一種金納米棒生物復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種金納米棒生物復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，屬于電化學(xué)分析【技術(shù)領(lǐng)域】。采用二氧化硅修飾的金納米棒（AuNRsSiO2）作為載體結(jié)合檢測(cè)抗體（dAb）和二茂鐵甲酸（Fc）制備dAb-AuNR-Fc，并將其用于放大電化學(xué)免疫分析乳制品中大腸桿菌?；诖竽c桿菌與其抗體之間的特異性相互作用構(gòu)建“三明治”免疫分析模式，采用示差脈沖伏安法測(cè)定結(jié)合在電極表面的Fc獲得電流信號(hào)。本發(fā)明基于dAb-AuNR-Fc生物復(fù)合物的電化學(xué)免疫分析方法用于大腸桿菌的檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，為乳制品中大腸桿菌的分析研究提供了新方法。
【專利說(shuō)明】一種金納米棒生物復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)免疫分析的方法，確切說(shuō)，涉及一種利用納米復(fù)合材料建立電化學(xué)免疫傳感技術(shù)，應(yīng)用于乳制品中大腸桿菌檢測(cè)的研宄，屬于電化學(xué)分析【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0003]乳制品含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在其生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中極易受到致病性細(xì)菌的污染，從而會(huì)影響人們的生活質(zhì)量和健康水平。各種調(diào)查顯示，人類通過(guò)乳源性途徑引起的腹瀉、大面積食物中毒與乳制品中大腸桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，因此大腸桿菌已經(jīng)成為評(píng)價(jià)乳制品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，被世界各國(guó)乳制品微生物標(biāo)準(zhǔn)列為必檢項(xiàng)目。
[0004]目前，對(duì)乳制品中大腸桿菌常用的檢測(cè)方法主要包括通?X計(jì)數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法、測(cè)試片計(jì)數(shù)法等。這些方法雖然在大腸桿菌檢測(cè)中發(fā)揮了很大作用，但存在著耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、操作繁瑣等缺點(diǎn)，在一定程度上已經(jīng)不能滿足乳制品生產(chǎn)廠家、監(jiān)督管理等部門(mén)快速檢測(cè)的需求。比如，腿^計(jì)數(shù)每種樣品都需要經(jīng)過(guò)系列稀釋、初發(fā)酵、平板分離和復(fù)發(fā)酵，通常需要3 - 5天時(shí)間才能得到檢驗(yàn)結(jié)果，一些乳制品企業(yè)常因此造成產(chǎn)品庫(kù)存堆積，極大地限制了產(chǎn)品的上市時(shí)間；并且，該方法存在較多影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的干擾因素，如操作人員分離單個(gè)菌落的技術(shù)水平、單個(gè)菌落的挑選以及革蘭氏染色技術(shù)等，其技術(shù)特點(diǎn)決定了該方法有時(shí)還會(huì)低估樣品中大腸桿菌的數(shù)目甚至造成漏檢。而且，乳制品成分十分復(fù)雜，其它微生物也會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果引起假陽(yáng)性誤差。因此，建立乳制品中大腸桿菌的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)提高乳制品質(zhì)量、促進(jìn)乳制品行業(yè)發(fā)展、保國(guó)安民都具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為了滿足生物技術(shù)發(fā)展和乳制品質(zhì)量安全檢測(cè)的需求，提出利用納米復(fù)合材料建立電化學(xué)免疫分析方法，應(yīng)用于乳制品中大腸桿菌檢測(cè)的研宄。
[0006]為實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明的目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:利用二氧化硅修飾的金納米棒(八11殿8@3102 )作為載體結(jié)合檢測(cè)抗體()和二茂鐵甲酸()制備金納米棒生物復(fù)合物(/6-八。采用“三明治”免疫分析模式構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器，并將其應(yīng)用于乳制品中大腸桿菌的檢測(cè)研宄。
[0007]一種/6-八的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行:
(1 ?^1？8@8102的制備:首先，根據(jù)經(jīng)典的種子法制備十六烷基三甲基溴化銨(0X^8)包被的金納米棒(八11殿。其次，制備八11殿8@3102:將10此^11^-01^8于9000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，加入10 超純水重懸，反復(fù)2次。在攪拌條件下，向10此如殿水溶液中加入100虬氫氧化鈉(0.10 11101/1),然后加入60虬正硅酸乙酯/3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液(體積比:1:1:5),繼續(xù)攪拌24小時(shí)后收集，即得到如殿8@3102，然后將其用超純水洗滌并分散于5.0此磷酸緩沖溶液083)中，待用；
(2)/卜八11殿的建立:取1.0 1111八11殿8@3102溶液，在攪拌條件下，加入1.0 11111-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽/}羥基琥珀酰亞胺(￡0(:/順3，摩爾比:4:1)反應(yīng)10分鐘，然后依次加入10虬檢測(cè)抗體(/10 (4.0呢/此)、1.0 0[二茂鐵甲酸(?)飽和水溶液，繼續(xù)攪拌2小時(shí)即制得/卜八11殿將其用超純水洗滌并分散于1.0 1111 ？88中保存于4。冰箱。
[0008]生物復(fù)合物檢測(cè)乳制品中大腸桿菌的方法，按照下述步驟進(jìn)行:
(1)基于抗體的免疫傳感器的制備:金電極(0=3皿)修飾前需進(jìn)行預(yù)處理，方法是:先依次用0.3她、0.05她的八1203粉末在金相砂紙上打磨拋光，再依次用乙醇、水超聲清洗，最后置于0.50 11101/1硫酸溶液中在-0.3 ~ 1.5 V電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖。把預(yù)處理過(guò)的金電極浸入0.02 11101/1半胱氨酸的乙酸緩沖溶液(邱5.0)中自組裝6小時(shí)。取出電極用水清洗后，置于0.40 11101/1200-0.10 001/1順3的溶液中反應(yīng)1小時(shí)用于活化電極末端的羧基，然后用？83清洗電極表面并用氮?dú)獯蹈?。?0 1x1捕獲抗體溶液(1.0呢/此)滴涂在金電極表面并在37。0下培養(yǎng)1小時(shí)后，用？83清洗電極以除去未結(jié)合的抗體并晾干。在電極表面滴加1.0%牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液并培養(yǎng)30 111111以封閉活性位點(diǎn)制備免疫傳感器。
[0009](2)電化學(xué)檢測(cè):將制備的免疫傳感器清洗并吹干后，將其放入一定濃度的大腸桿菌溶液中，在35 7下培養(yǎng)50 1111110用？83清洗電極后，將10 /卜八涂于電極表面并培養(yǎng)50 111111構(gòu)建“三明治”免疫分析模式。然后，用水清洗電極并將其浸入5.0 1111含0.10 11101/1 %104的？83中并采用示差脈沖伏安法測(cè)定固定在電極表面的1?，掃描電位從0 ~ 0.70 V?；??產(chǎn)生的電流信號(hào)與大腸桿菌濃度之間的關(guān)系實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。
[0010]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述如殿8@3102是由310 2修飾八11殿8構(gòu)建的核-殼結(jié)構(gòu)，能夠提供一種解決十六烷基三甲基溴化銨的毒性和難于生物修飾問(wèn)題的有效方法。
[0011]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，如殿8@3102能夠固載大量放大電流信號(hào)從而提高大腸桿菌檢測(cè)的靈敏度。
[0012]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述電化學(xué)傳感技術(shù)采用“三明治”免疫分析模式用于大腸桿菌的檢測(cè)具有良好的特異性，從而在很大程度上能夠降低乳制品中其它微生物干擾檢測(cè)結(jié)果引起的假陽(yáng)性誤差。
[0013]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述電化學(xué)免疫傳感技術(shù)用于乳制品中大腸桿菌的檢測(cè)具有可靠性好、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，能夠滿足乳制品中大腸桿菌快速檢測(cè)的分析研宄。
[0015]

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1是基于/6-八生物復(fù)合物的電化學(xué)免疫分析方法用于大腸桿菌檢測(cè)的示意圖。
[0017]圖2是如殿8修飾3102前后的透射電鏡圖。
[0018]圖3是基于/6-八生物復(fù)合物的電化學(xué)免疫分析方法用于乳制品中大腸桿菌檢測(cè)的響應(yīng)電流圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019]圖1展示了符合本發(fā)明的電化學(xué)免疫分析方法用于乳制品中大腸桿菌檢測(cè)的技術(shù)方案。本實(shí)例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程。
[0020]實(shí)施例1制備生物復(fù)合物:
第一步:首先，根據(jù)經(jīng)典的種子法制備十六烷基三甲基溴化銨包被的金納米棒(八11殿-(^仙)。其次，制備八11殿8@3102:將10 1111八11殿-?:1八8于9000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，加入10 超純水重懸，反復(fù)2次。在攪拌條件下，向10 如殿水溶液中加入100虬氫氧化鈉(0.10 11101/1),然后加入60虬正硅酸乙酯/3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液(體積比:1:1:5),繼續(xù)攪拌24小時(shí)后收集，即得到如殿8@3102，然后將其用超純水洗滌并分散于5.0 1111 ？88中，待用；
第二步:^1.0 1111如殿8@3102溶液，在攪拌條件下，加入1.0此￡0(:/順3溶液(摩爾比:4:1)反應(yīng)10分鐘，然后依次加入10虬(4.00此飽和水溶液，繼續(xù)攪拌2小時(shí)即制得將其用超純水洗滌并分散于1.0 1111 ？88中保存于4。0冰箱。
[0021]圖2為如殿8修飾3102前后的透射電鏡圖。圖2八顯示了如殿8呈棒狀結(jié)構(gòu)，形貌大小比較均一，長(zhǎng)徑約40 11111，短徑約10 11111。圖28是通過(guò)氨水催化水解正硅酸乙酯在八11殿8表面修飾3102，顯示了如殿8外包覆有3102殼層，該核-殼結(jié)構(gòu)能夠有效解決十六烷基三甲基溴化銨的毒性和難于生物修飾的問(wèn)題。
[0022]實(shí)施例2基于生物復(fù)合物構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器用于乳制品中大腸桿菌的檢測(cè)
以半胱氨酸修飾金電極為工作電極，采用0.40 001/1 ￡00-0.10 11101/1順3活化半胱氨酸末端的羧基，進(jìn)而結(jié)合捕獲抗體制備免疫傳感器?；诳贵w與大腸桿菌之間的特異性相互作用，免疫結(jié)合大腸桿菌，進(jìn)而吸附/6-八11.-1?生物復(fù)合物構(gòu)建“三明治”免疫分析模式。以修飾的金電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為輔助電極，用示差脈沖伏安法測(cè)定電極表面的獲得電流信號(hào)，掃描電位為0 ~ 0.70 V。隨著待測(cè)溶液中大腸桿菌濃度的增大，固定在電極表面的/6-八生物復(fù)合物就越多，因此產(chǎn)生的電流信號(hào)就越強(qiáng)?；诮锂a(chǎn)生的電流信號(hào)與大腸桿菌濃度之間的關(guān)系實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。
[0023]圖3是基于/6-八生物復(fù)合物的電化學(xué)免疫分析方法用于乳制品中大腸桿菌檢測(cè)的響應(yīng)電流圖。1?產(chǎn)生的響應(yīng)電流與大腸桿菌濃度的對(duì)數(shù)在一定濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(插圖
[0024]綜上所述，以上僅為本發(fā)明的一例而已，可以就不同的待測(cè)乳制品微生物而設(shè)計(jì)相應(yīng)的電化學(xué)免疫分析方法，凡是依本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)及發(fā)明說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效修改，皆屬于本發(fā)明專利涵蓋的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種dAb-AuNR-Fc的制備方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行: (I )AuNRsiSi02的制備:首先，根據(jù)經(jīng)典的種子法制備十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)包被的金納米棒(AuNR-CTAB)； 其次，制備AuNRslgS12^f 10 mL AuNR-CTAB于9000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，加入10 mL超純水重懸，反復(fù)2次； 在攪拌條件下，向10 mL AuNR-CTAB水溶液中加入100 μ?氫氧化鈉(0.10 mol/L)，然后加入60 PL正硅酸乙酯/3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，繼續(xù)攪拌24小時(shí)后收集，即得到AuNRslgS12，然后將其用超純水洗滌并分散于5.0 mL磷酸緩沖溶液(PBS)中，待用； (2),Ab-AuNR-Fc的建立:取1.0 mL AuNRslgS12溶液，在攪拌條件下，加入1.0 mL1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽/N-羥基琥珀酰亞胺混合溶液反應(yīng)10分鐘，然后依次加入10 μ?檢測(cè)抗體(dAb) (4.0 mg/mL)、1.0 mL 二茂鐵甲酸(Fe)飽和水溶液，繼續(xù)攪拌2小時(shí)即制得dAb-AuNR-Fc ； 將其用超純水洗滌并分散于1.0 mL PBS中保存于4 ° C冰箱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種dAb-AuNR-Fc的制備方法，其特征在于正硅酸乙酯/3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液體積比:1: 1: 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種dAb-AuNR-Fc的制備方法，其特征在于1_(3_二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為4:1。
4.權(quán)利要求1所述的dAb-AuNR-Fc生物復(fù)合物檢測(cè)乳制品中大腸桿菌的方法，按照下述步驟進(jìn)行: (1)基于抗體的免疫傳感器的制備:金電極修飾前需進(jìn)行預(yù)處理，方法是:先依次用0.3 Mm,0.05 Mm的Al2O3粉末在金相砂紙上打磨拋光，再依次用乙醇、水超聲清洗，最后置于0.50 mol/L硫酸溶液中在-0.3 ~ 1.5 V電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖； 把預(yù)處理過(guò)的金電極浸入0.02 mol/L半胱氨酸的乙酸緩沖溶液(pH 5.0)中自組裝6h ； 取出電極用水清洗后，置于0.40 mo I/LEDC-0.10 mol/L NHS的溶液中反應(yīng)I小時(shí)用于活化電極末端的羧基，然后用PBS清洗電極表面并用氮?dú)獯蹈桑? 將10 μ L捕獲抗體溶液(1.0 mg/mL)滴涂在金電極表面并在37。C下培養(yǎng)I h后，用PBS清洗電極以除去未結(jié)合的抗體并晾干； 在電極表面滴加1.0%牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液并培養(yǎng)30 min以封閉活性位點(diǎn)制備免疫傳感器； (2)電化學(xué)檢測(cè):將制備的免疫傳感器清洗并吹干后，將其放入一定濃度的大腸桿菌溶液中，在35 °C下培養(yǎng)50 min ； 用PBS清洗電極后，將10 uL dAb-AuNR-Fc涂于電極表面并培養(yǎng)50 min構(gòu)建“三明治”免疫分析模式； 然后，用水清洗電極并將其浸入5.0 mL含0.10 mol/L此104的PBS中并采用示差脈沖伏安法測(cè)定固定在電極表面的Fe，掃描電位從O ~ 0.70 V; 基于Fe產(chǎn)生的電流信號(hào)與大腸桿菌濃度之間的關(guān)系實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的dAb-AuNR-Fc生物復(fù)合物檢測(cè)乳制品中大腸桿菌的方法，其特征在于金電極Φ=3 mm。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104493160SQ201510012686
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2015年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月9日
【發(fā)明者】魯文杰, 張新愛(ài), 申建忠, 蔣玉香 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)