豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙。該試紙包括樣品吸收區(qū)、金標(biāo)探針區(qū)、固相化抗原及抗體區(qū)和吸水區(qū)和支撐板，樣品吸收區(qū)、金標(biāo)探針區(qū)、固相化抗原抗體區(qū)和吸水區(qū)鋪設(shè)在支撐板上并依次相互部分重疊；金標(biāo)探針區(qū)包被膠體金標(biāo)記的小鼠抗豬IgM單抗；固相化抗原及抗體區(qū)上有檢測(cè)線T1、T2和對(duì)照線C，檢測(cè)線T1、T2分別包被豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和豬藍(lán)耳病毒N蛋白，對(duì)照線C包被羊抗小鼠IgG抗體。本實(shí)用新型檢測(cè)快速，準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)，攜帶、操作方便，可同時(shí)檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體，適合早期感染檢測(cè)；其常溫下即可保存，保存期達(dá)2年，且檢測(cè)重復(fù)性好。
【專利說明】豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于獸用疫病檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙。
【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原，該病主要以患畜生長(zhǎng)緩慢、進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病例損傷為特征。除了引發(fā)PMWS外，PCV2還與仔豬先天性震顫、豬皮炎腎炎綜合征、豬呼吸道綜合征、母豬繁殖障礙等疾病相關(guān)。PCV基因組由一條共價(jià)閉合環(huán)狀單股DNA構(gòu)成，包含兩個(gè)大的開放閱讀框架ORFl和0RF2，分別編碼病毒蛋白復(fù)制酶(Rep)和病毒衣殼蛋白(Cap)。Cap蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有4個(gè)抗原表位，具有較好的免疫原性和抗原性，是檢測(cè)該病毒特異性抗體的理想靶抗原。檢測(cè)PCV2的衣殼蛋白抗體可以反映PCV2的抗體水平，對(duì)豬群PCV2抗體水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可確切了解豬體免疫水平或感染狀況，制定最適免疫程序或淘汰選育，有效預(yù)防和控制PCV2的侵襲和傳播，避免因此而引起的重大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]豬藍(lán)耳病，即豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome，PRRS )是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV )引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病。該病以懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙以及仔豬呼吸困難、高死亡率和育肥豬呼吸異常為特征，也稱“豬不孕與流產(chǎn)綜合征”。PRRSV現(xiàn)已遍布于全世界主要養(yǎng)豬國(guó)家和地區(qū)，已經(jīng)成為威脅養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一。PRRSV是動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬的單股正鏈RNA病毒。其全基因組長(zhǎng)約15kb，含有9個(gè)開放閱讀框(ORFs)。其中，N蛋白也稱核衣殼蛋白，約15kD，由0RF7編碼，在病毒粒子中含量較高，N基因高度保守。N蛋白之間形成同源二聚體，對(duì)病毒的組裝至關(guān)重要，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫作用。是檢測(cè)該病毒特異性抗體的理想靶抗原。
[0004]膠體金免疫層析方法是一種很成熟的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法，以其特異性強(qiáng)、成本低，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠、可單份或成批測(cè)定、不需任何儀器等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛接受。國(guó)內(nèi)有相關(guān)圓環(huán)和藍(lán)耳的膠體金檢測(cè)試紙的研究報(bào)道，但是都限于檢測(cè)IgG抗體，不能檢測(cè)其早期感染情況。豬圓環(huán)病毒和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的檢測(cè)對(duì)相關(guān)疫苗效果的評(píng)價(jià)和動(dòng)物疫病流行病的檢測(cè)與調(diào)查具有重要意義。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0005]本實(shí)用新型的目的是為了提供一種快速、有效、同時(shí)檢測(cè)豬圓環(huán)病毒IgM抗體和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采用如下技術(shù)方案:
[0007]豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙，包括樣品吸收區(qū)、金標(biāo)探針區(qū)、固相化抗原及抗體區(qū)和吸水區(qū)和支撐板，樣品吸收區(qū)、金標(biāo)探針區(qū)、固相化抗原抗體區(qū)和吸水區(qū)鋪設(shè)在支撐板上并依次相互部分重疊；所述的金標(biāo)探針區(qū)包被有膠體金標(biāo)記的小鼠抗豬IgM單克隆抗體,標(biāo)計(jì)量?jī)?yōu)選為每mL膠體金標(biāo)記5~20Pg小鼠抗豬IgM單抗,金標(biāo)探針包被量?jī)?yōu)選為5~15μL ;所述的固相化抗原及抗體區(qū)上有檢測(cè)線Tl、檢測(cè)線Τ2和對(duì)照線C，對(duì)照線C靠近吸水區(qū)；所述的檢測(cè)線Tl和檢測(cè)線Τ2分別包被豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和豬藍(lán)耳病毒N蛋白，對(duì)照線C包被羊抗小鼠IgG純化抗體；豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和豬藍(lán)耳病毒N蛋白的包被量均優(yōu)選為0.5~5Pg，羊抗小鼠IgG純化抗體的包被量?jī)?yōu)選為I~lOgg。
[0008]所述的支撐板的材料優(yōu)選為粘有一層聚氯乙烯襯膜的聚乙烯板；所述的樣品吸收區(qū)的材料優(yōu)選為玻璃纖維膜；所述的金標(biāo)探針區(qū)的材料優(yōu)選為聚酯膜；所述的固相化抗原和抗體區(qū)的材料優(yōu)選為硝酸纖維素膜；所述的吸水區(qū)的材料優(yōu)選為吸水濾紙。
[0009]上述的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和豬藍(lán)耳病毒N蛋白均為高純度的桿狀病毒表達(dá)蛋白，可按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)制備或購買市售產(chǎn)品均可。
[0010]上述的小鼠抗豬IgM單克隆抗體可按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)制備或購買市售產(chǎn)品均可。
[0011]本實(shí)用新型采用膠體金免疫層析間接法，將膠體金標(biāo)記的小鼠抗豬IgM單克隆抗體包被在聚酯膜上，可與待檢樣品中的豬IgM抗體形成“金-二抗-抗體”復(fù)合物；將豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和豬藍(lán)耳病毒N蛋白分別包被到兩條檢測(cè)線，能分別捕獲特異的豬抗體，形成“金-二抗-抗體-抗原”復(fù)合物；羊抗小鼠IgG純化抗體包被到質(zhì)控線作對(duì)照用。對(duì)照線出現(xiàn)紅色，表明試紙有效，如果待檢樣品中含有相應(yīng)的抗體，檢測(cè)線會(huì)分別顯紅色，反之，檢測(cè)線不顯色。
[0012]本實(shí)用新型的試紙具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0013]檢測(cè)時(shí)，抽取被測(cè)者少量血清，滴在該試紙上，對(duì)比檢測(cè)線和對(duì)照線的顏色，即可判定被測(cè)者體內(nèi)是否產(chǎn)生了豬圓環(huán)病毒2型抗體和(或)豬藍(lán)耳病毒抗體。
[0014]1、檢測(cè)快速:檢測(cè)時(shí)間只需5-10分鐘，能夠滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。
[0015]2、采用金標(biāo)記小鼠抗豬IgM單克隆抗體作為捕獲探針，可快速、同時(shí)檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型IgM抗體和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體，與豬IgG無交叉。特別適合早期感染檢測(cè)，可用于相關(guān)疫苗效果的評(píng)價(jià)和動(dòng)物疫病流行病的檢測(cè)與調(diào)查。
[0016]3、檢測(cè)準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)。
[0017]4、攜帶方便，操作簡(jiǎn)便:本實(shí)用新型不需要借助其它儀器設(shè)備，適合各級(jí)獸醫(yī)院、豬場(chǎng)及個(gè)人使用。
[0018]5、檢測(cè)試紙?jiān)诔叵录纯杀４?，無需特殊的設(shè)備和儀器。保存期可達(dá)2年，且檢測(cè)重復(fù)性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本實(shí)用新型的平面結(jié)構(gòu)區(qū)域圖，其中，1-樣品吸收區(qū)，2-金標(biāo)探針區(qū)，3-固相化抗原及抗體區(qū)，31-檢測(cè)線Tl，32-檢測(cè)線T2，33-對(duì)照線C，4-吸水區(qū)。
[0020]圖2為本實(shí)用新型的縱切面結(jié)構(gòu)圖(用具體材料代表各個(gè)區(qū)域)，其中，5-粘有一層聚氯乙烯襯膜的聚乙烯板(支撐板)，6_玻璃纖維膜(樣品吸收區(qū))，7_聚酯膜(金標(biāo)探針區(qū))，8-硝酸纖維素膜(固相化抗原及抗體區(qū))，9-吸水濾紙(吸水區(qū))。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本實(shí)用新型做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本實(shí)用新型的保護(hù)范圍不限于此。
[0022]實(shí)施例1
[0023]豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙平面結(jié)構(gòu)區(qū)域圖如圖1所示，試紙水平面自下而上依次為:樣品吸收區(qū)1、金標(biāo)探針區(qū)2、固相化抗原及抗體區(qū)3和吸水區(qū)4，固相化抗原及抗體區(qū)3包被有檢測(cè)線Tl 31、檢測(cè)線T2 32和對(duì)照線C33。
[0024]豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙縱切面結(jié)構(gòu)圖(用具體材料代表各個(gè)區(qū)域)如圖2所示，粘有一層聚氯乙烯襯膜的聚乙烯板5為支撐板，玻璃纖維膜6為樣品吸收區(qū)，聚酯膜7為金標(biāo)探針區(qū)，硝酸纖維素膜8為固相化抗原及抗體區(qū)，吸水濾紙9為吸水區(qū)，聚酯膜7上包被有金標(biāo)探針；玻璃纖維膜6、聚酯膜7、硝酸纖維素膜8、吸水濾紙9鋪設(shè)在聚乙烯板5上并依次相互部分重疊。
[0025]金標(biāo)探針為膠體金標(biāo)記的小鼠抗豬IgM單克隆抗體,標(biāo)記量為每mL膠體金標(biāo)記5Pg單抗,金標(biāo)探針包被量為?ομL ;檢測(cè)線Tl 31包被的是豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白，包被量0.5μg ;檢測(cè)線Τ2 32包被的是豬藍(lán)耳病毒N蛋白，包被量0.5μg ;對(duì)照線C 33包被的是羊抗小鼠IgG純化 抗體，包被量Mg。
[0026]上述豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙制備方法如下:
[0027](I)膠體金標(biāo)記小鼠抗豬IgM單克隆抗體的方法:分別取半徑為40nm濃度為
0.01%的膠體金20mL及小鼠抗豬IgM單克隆抗體lOOPg，在pH8.5的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結(jié)合，加牛血清白蛋白(BSA)和聚乙二醇20000 (PEG20000)作為穩(wěn)定劑，且使得BSA最終質(zhì)量濃度為0.1%，PEG20000最終質(zhì)量濃度為0.01%，采用離心法除去未結(jié)合的小鼠抗豬IgM單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金一小鼠抗豬IgM單克隆抗體復(fù)合物。
[0028](2)將膠體金標(biāo)記的小鼠抗豬IgM單克隆抗體噴涂于聚酯膜上:用20mL含1%BSA的PBS (0.01M, pH 7.4)分別洗滌膠體金一小鼠抗豬IgM單克隆抗體復(fù)合物，離心除去上清液，得到深紅色沉淀，純化后的沉淀用2mL含1%BSA的PBS溶解，用噴涂設(shè)備分別涂于聚酯膜上，凍干。
[0029](3)硝酸纖維素膜的包被:在硝酸纖維素膜依次包被檢測(cè)線Tl、檢測(cè)線T2和對(duì)照線C ;檢測(cè)線Tl包被的是豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白，包被量0.5μg,檢測(cè)線T2包被的是豬藍(lán)耳病毒N蛋白，包被量0.05μg,對(duì)照線C包被的是羊抗小鼠IgG抗體，包被量lPg，每條線寬I ~3mm。
[0030](4)試紙組裝:用粘上一層聚氯乙烯襯膜的聚乙烯板作為支撐載體，上面依次鋪設(shè)玻璃纖維膜、金標(biāo)探針的聚酯膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙，外面用膠帶包封后切成2~4mm寬的試紙制成。
[0031]實(shí)施例2:[0032]除檢測(cè)線Tl包被量為5Pg ;檢測(cè)線Tl包被量為5Pg，對(duì)照線C包被量為IOPg ;金標(biāo)探針膠體金標(biāo)記小鼠抗豬IgM單克隆抗體標(biāo)記量為每mL膠體金標(biāo)記20Pg抗體及金標(biāo)探針包被量為5PL外，其余與實(shí)施例1相同。
[0033]實(shí)施例3
[0034] 除檢測(cè)線Tl包被量為2Pg ;檢測(cè)線Tl包被量為2Pg,對(duì)照線C包被量為5Pg ;金標(biāo)探針膠體金標(biāo)記小鼠抗豬IgM單克隆抗體標(biāo)記量為每mL膠體金標(biāo)記IOPg抗體及金標(biāo)探針包被量為15μL外，其余與實(shí)施例1相同。
[0035]實(shí)施例4
[0036]豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙的使用方法及結(jié)果判定:檢測(cè)時(shí)，抽取被測(cè)者少量血清樣品，用PBS (0.01Μ, pH 7.4)稀釋一倍，將該試紙的樣品吸收區(qū)一端浸入稀釋的樣品中，5~10分鐘后判讀結(jié)果:對(duì)照線C出現(xiàn)紅色，表示試紙有效；檢測(cè)線Tl出現(xiàn)紅色，表明豬圓環(huán)病毒2型IgM抗體陽性；檢測(cè)線T2出現(xiàn)紅色，表明豬藍(lán)耳病毒IgM抗體陽性；檢測(cè)線Tl和(或)T2無顏色出現(xiàn)，表明血清中豬圓環(huán)病毒2型IgM抗體和(或)豬藍(lán)耳病毒IgM抗體陰性。
[0037]上述實(shí)施例為本實(shí)用新型較佳的實(shí)施方式，但本實(shí)用新型的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本實(shí)用新型的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本實(shí)用新型的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙，其特征在于:包括樣品吸收區(qū)、金標(biāo)探針區(qū)、固相化抗原及抗體區(qū)和吸水區(qū)和支撐板，樣品吸收區(qū)、金標(biāo)探針區(qū)、固相化抗原抗體區(qū)和吸水區(qū)鋪設(shè)在支撐板上并依次相互部分重疊；所述的金標(biāo)探針區(qū)包被有膠體金標(biāo)記的小鼠抗豬IgM單克隆抗體；所述的固相化抗原及抗體區(qū)上有檢測(cè)線Tl、檢測(cè)線T2和對(duì)照線C，對(duì)照線C靠近吸水區(qū)；所述的檢測(cè)線Tl和檢測(cè)線T2分別包被豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和豬藍(lán)耳病毒N蛋白，對(duì)照線C包被羊抗小鼠IgG純化抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙，其特征在于:所述的膠體金標(biāo)記的小鼠抗豬IgM單克隆的標(biāo)計(jì)量為每mL膠體金標(biāo)記5~2(^g小鼠抗豬IgM單抗，膠體金標(biāo)記的小鼠抗豬IgM單克隆的包被量為5~15μL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙，其特征在于:所述的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和豬藍(lán)耳病毒N蛋白的包被量為0.5 ~5I^gο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙，其特征在于:所述的羊抗小鼠IgG純化抗體的包被量為I~l(^g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型和豬藍(lán)耳病毒IgM抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試紙，其特征在于:所述的支撐板的材料為粘有一層聚氯乙烯襯膜的聚乙烯板；所述的樣品吸收區(qū)的材料為 玻璃纖維膜；所述的金標(biāo)探針區(qū)的材料為聚酯膜；所述的固相化抗原和抗體區(qū)的材料為硝酸纖維素膜；所述的吸水區(qū)的材料為吸水濾紙。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK203772871SQ201420110224
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】廖園園, 漆世華, 秦偉, 朱薇, 李建, 劉潔, 謝紅玲, 溫文生, 馮釗 申請(qǐng)人:武漢中博生物股份有限公司