藍(lán)舌病病毒b-elisa抗體檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】藍(lán)舌病病毒B-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，包括盒體與盒蓋，本實(shí)用新型盒體與盒蓋采用插入式結(jié)構(gòu)相連；盒體內(nèi)設(shè)置有與盒體尺寸大小相同的海綿托，所述的海綿托上設(shè)置有12個(gè)凹孔；凹孔內(nèi)分別放置有1瓶20×濃縮洗滌液、1瓶稀釋液、1瓶包被液、1瓶終止液、1瓶底物液、1管BTV單抗、1管HRP羊抗鼠二抗、1管BTV強(qiáng)陽(yáng)性血清、1管BTV弱陽(yáng)性血清、1管BTV陰性血清、1管注射用水，1瓶BTV?VP7抗原。本實(shí)用新型將便攜性達(dá)到極致，使得藍(lán)舌病病毒B-ELISA抗體檢測(cè)可以企業(yè)化操作、規(guī)?；a(chǎn)，且具有檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、穩(wěn)定可靠的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】藍(lán)舌病病毒B-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于試劑盒結(jié)構(gòu)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及藍(lán)舌病病毒B-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]藍(lán)舌病(Bluetongue,BT)是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬藍(lán)舌病病毒(BTV)引起的經(jīng)媒介昆蟲傳播的動(dòng)物傳染病。BTV主要感染反芻動(dòng)物牛、羊，表現(xiàn)為高燒、黏膜水腫和糜爛等癥狀，致死率為20% -30%。
[0003]藍(lán)舌病最早的記錄可追溯于18世紀(jì)南非發(fā)病的綿羊。1940年前，本病報(bào)道僅限于撒哈拉以南的非洲大陸少數(shù)幾個(gè)國(guó)家。Gambles (1949)首次報(bào)道在非洲大陸以外的塞浦路斯出現(xiàn)本病流行，隨后的30年間，該病在土耳其(1944，1946，1947)、以色列(1949)、美國(guó)(1952)、伊比利亞半島(1956-1960)、葡萄牙(1956)、西班牙(1957)、巴勒斯坦、印度、中國(guó)等國(guó)均有爆發(fā)。
[0004]藍(lán)舌病病毒抗體檢測(cè)方法有中和試驗(yàn)、ELISA試驗(yàn)。其中ELISA方法由于實(shí)驗(yàn)條件要求低(不涉及病原操作、生物安全要求低)而被廣泛應(yīng)用。本實(shí)用新型專利中的B-ELISA抗體檢測(cè)方法，主要利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)的藍(lán)舌病病毒BTV VP7蛋白作為包被抗原，針對(duì)VP7蛋白的單克隆抗體及其他物質(zhì)組成而成試劑盒。試劑盒具有生產(chǎn)成本低，易于規(guī)?；a(chǎn)等特點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本實(shí)用新型的目的是提供一種簡(jiǎn)便、快速、敏感、特異的新型藍(lán)舌病病毒B-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，可廣泛應(yīng)用于羊、等各種動(dòng)物感染BTV后血清抗體的檢測(cè)和相應(yīng)的流行病學(xué)調(diào)查。
[0006]藍(lán)舌病病毒B-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，包括盒體與盒蓋，本實(shí)用新型盒體與盒蓋采用插入式結(jié)構(gòu)相連；盒體內(nèi)設(shè)置有與盒體尺寸大小相同的海綿托，所述的海綿托上設(shè)置有12個(gè)凹孔；凹孔內(nèi)分別放置有I瓶20X濃縮洗滌液、I瓶稀釋液、I瓶包被液、I瓶終止液、I瓶底物液、I管BTV單抗、I管HRP羊抗鼠二抗、I管BTV強(qiáng)陽(yáng)性血清、I管BTV弱陽(yáng)性血清、I管BTV陰性血清、I管注射用水，I瓶BTV VP7抗原。
[0007]本實(shí)用新型所述的20X濃縮洗滌液體積為60ml，瓶蓋為藍(lán)色；所述的稀釋液體積為50ml,瓶蓋為黃色；所述的包被液體積為25ml,瓶蓋為紫色；所述的終止液體積為25ml,瓶蓋為紅色；所述的底物液體積為25ml，瓶蓋為棕色；所述的BTV強(qiáng)陽(yáng)性血清和BTV弱陽(yáng)性血清體積分別為300ul，管蓋均為紅色；所述的BTV陰性血清體積為300ul，管蓋為藍(lán)色；所述的BTV單抗體積為300ul，管蓋為綠色；所述的注射用水體積為800ul，管蓋為白色；所述的HRP羊抗鼠二抗體積為300ul，管蓋為黃色。
[0008]本實(shí)用新型所述海綿托上放置有2塊酶標(biāo)板、8張封板紙以及I份說明書。
[0009]本實(shí)用新型所述的酶標(biāo)板為96孔酶標(biāo)板，該酶標(biāo)板由聚乙烯制成，酶標(biāo)板上設(shè)置有支撐架，且可單條拆卸，由12條酶標(biāo)條構(gòu)成，每條酶標(biāo)條上有8個(gè)微孔。
[0010]本實(shí)用新型的有益效果是:阻斷ELISA方法利用ELISA系統(tǒng)作為顯示系統(tǒng)檢測(cè)抗體對(duì)抗原的中和水平。ELISA系統(tǒng)有很多好處，如不需活病毒，因此不需要在2?3級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，另外阻斷ELISA法具有病毒抗體檢測(cè)快速、敏感、重復(fù)性強(qiáng)、成本低的特點(diǎn)。本實(shí)用新型將便攜性達(dá)到極致，使得藍(lán)舌病病毒B-ELISA抗體檢測(cè)可以企業(yè)化操作、規(guī)?；a(chǎn)，且具有檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、穩(wěn)定可靠的優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本實(shí)用新型盒體內(nèi)布置結(jié)構(gòu)示意圖；
[0012]圖2為酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)圖。
[0013]圖中標(biāo)號(hào)為，1:兩塊酶標(biāo)板，2:1份說明書，3:8張封板紙，4:60ml20X濃縮洗滌溶液，5:50ml稀釋液，6:25ml包被液，7:25ml終止液，8:25ml底物液，9:BTV VP7抗原，10:0.3ml BTV 強(qiáng)陽(yáng)性血清，11:0.3ml BTV 弱陽(yáng)性血清，12:0.3ml BTV 陰性血清，13:0.3mlHRP羊抗鼠二抗，14 =BTV單抗，15:0.8ml注射用水(去離子水)，16:盒體。
[0014]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本實(shí)用新型做出進(jìn)一步解釋。

【具體實(shí)施方式】
[0015]如圖1和圖2所示，藍(lán)舌病病毒B-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，包括盒體與盒蓋，本實(shí)用新型盒體與盒蓋采用插入式結(jié)構(gòu)相連；盒體內(nèi)設(shè)置有與盒體尺寸大小相同的海綿托，所述的海綿托上設(shè)置有12個(gè)凹孔；凹孔內(nèi)分別放置有I瓶20 X濃縮洗滌液、I瓶稀釋液、I瓶包被液、I瓶終止液、I瓶底物液、I管BTV單抗、I管HRP羊抗鼠二抗、I管BTV強(qiáng)陽(yáng)性血清、I管BTV弱陽(yáng)性血清、I管BTV陰性血清、I管注射用水，I瓶BTV VP7抗原。
[0016]本實(shí)用新型所述的20X濃縮洗滌液體積為60ml，瓶蓋為藍(lán)色；所述的稀釋液體積為50ml,瓶蓋為黃色；所述的包被液體積為25ml,瓶蓋為紫色；所述的終止液體積為25ml,瓶蓋為紅色；所述的底物液體積為25ml，瓶蓋為棕色；所述的BTV強(qiáng)陽(yáng)性血清和BTV弱陽(yáng)性血清體積分別為300ul，管蓋均為紅色；所述的BTV陰性血清體積為300ul，管蓋為藍(lán)色；所述的BTV單抗體積為300ul，管蓋為綠色；所述的注射用水體積為800ul，管蓋為白色；所述的HRP羊抗鼠二抗體積為300ul，管蓋為黃色。
[0017]本實(shí)用新型所述海綿托上放置有2塊酶標(biāo)板、8張封板紙以及I份說明書。
[0018]本實(shí)用新型所述的酶標(biāo)板為96孔酶標(biāo)板，該酶標(biāo)板由聚乙烯制成，酶標(biāo)板上設(shè)置有支撐架，可單條拆卸，由12條酶標(biāo)條構(gòu)成，每條酶標(biāo)條上有8個(gè)微孔。
[0019]使用本試劑盒的操作步驟如下。
[0020](I)在BTV VP7抗原凍干瓶中注入600ul注射用水，用包被液1:50稀釋后，在所需的孔中各加10ul，37。。孵育Ih ；
[0021](2)將各孔的液體棄入廢液桶。每孔加300ul的洗滌液(試劑盒內(nèi)20X濃縮洗液需用蒸餾水或去離子水稀釋后方可使用。如有結(jié)晶，需先溶解后，方可進(jìn)行稀釋)進(jìn)行洗板，重復(fù)三次。
[0022](3)在每孔中加入40ul稀釋液；然后在Al，A2孔加入1ul稀釋液；BI，B2，Cl，C2中加入1uIBTV強(qiáng)陽(yáng)性血清；D1, D2，El, E2中加入1uIBTV弱陽(yáng)性血清；F1, F2，Gl，G2中加入1ul稀釋液；H1，H2中加入1uIBTV陰性血清；待檢樣品，取1ul加入相應(yīng)的孔中，并做好記錄，37 °C孵育Ih ；
[0023](4)將BTV單抗用稀釋液1:50稀釋后，除了 Al，A2孔外，其余各孔加入50ul，在Al，A2孔中加入50ul稀釋液，37°C孵育Ih ；
[0024](5)重復(fù)步驟⑵；
[0025](6)將HRP羊抗鼠二抗用稀釋液1:100稀釋后，每孔中加入100ul，37°C孵育Ih ；
[0026](7)重復(fù)步驟⑵；
[0027](8)每孔加10ul底物液；
[0028](9) 37°C避光放置 10_15min ；
[0029](10)每孔加10ul終止液；在15min內(nèi)于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，即
0^450? 值。
[0030](11)計(jì)算各孔的S/N值，即S/N =(血清樣品OD值/BTV陰性血清孔平均OD值)X 100。結(jié)果判定當(dāng)BTV強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照(SP) S/N值小于或等于20 ;BTV弱陽(yáng)性對(duì)照(WP)S/N值在50-70之間；CC(BTV羊抗鼠二抗對(duì)照即Al，A2孔)孔S/N值小于10 ；BTV陰性血清孔(N)0D450讀數(shù)大于0.5，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。此時(shí)檢測(cè)樣品S/N值彡80時(shí)判為陰性，70 < S/N值< 80時(shí)判為可疑，需用其它方法檢測(cè)，S/N ( 70時(shí)判為陽(yáng)性。
[0031]備注:BTV VP7抗原溶解后呈乳白色或無色或有微量不溶物，不影響使用效果。溶解抗原-20°C保存，反復(fù)凍融至少30次不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；試劑盒保存方式，2°C _8°C保存。
【權(quán)利要求】
1.藍(lán)舌病病毒B-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，包括盒體與盒蓋，其特征在于，盒體與盒蓋采用插入式結(jié)構(gòu)相連；盒體內(nèi)設(shè)置有與盒體尺寸大小相同的海綿托，所述的海綿托上設(shè)置有12個(gè)凹孔；凹孔內(nèi)分別放置有I瓶20 X濃縮洗滌液、I瓶稀釋液、I瓶包被液、I瓶終止液、I瓶底物液、I管BTV單抗、I管HRP羊抗鼠二抗、I管BTV強(qiáng)陽(yáng)性血清、I管BTV弱陽(yáng)性血清、I管BTV陰性血清、I管注射用水，I瓶BTV VP7抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藍(lán)舌病病毒B-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的20 X濃縮洗滌液體積為60ml，瓶蓋為藍(lán)色；所述的稀釋液體積為50ml，瓶蓋為黃色；所述的包被液體積為25ml,瓶蓋為紫色；所述的終止液體積為25ml,瓶蓋為紅色；所述的底物液體積為25ml，瓶蓋為棕色；所述的BTV強(qiáng)陽(yáng)性血清和BTV弱陽(yáng)性血清體積分別為300ul，管蓋均為紅色；所述的BTV陰性血清體積為300ul，管蓋為藍(lán)色；所述的BTV單抗體積為300ul,管蓋為綠色；所述的注射用水體積為800ul,管蓋為白色；所述的HRP羊抗鼠二抗體積為300ul，管蓋為黃色。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藍(lán)舌病病毒B-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述海綿托上放置有2塊酶標(biāo)板、8張封板紙以及I份說明書。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藍(lán)舌病病毒B-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的酶標(biāo)板為96孔酶標(biāo)板，該酶標(biāo)板由聚乙烯制成，酶標(biāo)板上設(shè)置有支撐架，用于單條拆卸。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK203941168SQ201420380440
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】艾軍, 楊云慶, 祝賀, 楊俊興, 聶福平, 葉玲玲, 蔣宏偉, 楊素, 周曉黎, 花群義, 李應(yīng)國(guó), 董俊, 尹尚蓮 申請(qǐng)人:艾軍, 楊俊興, 聶福平