一種篩選環(huán)孢素a于免疫t細(xì)胞中藥物作用靶位的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位進(jìn)行篩選的方法。本篩選環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位的方法利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位進(jìn)行篩選，方法包括以下步驟：步驟1)建立環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞作用樣品組群、步驟2)制備免疫T細(xì)胞二維電泳蛋白質(zhì)樣品、步驟3)雙向凝膠電泳、步驟4)圖像采集分析得出結(jié)果。本發(fā)明篩選環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位的方法，操作思路明確、結(jié)果真實可靠，克服了常規(guī)篩選手段由于分析數(shù)據(jù)過于龐大和復(fù)雜，造成篩選結(jié)果誤差較大，準(zhǔn)確率低的缺陷，為臨床用藥提供了具有藥理意義和指導(dǎo)作用的檢測結(jié)果。
【專利說明】一種篩選環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位進(jìn)行篩選的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)孢素A(cyclosprine，CsA)是由11個氨基酸組成的環(huán)狀多肽，是土壤中一種真菌的活性代謝物。1978年英國首次將環(huán)孢素A應(yīng)用于臨床腎移植，此后環(huán)孢素A又用于肝、心、肺、胰腺、骨髓等器官的移植，均取得令人滿意的效果，明顯提高病人的生存率。1984年環(huán)孢素A進(jìn)入我國，形成了環(huán)孢素A加硫唑嘌呤加激素的三聯(lián)免疫抑制方案，大大提高了移植存活率，同時也使移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率大幅下降。環(huán)孢素A作為一種強(qiáng)效免疫抑制劑，近年來人們對它的研宄越來越多，發(fā)現(xiàn)它還可用來治療自身免疫性疾病、血液病及寄生蟲病等。目前，臨床上針對個體病患，環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位一直無法確定，且常規(guī)篩選手段由于分析數(shù)據(jù)過于龐大和復(fù)雜，造成篩選結(jié)果誤差較大，準(zhǔn)確率低，難以在臨床用藥時提供具有藥理意義和指導(dǎo)作用的檢測結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位進(jìn)行篩選的方法。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本篩選環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位的方法利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位進(jìn)行篩選，其具體方法包括以下步驟:
[0005]步驟I):將培養(yǎng)至第五日的免疫T細(xì)胞，分為等量的對照組和若干試驗組，向試驗組中分別加入不同濃度的環(huán)孢素A，整體形成環(huán)孢素A對免疫T細(xì)胞模型的藥物作用樣品組群；
[0006]步驟2):將步驟I)所述的環(huán)孢素A對免疫T細(xì)胞模型的藥物作用樣品組群培養(yǎng)至對數(shù)生長期；棄去培養(yǎng)液，刮取細(xì)胞收集細(xì)胞到若干對應(yīng)的離心管；收集完成后用磷酸緩沖液沖洗細(xì)胞5次，經(jīng)沖洗后吸干離心管內(nèi)殘留磷酸緩沖液，然后加入等體積lOmol/L脲、50mmol/L DTT,5%的3-[ (3-膽酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmo 1/L三羥甲基氨基甲烷形成的混合溶液，反復(fù)凍融細(xì)胞5?8次；放入冰鹽浴中靜置30min ;然后升溫至10°C的條件下離心2h ;離心完成后取上清液測定蛋白濃度，并根據(jù)測得的蛋白質(zhì)濃度標(biāo)記、分裝，轉(zhuǎn)移至70°C的保溫箱中儲存存儲備用；
[0007]步驟3):將步驟2)中存儲備用的上清液取出兩組，每組各50ug，與等量lOmol/L尿素、5%的3-[ (3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，20mmol/L 二硫蘇糖醇0.5%的IPG緩沖液組成的混合液體混合；混合后加入IPG持膠槽中，IPG干膠條的膠面向下放入槽中，并于其表面涂抹一層有機(jī)礦物油，IPG持膠槽加蓋后置于IPGphor水平電泳儀電極板上進(jìn)行等電聚焦；等電聚焦結(jié)束后，IPG干膠條在平衡液中平衡30min ;平衡完成后將IPG干膠條移至SDS-PAGE分離膠上，并以瓊脂糖封膠，將玻璃板置于電泳槽中以恒流方式進(jìn)行電泳，至電泳槽中溴酚藍(lán)前沿延伸至距凝膠底邊5mm處停止電泳，得到凝膠；
[0008]步驟4):將由步驟3)得到的凝膠染色，并用凝膠掃描儀透射掃描；將得到圖像用PDQUEST軟件進(jìn)行分析，圖像分析過程包括圖譜的剪切，蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測，不同凝膠間的匹配，量的歸一化以及利用內(nèi)標(biāo)2DMARKER的標(biāo)準(zhǔn)分了量和等電點(diǎn)確定膠內(nèi)蛋白點(diǎn)的相對分子量和等電點(diǎn)；以正常條件下免疫T細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜為參考膠，與環(huán)孢素A作用下培養(yǎng)的免疫T細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進(jìn)行配比，獲得環(huán)孢素A作用于免疫T細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白質(zhì)；
[0009]步驟5):將由步驟4)得到的差異表達(dá)蛋白質(zhì)經(jīng)膠內(nèi)酶切后，通過質(zhì)譜，測定差異表達(dá)蛋白質(zhì)；與質(zhì)譜庫比較，篩選出差異表達(dá)蛋白質(zhì)；明確差異蛋白后，其生物學(xué)功能確定，通過蛋白印跡驗證，即得環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位。
[0010]本發(fā)明篩選環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位的方法，操作思路明確、結(jié)果真實可靠，克服了常規(guī)篩選手段由于分析數(shù)據(jù)過于龐大和復(fù)雜，造成篩選結(jié)果誤差較大，準(zhǔn)確率低的缺陷，為臨床用藥提供了具有藥理意義和指導(dǎo)作用的檢測結(jié)果。

【具體實施方式】
[0011]本將培養(yǎng)至第五日的免疫T細(xì)胞，分為等量的對照組和若干試驗組，向試驗組中分別加入不同濃度的環(huán)孢素A，整體形成環(huán)孢素A對免疫T細(xì)胞模型的藥物作用樣品組群；
[0012]步驟2):將步驟I)所述的環(huán)孢素A對免疫T細(xì)胞模型的藥物作用樣品組群培養(yǎng)至對數(shù)生長期；棄去培養(yǎng)液，刮取細(xì)胞收集細(xì)胞到若干對應(yīng)的離心管；收集完成后用磷酸緩沖液沖洗細(xì)胞5次，經(jīng)沖洗后吸干離心管內(nèi)殘留磷酸緩沖液，然后加入等體積lOmol/L脲、50mmol/L DTT,5%的3-[ (3-膽酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmo 1/L三羥甲基氨基甲烷形成的混合溶液，反復(fù)凍融細(xì)胞5?8次；放入冰鹽浴中靜置30min ;然后升溫至10°C的條件下離心2h ;離心完成后取上清液測定蛋白濃度，并根據(jù)測得的蛋白質(zhì)濃度標(biāo)記、分裝，轉(zhuǎn)移至70°C的保溫箱中儲存存儲備用；
[0013]步驟3):將步驟2)中存儲備用的上清液取出兩組，每組各50ug，與等量lOmol/L尿素、5%的3-[ (3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，20mmol/L 二硫蘇糖醇0.5%的IPG緩沖液組成的混合液體混合；混合后加入IPG持膠槽中，IPG干膠條的膠面向下放入槽中，并于其表面涂抹一層有機(jī)礦物油，IPG持膠槽加蓋后置于IPGphor水平電泳儀電極板上進(jìn)行等電聚焦；等電聚焦結(jié)束后，IPG干膠條在平衡液中平衡30min ;平衡完成后將IPG干膠條移至SDS-PAGE分離膠上，并以瓊脂糖封膠，將玻璃板置于電泳槽中以恒流方式進(jìn)行電泳，至電泳槽中溴酚藍(lán)前沿延伸至距凝膠底邊5mm處停止電泳，得到凝膠；
[0014]步驟4):將由步驟3)得到的凝膠染色，并用凝膠掃描儀透射掃描；將得到圖像用PDQUEST軟件進(jìn)行分析，圖像分析過程包括圖譜的剪切，蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測，不同凝膠間的匹配，量的歸一化以及利用內(nèi)標(biāo)2DMARKER的標(biāo)準(zhǔn)分了量和等電點(diǎn)確定膠內(nèi)蛋白點(diǎn)的相對分子量和等電點(diǎn)；以正常條件下免疫T細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜為參考膠，與環(huán)孢素A作用下培養(yǎng)的免疫T細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進(jìn)行配比，獲得環(huán)孢素A作用于免疫T細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白質(zhì)；
[0015]步驟5):將由步驟4)得到的差異表達(dá)蛋白質(zhì)經(jīng)膠內(nèi)酶切后，通過質(zhì)譜，測定差異表達(dá)蛋白質(zhì)；與質(zhì)譜庫比較，篩選出差異表達(dá)蛋白質(zhì)；明確差異蛋白后，其生物學(xué)功能確定，通過蛋白印跡驗證，即得環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位。
[0016]本發(fā)明包括但不限于上述實施方式，任何符合本權(quán)利要求書描述的產(chǎn)品，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種篩選環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位的方法，其特征是:本方法利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位進(jìn)行篩選，其具體方法包括以下步驟: 步驟I):將培養(yǎng)至第五日的免疫T細(xì)胞，分為等量的對照組和若干試驗組，向試驗組中分別加入不同濃度的環(huán)孢素A，整體形成環(huán)孢素A對免疫T細(xì)胞模型的藥物作用樣品組群；步驟2):將步驟I)所述的環(huán)孢素A對免疫T細(xì)胞模型的藥物作用樣品組群培養(yǎng)至對數(shù)生長期；棄去培養(yǎng)液，刮取細(xì)胞收集細(xì)胞到若干對應(yīng)的離心管；收集完成后用磷酸緩沖液沖洗細(xì)胞5次，經(jīng)沖洗后吸干離心管內(nèi)殘留磷酸緩沖液，然后加入等體積lOmol/L脲、50mmol/L DTT,5%的3-[ (3-膽酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmo 1/L三羥甲基氨基甲烷形成的混合溶液，反復(fù)凍融細(xì)胞5?8次；放入冰鹽浴中靜置30min ;然后升溫至10°C的條件下離心2h ;離心完成后取上清液測定蛋白濃度，并根據(jù)測得的蛋白質(zhì)濃度標(biāo)記、分裝，轉(zhuǎn)移至70°C的保溫箱中儲存存儲備用； 步驟3):將步驟2)中存儲備用的上清液取出兩組，每組各50ug，與等量lOmol/L尿素、5%的3-[(3_膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，20mmol/L 二硫蘇糖醇0.5%的IPG緩沖液組成的混合液體混合；混合后加入IPG持膠槽中，IPG干膠條的膠面向下放入槽中，并于其表面涂抹一層有機(jī)礦物油，IPG持膠槽加蓋后置于IPGphor水平電泳儀電極板上進(jìn)行等電聚焦；等電聚焦結(jié)束后，IPG干膠條在平衡液中平衡30min ;平衡完成后將IPG干膠條移至SDS-PAGE分離膠上，并以瓊脂糖封膠，將玻璃板置于電泳槽中以恒流方式進(jìn)行電泳，至電泳槽中溴酚藍(lán)前沿延伸至距凝膠底邊5mm處停止電泳，得到凝膠； 步驟4):將由步驟3)得到的凝膠染色，并用凝膠掃描儀透射掃描；將得到圖像用PDQUEST軟件進(jìn)行分析，圖像分析過程包括圖譜的剪切，蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測，不同凝膠間的匹配，量的歸一化以及利用內(nèi)標(biāo)2DMARKER的標(biāo)準(zhǔn)分了量和等電點(diǎn)確定膠內(nèi)蛋白點(diǎn)的相對分子量和等電點(diǎn)；以正常條件下免疫T細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜為參考膠，與環(huán)孢素A作用下培養(yǎng)的免疫T細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進(jìn)行配比，獲得環(huán)孢素A作用于免疫T細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白質(zhì)； 步驟5):將由步驟4)得到的差異表達(dá)蛋白質(zhì)經(jīng)膠內(nèi)酶切后，通過質(zhì)譜，測定差異表達(dá)蛋白質(zhì)；與質(zhì)譜庫比較，篩選出差異表達(dá)蛋白質(zhì)；明確差異蛋白后，其生物學(xué)功能確定，通過蛋白印跡驗證，即得環(huán)孢素A于免疫T細(xì)胞中藥物作用靶位。
【文檔編號】G01N27/447GK104483376SQ201410843729
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】李化會, 莫曉媚, 劉豐海, 趙龍 申請人:青島市市立醫(yī)院