵母菌懸液染色，最后利用流式細(xì)胞儀測(cè)定酵母絮凝性能。
[0008] 具體步驟如下：
[0009] 步驟1 :酵母洗滌，對(duì)酵母的培養(yǎng)液進(jìn)行離心后，用5mL100mMEDTA洗滌兩遍，然 后用去離子水洗滌兩遍；
[0010] 步驟2:酵母的重懸，用絮凝緩沖液對(duì)洗滌后的酵母進(jìn)行重懸；
[0011] 步驟3:酵母的菌懸液的稀釋，根據(jù)重懸后的酵母濃度，使用所述絮凝緩沖液將酵 母菌懸液稀釋至酵母濃度為4?5X106cell/mL;
[0012] 步驟4 :酵母菌懸液的染色，在酵母菌懸液中加入FITC-avidin溶液，使酵母菌懸 液中FITC-avidin濃度達(dá)到2?2. 5mgFITC_avidin/109cell，冰上、暗反應(yīng)條件下孵育lhr；
[0013]步驟5:流式細(xì)胞儀檢測(cè)，取1ml染色后的酵母菌懸液進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0014] 優(yōu)選的，步驟1中所述的離心條件為5000Xg，5min。
[0015] 優(yōu)選的，步驟2中所述的絮凝緩沖液為包含0. 2mMCaCl2的20mM醋酸鹽緩溶液。 [0016]優(yōu)選的，流式細(xì)胞儀檢測(cè)：取1ml染色后的酵母菌懸液進(jìn)行流式細(xì)胞儀（BD AccuriC6)檢測(cè)，以未加FITC-avidin的酵母菌懸液做為陰性對(duì)照（確定酵母范圍及消除 樣品本身的自發(fā)熒光）。
[0017] 流式細(xì)胞儀檢測(cè)條件：選擇激發(fā)光波長(zhǎng)488nm的FL1通道，收樣速度66uL/min，每 個(gè)樣品收集2X104個(gè)酵母細(xì)胞，利用CFlowSampler軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以FL1通道的 熒光值作為酵母表面絮凝蛋白含量的參數(shù)，以FSC值作為酵母體積的參數(shù)。
[0018]上述FITC-avidin，購(gòu)自invitrogen;貨號(hào) 434411;批號(hào) 1324041A。
[0019] 流式細(xì)胞技術(shù)由于借助鞘液在流體動(dòng)力的聚集作用下可實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞不同信 號(hào)的測(cè)量，更利于精確反映酵母菌群的生理狀態(tài)，而要實(shí)現(xiàn)使用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)酵母細(xì)胞 表面絮凝蛋白進(jìn)行檢測(cè)，首先要確定絮凝蛋白檢測(cè)的特異性抗體以及能與抗體耦合的適合 流式細(xì)胞儀檢測(cè)的熒光素，本發(fā)明中利用FITC-avidin檢測(cè)酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白，其中 含有甘露糖側(cè)鏈的avidin做為特異性抗體能夠與酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白結(jié)合，共軛的熒 光素FITC提供可被熒光分光光度計(jì)檢測(cè)的熒光信號(hào)；其次本發(fā)明研究確定利于絮凝蛋白 與特異性抗體結(jié)合的絮凝緩沖液體系，以及最佳的特異性抗體與酵母懸液的反應(yīng)比例及染 色時(shí)間。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是：
[0021] 其一，本發(fā)明相對(duì)于目前基于酵母數(shù)量上的變化評(píng)價(jià)絮凝性能的檢測(cè)方法，檢測(cè) 誤差低，平行性好；
[0022] 其二，本發(fā)明相對(duì)于基于熒光分光光度法的檢測(cè)方法，可以進(jìn)一步對(duì)酵母菌群絮 凝蛋白分布進(jìn)行研究；
[0023] 其三，本發(fā)明可以作為菌種的性能評(píng)價(jià)手段對(duì)不同絮凝能力的酵母菌株進(jìn)行區(qū) 分；
[0024] 因此本發(fā)明可以作為酵母絮凝性能評(píng)價(jià)指標(biāo)，為酵母選育及菌株管理提供有力的 技術(shù)支持。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 附圖1為本發(fā)明具體實(shí)施例的2的陰性對(duì)照樣品（未染色）的流式圖
[0026] 其中，圖A為FSC-SSC散點(diǎn)圖；圖B為FL1-FSC散點(diǎn)圖；
[0027] 附圖2為本發(fā)明具體實(shí)施例2的樣品的流式圖
[0028] 其中，圖A為FSC-SSC散點(diǎn)圖；圖B為FL1-FSC散點(diǎn)圖；圖C為FSC-A直方圖及分 組（M1-M5);
[0029] 附圖3為本發(fā)明具體實(shí)施例2的M1-M5各組酵母表面絮凝蛋白的流式FL1-A直方 圖
[0030]其中，圖A為Ml組酵母的絮凝蛋白的流式FL1-A直方圖；圖B為M2組酵母的絮凝 蛋白的流式FL1-A直方圖；圖C為M3組酵母的絮凝蛋白的流式FL1-A直方圖；圖D為M4組 酵母的絮凝蛋白的流式FL1-A直方圖；圖E為M5組酵母的絮凝蛋白的流式FL1-A直方圖； [0031]附圖4為本發(fā)明具體實(shí)施例2的不同大小的酵母（M1-M5)表面絮凝蛋白水平差 異；
[0032] 附圖5為本發(fā)明具體實(shí)施例3發(fā)酵過程酵母的增殖曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】如下：
[0034] 實(shí)施例1:
[0035] 取某啤酒生產(chǎn)廠發(fā)酵過程20hr、60hr、110hr時(shí)發(fā)酵液樣品各lOOmL，各取lmL發(fā) 酵液樣品，使用酵母計(jì)數(shù)儀（BDZ1質(zhì)子分析儀）對(duì)樣品中的酵母數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)；各取5mL 發(fā)酵液進(jìn)行離心（5000Xg，5min)，使用5mL100mMEDTA對(duì)離心后的酵母泥洗滌兩遍，然后 用5mL去離子水洗漆兩遍；用5mL絮凝緩沖液（20mMacetatebuffer,包含0.2mMCaCl2) 對(duì)洗滌后的酵母進(jìn)行重懸；根據(jù)各樣品檢測(cè)的酵母數(shù)，使用絮凝緩沖液將酵母菌懸液稀釋 至酵母濃度為4?5X106cell/mL;取lmL酵母菌懸液，加入4iiLFITC-avidin溶液（2.5 mg/mL)，在冰上、暗反應(yīng)條件下孵育lhr;取lmL染色后的酵母菌懸液進(jìn)行流式細(xì)胞儀（BD AccuriC6)檢測(cè)，以未加FITC-avidin的酵母菌懸液做為陰性對(duì)照，每個(gè)發(fā)酵液樣品平行 檢測(cè)3次。流式細(xì)胞儀檢測(cè)條件：選擇激發(fā)光波長(zhǎng)488nm的FL1通道，收樣速度66uL/min， 每個(gè)樣品收集2X104個(gè)酵母細(xì)胞，利用CFlowSampler軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以FL1通道 的熒光值作為酵母表面絮凝蛋白含量的參數(shù)，檢測(cè)結(jié)果如下表1所示：
[0036] 表1不同發(fā)酵液樣品中酵母的絮凝蛋白水平
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于流式細(xì)胞技術(shù)的酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如 下步驟：首先酵母洗滌，其次酵母的重懸和稀釋，再次在酵母菌懸液中加入FITC-avidin溶 液孵育進(jìn)行酵母菌懸液染色，最后利用流式細(xì)胞儀測(cè)定酵母絮凝性能。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于流式細(xì)胞技術(shù)的酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白的檢測(cè)方法，其 特征在于，具體步驟如下： 步驟1 :酵母洗滌，對(duì)酵母的培養(yǎng)液進(jìn)行離心后，用lOOmM EDTA洗滌兩遍，然后用去離 子水洗漆兩遍； 步驟2 :酵母的重懸，用絮凝緩沖液對(duì)洗滌后的酵母進(jìn)行重懸； 步驟3 :酵母的菌懸液的稀釋，根據(jù)重懸后的酵母濃度，使用所述絮凝緩沖液將酵母菌 懸液稀釋至酵母濃度為4飛X 106cell/mL ; 步驟4 :酵母菌懸液的染色，在酵母菌懸液中加入FITC-avidin溶液，使酵母菌懸液中 FITC-avidin濃度達(dá)到2?2. 5mg FITC_avidin/109cell，冰上、暗反應(yīng)條件下孵育lhr ; 步驟5 :流式細(xì)胞儀檢測(cè)，取lml染色后的酵母菌懸液進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于流式細(xì)胞技術(shù)的酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白的檢測(cè)方法，其 特征在于，步驟1中所述的離心條件為5000Xg，5min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于流式細(xì)胞技術(shù)的酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白的檢測(cè)方法，其 特征在于，步驟2中所述的絮凝緩沖液為包含0. 2mM CaCl2的20mM醋酸鹽緩溶液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于流式細(xì)胞技術(shù)的酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白的檢測(cè)方法，其 特征在于，步驟5中所述的流式細(xì)胞儀檢測(cè)條件：選擇激發(fā)光波長(zhǎng)488nm的FL1通道，收樣 速度66uL/min，每個(gè)樣品收集2 X 104個(gè)酵母細(xì)胞，利用軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以FL1通道的 熒光值作為酵母表面絮凝蛋白含量的參數(shù)，以FSC值作為酵母體積的參數(shù)。
【文檔編號(hào)】G01N15/14GK104458543SQ201410816248
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月24日
【發(fā)明者】尹花, 陳嶸, 陳璐, 余俊紅, 侯曉平, 萬秀娟, 趙玉祥, 賀揚(yáng), 田玉紅, 楊梅 申請(qǐng)人:青島啤酒股份有限公司