一種直接測(cè)定厭氧微生物內(nèi)氫化酶或一氧化碳脫氫酶活性的方法與裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于酶活性測(cè)定領(lǐng)域，公開一種直接測(cè)定厭氧微生物內(nèi)氫化酶或一氧化碳脫氫酶活性的方法與裝置。先向反應(yīng)體系內(nèi)連續(xù)通氣至少2min，測(cè)定氫化酶和一氧化碳脫氫酶活性時(shí)對(duì)應(yīng)的氣體分別為氫氣和一氧化碳，然后將0.5mL待測(cè)厭氧微生物的菌液注射入反應(yīng)體系內(nèi)，再連續(xù)通氣至少2min，接著于37℃條件下保持6min，反應(yīng)過程結(jié)束時(shí)冰浴終止反應(yīng)，取0.2mL反應(yīng)液測(cè)定吸光度值，經(jīng)換算即得酶活。裝置包括氣體供給裝置、酶活反應(yīng)裝置和酶標(biāo)儀。本發(fā)明步驟簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，無需對(duì)樣品進(jìn)行處理，檢測(cè)時(shí)間短，取樣量小，酶活穩(wěn)定有效，設(shè)備要求較低，避免酶活必須在厭氧操作箱內(nèi)操作，減少氮?dú)夂挠昧?，靈活性好，適用于對(duì)厭氧微生物樣品中的氫化酶和一氧化碳脫氫酶活性測(cè)定。
【專利說明】一種直接測(cè)定厭氧微生物內(nèi)氫化酶或一氧化碳脫氫酶活性 的方法與裝置

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于氫化酶或一氧化碳脫氫酶活性測(cè)定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種直接測(cè)定 厭氧微生物內(nèi)氫化酶或一氧化碳脫氫酶活性的方法與裝置。

【背景技術(shù)】
[0002] 厭氧菌是一類在無氧條件下比在有氧環(huán)境中生長(zhǎng)好的微生物，且不能直接暴露在 含氧量大于或等于18%的空氣里，對(duì)氧氣敏感，一般可分為絕對(duì)厭氧菌和兼性厭氧菌兩類。 厭氧菌屬于較為古老的原核菌進(jìn)化而來，目前不斷發(fā)現(xiàn)較多的厭氧菌特別是絕對(duì)厭氧菌具 有很大的發(fā)酵應(yīng)用和工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值，如ClostridiumcarboxidivoransP7、Clostridium strainPll、Clostridiumljungdahlii和ClostridiumautoethanogenumDSM10061 等。 此類厭氧菌能夠利用乙酰CoA/Wood-Ljungdahl代謝途徑行使生命活動(dòng)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，另 外研究證明該類菌的代謝物還可作為人類所需要的生物燃料或原料，如乙醇、丁醇和脂類 等。
[0003] 氫化酶（hydrogenase，簡(jiǎn)稱H2ase)是一類存在于微生物尤其是厭氧菌體內(nèi)的重要 生物酶，是一種催化伴有氫分子釋放或分子氫轉(zhuǎn)化質(zhì)子的氧化還原反應(yīng)酶，它通過控制微 生物體內(nèi)氫的代謝來調(diào)節(jié)細(xì)菌的其他生理活動(dòng)。

【權(quán)利要求】
1. 一種直接測(cè)定厭氧微生物內(nèi)氫化酶或一氧化碳脫氫酶活性的方法，其特征在于：先 向反應(yīng)體系內(nèi)連續(xù)通氣至少2min，測(cè)定氫化酶和一氧化碳脫氫酶活性時(shí)對(duì)應(yīng)的氣體分別為 氫氣和一氧化碳，然后將〇. 5mL待測(cè)厭氧微生物的菌液注射入反應(yīng)體系內(nèi)，再連續(xù)通氣至 少2min，接著于37°C條件下保持6min，反應(yīng)過程結(jié)束時(shí)冰浴終止反應(yīng)，取0. 2mL反應(yīng)液測(cè)定 吸光度值，經(jīng)換算即得酶活。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：測(cè)定氫化酶活性時(shí)，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)體系組成 為：0? 4mL1M、pH=7. 5 的Tris-HCl緩沖液，0? 2mL0? 04M的甲基紫精溶液，0? 2mL0? 04M 的二硫蘇糖醇溶液，〇.lmL5v%的Trit〇n-X100溶液，2mL脫氣去離子水；測(cè)定一氧化碳 脫氫酶活性時(shí)，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)體系組成為：〇. 8mL0. 5M、pH=6. 8的Tris-HCl緩沖液，0. 2mL 0. 04M的甲基紫精溶液，0. 2mL0. 04M的二硫蘇糖醇溶液，0.lmL5v%的Triton-X100溶液， 1. 2mL脫氣去離子水；以上反應(yīng)體系中，Tris-HCl緩沖液、甲基紫精溶液、二硫蘇糖醇溶液、 Trit〇n-X100溶液配制時(shí)采用的水均為脫氣去離子水。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：涉及的兩處通氣，其流速范圍均控制在 1 ~10mT,/min〇
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：采用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值，測(cè)定波 長(zhǎng)為578nm，同時(shí)以未加待測(cè)厭氧微生物的菌液的反應(yīng)體系作為對(duì)照液。
5. 如權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述待測(cè)厭氧微生物的菌液為待測(cè)厭 氧微生物的種子液或發(fā)酵液。
6. -種實(shí)現(xiàn)如權(quán)利要求1-3任一所述方法的裝置，其特征在于：該裝置包括氣體供給 裝置、酶活反應(yīng)裝置和酶標(biāo)儀；所述氣體供給裝置的結(jié)構(gòu)構(gòu)造為：包括氣體儲(chǔ)罐、帶鐵夾的 鐵架臺(tái)、多通管，多通管固定在鐵夾上，氣體儲(chǔ)罐的罐頂設(shè)有氣罐閥，氣體儲(chǔ)罐的氣體出管 上依次設(shè)有安全閥和流量調(diào)節(jié)閥，安全閥上連接有低壓表和高壓表，流量調(diào)節(jié)閥上連接有 氣體流量計(jì)，氣體出管的末端通過第一輸氣管路連接至多通管其中的一個(gè)管口，多通管的 剩余管口則分別各連接一個(gè)第二輸氣管路，第二輸氣管路又與連接導(dǎo)管連接；所述酶活反 應(yīng)裝置的結(jié)構(gòu)構(gòu)造為：包括固定座板，固定座板上設(shè)有至少一個(gè)反應(yīng)管，反應(yīng)管頂部設(shè)有密 封墊，密封墊上針頭朝下插入有進(jìn)氣針頭和出氣針頭，并且進(jìn)氣針頭插入密封墊直至反應(yīng) 管底部，出氣針頭插入密封墊直至漏出部分的長(zhǎng)度為〇. 5-2cm;氣體供給裝置和酶活反應(yīng) 裝置之間通過連接導(dǎo)管連接至進(jìn)氣針頭的尾部實(shí)現(xiàn)連接，酶標(biāo)儀則相對(duì)氣體供給裝置和酶 活反應(yīng)裝置獨(dú)立設(shè)置。
7. 如權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于：所述酶標(biāo)儀型號(hào)為MultisuanGo1510,酶 標(biāo)儀采用96孔板，每孔上樣量均為0. 2mL，掃描震動(dòng)10s。
8. 如權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于：所述反應(yīng)管為5mLEP管；所述密封墊為一 次性醫(yī)用10mL注射器橡膠活塞且凸面朝下放置；所述進(jìn)氣針頭和出氣針頭的規(guī)格型號(hào)分 別為麻醉用 〇? 5X100SB與 0? 45X16RWLB。
9. 如權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于：所述多通管為四通管，所述反應(yīng)管的數(shù)量為 三個(gè)。
10. 如權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于：所述第一輸氣管路和第二輸氣管路均為橡 膠管；所述連接導(dǎo)管由lmL無菌醫(yī)用注射器切除尾部制成。
【文檔編號(hào)】G01N33/573GK104515851SQ201510008457
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2015年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月8日
【發(fā)明者】宋安東, 張炎達(dá), 彭華, 王風(fēng)芹, 謝慧, 楊森, 任天寶 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 河南省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心